張宇菲, 羅紅, 肖紅, 陶玲, 沈祥春*, 常楚瑞*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省特色天然藥物資源高效利用工程中心, 貴州 貴陽(yáng) 550025)

心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF)是糖尿病心肌病(diabetes cardiomyopathy,DCM)的一個(gè)重要特征,是糖尿病患者心臟的特異性病理性改變,導(dǎo)致患者心功能下降和心律失常等心血管意外事件[1]。也是指當(dāng)受到病理?xiàng)l件的刺激時(shí),心臟組織中的心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts,CFBs)異常增殖,從而促進(jìn)CFBs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(fibroblast-to-myofibroblast transformation,FMT)[2]。FMT是一種細(xì)胞分化和再生的復(fù)雜病理生理學(xué)過(guò)程,具體而言,糖尿病人體內(nèi)的高糖(high glucose,HG)等環(huán)境,誘導(dǎo)CFBs的激活和分化,主要是表達(dá)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物、間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)物Ⅰ型與Ⅲ型膠原[3],產(chǎn)生過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白從而獲得肌成纖維細(xì)胞表型[4]。引起ECM的過(guò)度沉積、合成和代謝比例失調(diào),膠原蛋白含量顯著增加[5],從而導(dǎo)致糖尿病患者的心室壁發(fā)生硬化,心肌的收縮功能下降,引起心臟供血不足,導(dǎo)致心室的順應(yīng)性減退,嚴(yán)重時(shí)甚至造成心衰[6]。因此,尋找能夠有效抑制CFBs增殖、遷移、膠原沉積和促纖維化細(xì)胞因子表達(dá)的新型潛在藥物,對(duì)于預(yù)防MF的發(fā)生發(fā)展非常重要,對(duì)加強(qiáng)心血管疾病的治療,降低心血管疾病的病死率,提高心血管疾病患者的生活質(zhì)量也具有重要的意義。氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)又名苦參素,是從豆科屬植物苦參中分離出來(lái)的生物堿,具有抗腫瘤、抗炎、抗纖維化、心臟保護(hù)、改善心力衰竭的作用[7-11],此外,它還保護(hù)人體組織和器官,如肝臟、腸道及心臟等[12-13]。本課題組前期從動(dòng)物、細(xì)胞、分子水平實(shí)驗(yàn)分別探討了OMT的抗MF作用及相關(guān)機(jī)制,結(jié)果表明OMT可減少心肌細(xì)胞肥大和凋亡,抑制CFBs增殖與轉(zhuǎn)分化,并可減少M(fèi)F的發(fā)生[14-15]?；诖?本研究在CFBs增殖模型基礎(chǔ)上,觀察OMT對(duì)HG誘導(dǎo)CFBs轉(zhuǎn)分化的影響及其是否可能通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)信號(hào)對(duì)HG誘導(dǎo)的CFBs轉(zhuǎn)分化產(chǎn)生抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物來(lái)源 日齡1～2 d的健康Sprague-Dawley(SD)乳鼠20只,7～10 g,雌雄不限,由學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(湘)2019-0014]。本研究已獲學(xué)校動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2000132),且遵守了動(dòng)物倫理學(xué)的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2主要試劑 OMT(南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司,20080210),D-葡萄糖(1102A0939)、D-甘露醇(1123F038)、噻唑藍(lán)(117X0516)、蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(G1121)、天狼星紅苦味酸染色試劑盒(G1472)及蛋白定量(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒(PC0020,北京Solarbio公司),Lificiguat(YC-1;170623-47-0,美國(guó)MCE公司),細(xì)胞培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM;1717154,美國(guó)Gibco公司),羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)試劑盒(A0310-1-1,中國(guó)南京建成生物工程研究所),HIF-1α(20960-1-AP)、VEGFA(19003-1-AP)、Vimentin(12789-1AP)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle Actin,α-SMA;14395-1-AP)、Ⅰ型膠原(Collagen Ⅰ,14695-1-AP)、Ⅲ型膠原(Collagen Ⅲ,22734-1-AP)及纖粘蛋白(fibronectin,FN;15613-1-AP,中國(guó)武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF;MD5912-50,北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(美國(guó)Bioworld Technology公司,AB2243)。

1.1.3主要儀器 倒置顯微鏡XDS-2B型(日本尼康公司);酶標(biāo)儀VARIOSKANLUX型(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司);5810R型冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);SW-CJ-2F型單人操作凈化臺(tái)(中國(guó)蘇州凈化設(shè)備有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱HF240型(中國(guó)上海力申科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1原代CFBs的分離與培養(yǎng) 取SD乳鼠20只,參考文獻(xiàn)[16]方法取心尖部份,置于4 ℃預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)培養(yǎng)皿中清洗;眼科剪剪成約1 mm3組織塊,PBS清洗,加胰酶于4 ℃過(guò)夜;次日棄上清液,加胰酶消化液,膠頭滴管吹散組織,加含血清的培養(yǎng)基,1 000 r/ min離心5 min,棄上清,加含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基,混勻接種于培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)箱中貼壁60～90 min,棄培養(yǎng)基,加含胎牛血清的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2噻唑藍(lán)比色法[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力及OMT保護(hù)濃度的確定 取“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CFBs細(xì)胞,按50個(gè)/L密度接種培養(yǎng),分為空白(Control)組、40 mmol/L甘露醇(Mannitol)組、不同濃度(30、35、40、45及50 mmol/L)HG組及不同濃度(25、50、100、200及400 mg/L)OMT組,每組6個(gè)復(fù)孔,各組按上述藥物處理24 h,加5 g/L MTT,20 μL/孔,37 ℃孵育4 h,吸取上清液,加二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μL,酶標(biāo)儀于490 nm檢測(cè)吸光度;根據(jù)濃度效應(yīng)的結(jié)果,選取最佳濃度HG分別作用于24和48 h,計(jì)算細(xì)胞存活率并確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)OMT的保護(hù)濃度。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3細(xì)胞分組及HE染色觀察細(xì)胞形態(tài) 取“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CFBs細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%左右,結(jié)合“1.2.2”項(xiàng)下OMT的保護(hù)濃度結(jié)果,分為空白(Control)組、40 mmol/L甘露醇(Mannitol)組、40 mmol/L HG(HG)組、40 mmol/L HG+50 mg/L OMT(OMT低劑量)組、40 mmol/L HG+100 mg/L OMT(OMT中劑量)組及40 mmol/LHG+200 mg/L OMT(OMT高劑量)組,各組按上述處理結(jié)束后,棄培養(yǎng)基,PBS洗3次;加 4%多聚甲醛1 mL固定15 min,棄固定液,PBS洗3次;0.5%TritonX×100破膜20 min,PBS洗3次;蘇木素染色15 min,自來(lái)水洗掉多余染液;分化液分化5 s,自來(lái)水洗滌;返藍(lán)液返藍(lán)1 min,自來(lái)水洗洗滌;伊紅染液染色1 min,于顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.4天狼星紅染色法觀察細(xì)胞的膠原纖維表達(dá) 取“1.2.3”項(xiàng)下蘇木素染色前的各組CFBs細(xì)胞,天狼星紅染液染1 h,自來(lái)水洗滌;蘇木素染液染5 min,于顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的纖維表達(dá)情況。

1.2.5Hyp試劑盒法檢測(cè)細(xì)胞中Hyp的分泌情況 取“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CFBs細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%左右,按“1.2.3”分組給藥,24 h后吸取培養(yǎng)液上清500 μL,檢測(cè)各組細(xì)胞中Hyp的分泌。

1.2.6免疫熒光染色法檢測(cè)α-SMA的表達(dá) 取“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CFBs細(xì)胞接種于12孔板,待細(xì)胞生長(zhǎng)到70%左右時(shí),按照分組進(jìn)行24 h的給藥處理。4%多聚甲醛固定,0.5%TritionX×100固定;5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉60 min,加一抗(α-SMA∶一抗稀釋液=1∶500),4 ℃下孵育過(guò)夜;次日加熒光二抗[異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer,FITC)∶5% BSA=1∶500]孵育60 min;DAPI(DAPI∶PBS=1∶1 000)染核5 min;顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CFBs的周期分布比例 取“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CFBs細(xì)胞,以1×105的密度接種培養(yǎng),根據(jù)“1.2.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)分組給藥,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液,胰蛋白酶消化細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,沉淀細(xì)胞;棄上清,PBS 1 mL潤(rùn)洗細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min收集;將細(xì)胞沉淀與70%乙醇混勻,4 ℃過(guò)夜;次日,取沉淀細(xì)胞1 000 r/min離心5 min,PBS重新懸浮細(xì)胞;1000 r/min離心5 min,獲得細(xì)胞沉淀;每份細(xì)胞樣品中加混合液[染料緩沖液0.5 mL、碘化丙啶儲(chǔ)液10 μL及核糖核酸酶A(ribonuclease A from bovine pancreas,RNAse A)溶液10 μL混合均勻]0.5 mL,37 ℃避光孵育30 min;最后用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.8Western blot檢測(cè)α-SMA、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、FN、VEGFA及HIF-1α蛋白的表達(dá) 取“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CFBs細(xì)胞,按“1.2.3”分組給藥,加radio immunoprecipitation assay(RIPA)裂解液和苯甲磺酰氟(benzylsulfonyl fluoride,PMSF)按比例(RIPA∶PMSF=99∶1)裂解細(xì)胞,按說(shuō)明書步驟提取蛋白,定量分裝蛋白,電泳操作,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜90 min,5%BSA封閉液封閉90 min,加一抗α-SMA(1∶400)、CTGF(1∶1 000)、Collagen Ⅰ(1∶2 000)、Collagen Ⅲ(1∶1 000)、FN(1∶1 000)、VEGFA(1∶2 000)、HIF-1α(1∶5 000)及GAPDH(1∶10 000),置搖床上30 min,4 ℃孵育過(guò)夜;次日加二抗(1∶10 000)孵育2 h;避光,采用Bio-Rad蛋白質(zhì)印跡成像系統(tǒng)顯影,采集相應(yīng)的蛋白圖像,ImageLab軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖活性及OMT保護(hù)濃度的確定

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1),不同濃度的HG作用24 h后對(duì)細(xì)胞的增殖作用較48 h明顯,并呈劑量依賴性,其中40 mmol/L的HG濃度下細(xì)胞增殖率達(dá)116.20%(P<0.05);給予不同濃度OMT能夠不同程度抑制HG誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖,HG組CFBs存活率較Control組升高(P<0.05);與HG組相比,當(dāng)OMT濃度<25 mg/L及>400 mg/L時(shí),細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響(P>0.05);當(dāng)OMT濃度分別為50 mg/L、100 mg/L及200 mg/L時(shí),細(xì)胞存活率不同程度的下降(P<0.05);與Control組相比,Mannitol組無(wú)明顯差異(P>0.05)。因此將50、100 及200 mg/L OMT分別作為OMT低、中及高劑量組作用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：A、B為CFBs增殖的濃度-時(shí)間效應(yīng)結(jié)果,C為OMT的保護(hù)濃度;(1)與Control組相比,P<0.05;(2)與HG組相比,P<0.05。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

與Control組比較,HG組的CFBs細(xì)胞數(shù)量增多,細(xì)胞核增大,細(xì)胞間隙變小;與HG組比較,OMT低、中及高劑量組細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞形態(tài)不同程度的恢復(fù)。上述結(jié)果表明OMT可以改善HG誘導(dǎo)的CFBs數(shù)量及形態(tài)病理的改變。見(jiàn)圖2。

注：藍(lán)紫色為CFBs細(xì)胞核,粉紅色為CFBs細(xì)胞漿。

2.3 細(xì)胞膠原纖維的表達(dá)

天狼星紅苦味酸染色結(jié)果如圖3所示,與Control組比較,HG組CFBs細(xì)胞數(shù)量增多,且紅色的膠原面積增加;與HG組相比,OMT低、中及高劑量組細(xì)胞數(shù)量和紅色膠原面積都呈減少的趨勢(shì),提示OMT可以改善HG誘導(dǎo)的CFBs膠原沉積。

注：紅色為CFBs膠原纖維,紫紅色為CFBs細(xì)胞核。

2.4 Hyp含量的分泌

HG作用24 h后,Hyp檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4),與Control組比較,HG組培養(yǎng)基上清中的Hyp含量升高(P<0.05);與HG組比較,OMT低、中及高劑量組培養(yǎng)基上清中的Hyp含量不同程度的降低(P<0.05);與Control組相比,Mannitol組無(wú)明顯差異(P>0.05)。

注：(1)與Control組相比,P<0.05;(2)與HG組相比,P<0.05。

2.5 細(xì)胞α-SMA的表達(dá)

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示(圖5),與Control組相比,HG組CFBs細(xì)胞數(shù)量顯著增加,綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng);與HG組比較,OMT低、中及高劑量組CFBs細(xì)胞數(shù)量減少,綠色熒光強(qiáng)度減弱。

注：綠色熒光表示α-SMA,藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核。

2.6 細(xì)胞周期

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明(圖6),與Control組相比,HG組CFBs細(xì)胞在S期的分布比例增加(P<0.05);與HG組相比,OMT低、中及高劑量組CFBs細(xì)胞在S期的分布比例有所減少(P<0.05);與Control組相比,Mannitol組無(wú)差異(P>0.05)。

注：A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果,B為定量結(jié)果;(1)與Control組相比,P<0.05;(2)與HG組相比,P<0.05。

2.7 細(xì)胞HIF-1α和VEGFA蛋白的表達(dá)

Western bolt實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖7),與Control組相比,HG組CFBs中HIF-1α、VEGFA蛋白的表達(dá)升高(P<0.05);與HG組相比,OMT低、中及高劑量組CFBs中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)減少(P<0.05);與Control組相比,Mannitol組HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)。

注：A為電泳結(jié)果,B為蛋白定量結(jié)果;(1)與Control組相比,P<0.05;(2)與HG組相比,P<0.05。

2.8 細(xì)胞α-SMA、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ及FN蛋白的表達(dá)

Western bolt實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖8),與Control組相比,HG組CFBs中α-SMA、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及FN蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與HG組相比,OMT低劑量、中劑量及高劑量組CFBs中α-SMA、CTGF、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ及FN蛋白表達(dá)減少(P<0.05);與Control組相比,Mannitol組上述蛋白表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)。

注：A為電泳結(jié)果,B為蛋白定量結(jié)果;(1)與Control組相比,P<0.05;(2)與HG組相比,P<0.05。

2.9 細(xì)胞VEGFA、HIF-1α、α-SMA、CTGF、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)HIF-1α信號(hào)相關(guān)蛋白以及MF相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果提示(圖9),與Control組比較,HG組CFBs中HIF-1α、VEGF及MF相關(guān)蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與HG組比較,OMT組(200 mg/L)和YC-1組(1 mg/L)CFBs中HIF-1α、VEGF及MF相關(guān)蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。

注：A為電泳結(jié)果,B為蛋白定量結(jié)果;(1)與空白組(Control)組相比,P<0.05;(2)與HG組相比,P<0.05。

3 討論

糖尿病引起的心血管并發(fā)癥已成為全球發(fā)病率和死亡率的主要原因,這些疾病包括冠心病、風(fēng)濕性心臟病、外周血管疾病、心力衰竭、先天性心臟病及心肌病,病理性MF幾乎參與了心血管病的所有病理生理過(guò)程,DCM在進(jìn)展的早期階段沒(méi)有臨床癥狀,主要表現(xiàn)為各種形式的心臟代謝異常,這可能與MF和僵化的增加有關(guān),這些有害的變化進(jìn)一步導(dǎo)致心房充盈功能障礙和左心室舒張末期壓力升高,后期DCM演變?yōu)樾牧λソ?隨后是心臟重塑、左心室肥厚、心肌間質(zhì)纖維化及舒張功能障礙,進(jìn)一步導(dǎo)致射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭[17-18]。由于DCM發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性和臨床特征,臨床管理面臨著巨大的挑戰(zhàn)。盡管過(guò)去10年進(jìn)行了大量的研究,但DCM的治療仍然是一個(gè)醫(yī)學(xué)難題。2008年,美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)也提出,僅僅控制血糖對(duì)糖尿病引起的心血管并發(fā)癥是不夠的,需要深入研究DCM的病理基礎(chǔ)和發(fā)病機(jī)制,以降低患者的死亡率[19]。DCM病變導(dǎo)致心肌供血不足,心臟的舒張功能也下降,加重纖維化的形成,最終導(dǎo)致MF[20]。間質(zhì)心肌中含有大量的膠原蛋白,這可能導(dǎo)致心臟依從性受損,心臟功能的收縮和舒張能力也將下降[21],DCM的發(fā)生會(huì)引起心肌能量代謝紊亂,毛細(xì)血管基底膜增厚[22],膠原結(jié)構(gòu)改變,心臟自主神經(jīng)病變,導(dǎo)致微循環(huán)障礙,這會(huì)引起心肌廣泛的壞死、纖維化,心臟的收縮功能下降,從而導(dǎo)致心臟擴(kuò)大、心律失常、甚至猝死等[23]。此外,胰島素抵抗和葡萄糖的高毒性會(huì)在一定程度上破壞心肌組織,加劇心肌無(wú)力及心肌組織的纖維化[24]。當(dāng)DCM病癥持續(xù)嚴(yán)重時(shí),患者的心室擴(kuò)張,左心室壁厚度增大,心臟結(jié)構(gòu)將發(fā)生改變,引發(fā)心功能不全[25]。DCM是由糖尿病引起的一種特異性心肌病,是高血壓的早期癥狀,但也伴隨著舒張心功能受損和收縮,隨著疾病的發(fā)展,會(huì)逐漸導(dǎo)致心力衰竭,死亡率和臨床致殘率均較高[26]。隨著時(shí)間的推移,越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn),高血糖的存在已經(jīng)被證實(shí)對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和心功能會(huì)產(chǎn)生不良的影響[27]。因此,為了明確介導(dǎo)FMT的新機(jī)制開(kāi)展深入的研究,尋找可以改善CFBs轉(zhuǎn)分化的天然藥物非常重要。

MF的特征是CFBs的積累和ECM的過(guò)度沉積,CFBs轉(zhuǎn)分化出來(lái)的肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致心臟纖維化的主要原因,這些病變是DCM的起始和進(jìn)展[28]。因此,控制CFBs異常增殖和向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化對(duì)于減輕心臟纖維化至關(guān)重要。而尋找抑制人類心臟纖維化的新分子靶點(diǎn)一直是一個(gè)重要的研究熱點(diǎn)。OMT是苦參中重要且有效的成分,其獨(dú)特的藥理作用可以改善心血管疾病[29];有研究表明,OMT可以調(diào)節(jié)多種參與糖尿病MF的關(guān)鍵基因[30],因此可以作為糖尿病MF研究的陽(yáng)性藥物,確認(rèn)發(fā)生MF的真實(shí)性和藥物藥效作用的有效性。本研究結(jié)果表明,HG可促進(jìn)CFBs的轉(zhuǎn)分化,從而引起CFBs病理形態(tài)的改變,同時(shí)也會(huì)上調(diào)MF蛋白的表達(dá),OMT則能夠有效地逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象,因此表明OMT對(duì)HG誘導(dǎo)的CFBs轉(zhuǎn)分化具有一定的抑制作用。

DCM中CFBs大量增殖,不僅面臨更多的氧氣消耗,而且還會(huì)出現(xiàn)表皮肥厚的現(xiàn)象,最終導(dǎo)致氧供應(yīng)的障礙[31-32];大量研究還顯示,轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α在缺氧的組織或細(xì)胞可以被有效地儲(chǔ)存,從而調(diào)控及影響其下游多種因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[33-34];其中,包括TGF-β1、VEGFA等具有促纖維化功能的分子[35-36]。HIF-1α在纖維化發(fā)生機(jī)制中扮演者重要的角色,鑒于HIF-1α的特殊功能,其可能參與了MF過(guò)程,并有可能成為有效的治療靶點(diǎn)。YC-1作為一種特異的HIF-1α抑制劑,它在抑制纖維化方面發(fā)揮著重要作用,不僅能夠有效地抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性,而且能抑制其下游分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[37-38]。YC-1能否通過(guò)抑制HIF-1α,從而減輕MF程度,目前還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道。有研究表明,HIF-1α是一種核轉(zhuǎn)錄因子,介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)。廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的各種組織和細(xì)胞中,促進(jìn)機(jī)體和細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)[39-40]。因此,HIF-1α作為使機(jī)體耐受缺氧、維持氧穩(wěn)態(tài)的重要因素,并且為纖維化疾病的診斷和治療帶來(lái)了全新的視角。本研究中,采用體外實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)HG誘導(dǎo)的大鼠CFBs增殖模型,旨在深入探討HIF-1α在HG情況下如何加重MF程度的分子機(jī)制,以及其抑制劑YC-1對(duì)HG誘導(dǎo)的MF的抑制作用,最終提供一種有效的抗糖尿病MF的治療策略。

綜上,OMT通過(guò)調(diào)控HIF-1α信號(hào)可以有效地改善HG誘導(dǎo)的CFBs轉(zhuǎn)分化,減少膠原的沉積以及MF相關(guān)蛋白的表達(dá),同時(shí)也減弱了相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá),進(jìn)一步表明OMT通過(guò)影響HIF-1α信號(hào)發(fā)揮抑制CFBs轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制,減少M(fèi)F的發(fā)生和發(fā)展,為預(yù)防和治療MF奠定良好的基礎(chǔ)。