盧宇暢,王振宜,楊豪杰,韓昌鵬,周海倫,李 盈,崔 燦,秦凱健,蔣嘉奇,尹相宜,干 丹

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437)

潰瘍性結(jié)腸炎是長(zhǎng)期慢性炎癥性疾病,與遺傳易感性、腸內(nèi)微生物群落、環(huán)境、免疫反應(yīng)等因素有關(guān)[1-4]。膽汁酸是微生物群衍生代謝物之一,其受體作為有效的信號(hào)分子在潰瘍性結(jié)腸炎中發(fā)揮多種作用[5]。近年來(lái),膽汁酸代謝對(duì)機(jī)體腸道免疫與代謝的調(diào)節(jié)作用被不斷挖掘,因此研究膽汁酸代謝與潰瘍性結(jié)腸炎之間的關(guān)系,有望為潰瘍性結(jié)腸炎的臨床診療提供思路。從中醫(yī)角度分析,潰瘍性結(jié)腸炎病程纏綿,常常反復(fù)發(fā)作,容易傷氣耗血,日久不愈必然有“瘀”和“虛”的存在。祛瘀生新方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肛腸科使用多年治療輕中度潰瘍性結(jié)腸炎的驗(yàn)方,主要功效是健脾化濕、祛瘀生新,以健脾化濕中藥為君,輔以清熱解毒、活血化瘀的中藥,課題組前期臨床研究證實(shí)該方治療輕中度潰瘍性結(jié)腸炎效果滿意[6-8]。在前期研究基礎(chǔ)之上,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了祛瘀生新方對(duì)輕中度潰瘍性結(jié)腸炎小鼠糞便膽汁酸代謝的影響,探討祛瘀生新方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J雌性小鼠22只,SPF級(jí),8～10周齡,體重(20±2)g,購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(滬)2018-0040。每籠5只飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,喂食標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),自由攝食和飲用滅菌水。實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2023-102)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 祛瘀生新方組成:生黃芪45 g、太子參30 g、雞眼草20 g、地錦草20 g、川芎15 g、白術(shù)15 g、桃仁15 g、生地黃15 g,藥物顆粒劑購(gòu)于江蘇江陰天江醫(yī)藥公司,保證批次相同,出廠均符合《中國(guó)藥典》 成分與質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。參照小鼠和人之間的劑量折算系數(shù)表,按小鼠體重20 g、人體重60 kg計(jì)算出小鼠每天藥物劑量,將所有原方1劑的單味中藥顆粒劑拆包混合,使用無(wú)菌蒸餾水溶解備用。 美沙拉嗪腸溶片(莎爾福,LosanPharmaGmbH,注冊(cè)證號(hào)H20171358,規(guī)格:0.5 g/片),按照成人急性活動(dòng)期用量換算小鼠的給藥量為390 mg/kg,用時(shí)將腸溶片捻末加入無(wú)菌蒸餾水制成10%懸濁液。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 小鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)取5只作為空白組,給予蒸餾水自由飲用;剩余小鼠給予4%葡聚糖硫酸鈉溶液(將4 g葡聚糖硫酸鈉溶解于100 mL蒸餾水制成)自由飲用,每2 d更換1次,連續(xù)飲用4 d后改為無(wú)菌水繼續(xù)自由飲用2 d,共14 d, 取小鼠結(jié)腸組織,病理觀察見(jiàn)腸黏膜上皮碎裂、脫落,腸黏膜充血水腫,固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)則提示潰瘍性結(jié)腸炎造模成功。將造模成功小鼠隨機(jī)分為模型組、祛瘀生新方組、美沙拉秦組,每組5只。祛瘀生新方組與美沙拉秦組分別予相應(yīng)藥物灌胃,空白組和模型組給予蒸餾水灌胃,均0.15 mL/次,1次/d,連續(xù)14 d。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1小鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)各組小鼠的體重,觀察小鼠外觀、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、進(jìn)食飲水、糞便等情況。

1.4.2小鼠糞便膽汁酸代謝譜 末次灌胃后第2天,收集小鼠新鮮糞便,冷凍干燥后研磨,取20 mg,加入50%乙腈380 μL進(jìn)行渦旋震蕩5 min,4 ℃下12 000×g離心10 min。吸取上清40 μL,加入80 μL含同位素內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液,再次渦旋震蕩5 min,4 ℃下12 000×g離心10 min,吸取上清液。參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行檢測(cè),采用BDS Hypersil C18(50 mm×2.1 mm,2.4 μm)色譜柱,流動(dòng)相為乙腈和1 mmol/L的甲酸銨水溶液,采用梯度洗脫方式進(jìn)行,流速為0．30 mL/min,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量2 μL。采用負(fù)離子檢測(cè),電子能量70 eV,ESI源溫度255 ℃,色譜質(zhì)譜接口溫度300 ℃,碰撞氣氬氣壓力1.5 mTorr(1 mTorr=0.133 Pa)。

1.4.3小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài) 各組小鼠取新鮮糞便后處死,取結(jié)腸組織,制備石蠟切片,常規(guī)HE染色后鏡下觀察。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行組間差異單因素方差分析,組間兩兩比較采用Tukey多重比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠一般情況 各組小鼠均存活,其中空白組小鼠活動(dòng)自如,毛發(fā)光亮、飲食正常及排便成形,無(wú)明顯便血;模型組小鼠精神萎靡,體重減輕,毛發(fā)減少,便血,解稀便;祛瘀生新方組及美沙拉嗪組小鼠灌胃結(jié)束時(shí)活動(dòng)靈敏,毛發(fā)、飲食及排便無(wú)明顯異常,與空白組類似。

2.2各組小鼠糞便膽汁酸代謝情況 4組小鼠糞便中共檢測(cè)出20種膽汁酸,其中熊脫氧膽酸(UDCA)、熊果膽酸(UCA)、豬膽酸(HCA)、脫氧膽酸(DCA)、豬去氧膽酸(HDCA)含量較高。與空白組比較,模型組中UDCA、石膽酸(LCA)、?；?α-鼠膽酸(T-α-MCA)、?；秦i膽酸(THCA)、甘氨豬膽酸(GHCA)、UCA、α-鼠膽酸(α-MCA)、HCA、DCA、牛磺鵝脫氧膽酸(TCDCA)、牛磺脫氧膽酸(TDCA)、 甘氨豬脫氧膽酸(GHDCA)、HDCA、甘氨石膽酸(GLCA)、?；悄懰?TCA)、膽酸(CA)含量均明顯降低(P均<0.05) ,鵝脫氧膽酸(CDCA)、β-鼠膽酸(β-MCA)、甘氨膽酸(GCA)、脫氫膽酸(dehydro-CA)含量均明顯升高(P均<0.05) 。與模型組比較,祛瘀生新方組和美沙拉嗪組UDCA、LCA、T-α-MCA、THCA、GHCA、UCA、α-MCA、HCA、DCA、TCDCA、TDCA、GHDCA、HDCA、GLCA、TCA、CA含量均明顯升高(P均<0.05),CDCA、β-MCA、GCA、dehydro-CA含量均明顯降低(P均<0.05) ,美沙拉嗪組與祛瘀生新方組各膽汁酸含量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 空白組和輕中度潰瘍性結(jié)腸炎各組小鼠糞便中差異表達(dá)膽汁酸絕對(duì)定量

2.3各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài) HE染色顯示, 空白組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)正常,無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn);模型組小鼠結(jié)腸組織中有大量炎性細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);祛瘀生新方組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織中腺體細(xì)胞排列不規(guī)則,存在少許炎性細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),此2組表現(xiàn)差異不明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 空白組和輕中度潰瘍性結(jié)腸炎各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色)

3 討 論

中醫(yī)學(xué)根據(jù)潰瘍性結(jié)腸炎的臨床表現(xiàn),將其歸于“久痢、休息痢、腸澼、腸風(fēng)、大瘕泄、滯下、泄瀉”范疇。該病主要由虛致瘀,瘀血內(nèi)阻,影響脾胃運(yùn)化,氣虛更甚,終致病情遷延難愈。根據(jù)潰瘍性結(jié)腸炎的基本病機(jī),治宜補(bǔ)虛祛瘀生肌[6]。祛瘀生新方中黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、托毒生肌,可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能;雞眼草清熱解毒、利濕止瀉;地錦草清熱化濕、解毒止痢;白術(shù)益氣健脾、燥濕泄?jié)?太子參益氣健脾養(yǎng)胃,桃仁活血化瘀、消散內(nèi)癰、潤(rùn)腸通便,與白術(shù)、黃芪等甘溫之品同用,不會(huì)加重患者的便血和腹瀉癥狀;生地黃清熱涼血,兼止血;川芎活血行氣,可散血中之郁結(jié)。全方具有補(bǔ)虛祛瘀、生肌之效。

膽固醇在肝臟中代謝為初級(jí)膽汁酸,初級(jí)形態(tài)的膽汁酸流入腸道后被腸內(nèi)細(xì)菌群進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸,這些次級(jí)膽汁酸參與體內(nèi)的腸肝循環(huán)過(guò)程,并通過(guò)腸肝循環(huán)在體內(nèi)維持穩(wěn)態(tài)[9]。膽汁酸可以通過(guò)激活不同的膽汁酸受體如VDR、FXR、TGR5等來(lái)調(diào)節(jié)信號(hào)通路,影響宿主的代謝和免疫功能[10-13];另外膽汁酸可以調(diào)節(jié)微生物群落,腸道微生態(tài)失調(diào)和膽汁酸紊亂會(huì)損害腸道屏障和免疫力,而腸道微生物群紊亂或腸道微生物群-宿主相互作用失調(diào)可導(dǎo)致膽汁酸信號(hào)傳導(dǎo)中斷,引起代謝紊亂性疾病的發(fā)病和進(jìn)展[14-15]。因此,膽汁酸代謝異?？赡転樵斐蓾冃越Y(jié)腸炎免疫系統(tǒng)反應(yīng)紊亂的關(guān)鍵因素之一。

本研究模型組小鼠經(jīng)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯糞便膽汁酸代謝異常,給予祛瘀生新方灌胃后,小鼠腹瀉等癥狀減輕,糞便膽汁酸代謝譜趨于正常。提示祛瘀生新方可調(diào)節(jié)輕中度潰瘍性結(jié)腸炎小鼠膽汁酸代謝保持平衡,修復(fù)腸壁細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及其功能,減輕癥狀。但目前缺乏關(guān)于膽汁酸代謝的臨床大樣本研究,且膽汁酸代謝是否與腸道菌群相互影響尚不明確,未來(lái)本團(tuán)隊(duì)將深入研究與潰瘍性結(jié)腸炎病情相關(guān)的特定膽汁酸代謝標(biāo)記物,從而為祛瘀生新的中藥療法治療潰瘍性結(jié)腸炎提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。