李彩多, 曾曄, 石艷萍, 張迎春, 吳建偉, 陳崢宏, 王濤*

(1．貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550025; 2．貴州省普通高等學(xué)校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550025)

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是生物先天免疫系統(tǒng)中抵抗病原微生物感染的小分子功能多肽[1]。AMPs因其高效地抑制真菌、細(xì)菌及病毒等病原微生物的特性,以及不易引起病原微生物產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn),在感染性疾病治療領(lǐng)域備受矚目,有望成為傳統(tǒng)抗生素的有力替代品[2-6]。因此,深入探究AMPs的作用機(jī)理,對(duì)于揭示其生物特性、研發(fā)新型抗菌藥物具有至關(guān)重要的意義。研究表明,AMPs不僅對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生影響,還可能對(duì)細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞器和功能分子產(chǎn)生影響[7-11]。 AMPs來(lái)源豐富,不同種類的AMPs作用機(jī)制也不盡相同,家蠅抗真菌肽-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A,MAF-1A)突變體-22S3(mutant-22S3 of MAF-1A,Mt-22S3)是本課題組對(duì)發(fā)現(xiàn)的MAF-1A進(jìn)行構(gòu)效優(yōu)化后所獲得的新型AMPs分子,前期研究表明,其模板肽MAF-1A可通過作用于白念珠菌(Candidaalbicans,C.albicans)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)來(lái)發(fā)揮抗C.albicans效果[11],但Mt-22S3是否能影響C.albicans細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能分子尚不清楚。因此,本研究深入探究Mt-22S3在C.albicans細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制,為AMPs的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1AMPsMt-22S3 委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl,FMOC)固相法制備多肽(批次為P27963),并經(jīng)過反相高效液相色譜純化譜 、液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行測(cè)試,多肽純度為98%以上。

1.1.2實(shí)驗(yàn)菌株C.albicansATCC10231由貴州省普通高等學(xué)校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3主要試劑及儀器 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar,SDA)和肉湯培養(yǎng)基(sabouraud dextrose broth,SDB;杭州百思),活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位測(cè)定試劑盒、異硫氰酸熒光素-膜聯(lián)蛋白/碘化丙啶 (fluoresceine isothiocyanate-annexin-V/propidium iodide,FITC-Annexin-V/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及真菌DNA提取試劑盒(北京Solarbio);正置熒光顯微鏡(日本尼康ci-e-ds-r11),熒光多功能酶標(biāo)儀(中國(guó)SYNERGY),凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)IQuant400)。

1.2 研究方法

1.2.1菌株的活化及菌懸液配制 采用分區(qū)劃線法將-80 ℃凍存的C.albicans接種于SDA平板,37 ℃溫箱中培養(yǎng);無(wú)菌操作下挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C.albicans菌落置于SDB中,以細(xì)胞計(jì)數(shù)法配制菌懸液。

1.2.2Mt-22S3對(duì)C.albicans細(xì)胞內(nèi)ROS影響的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C.albicans菌懸液,與終濃度為0、125、250及500 mg/L Mt-22S3作用后,放置于37 ℃溫箱培養(yǎng)12 h,4 000 r/min離心5 min,獲取C.albicans菌體,經(jīng)無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS;pH=7.4)洗滌3次,棄上清液,保留菌體沉淀物。按試劑盒方法,加2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate,DCFH-DA)于37 ℃培養(yǎng)箱中避光染色30 min,PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌并重懸,使用正置熒光顯微鏡拍照和記錄結(jié)果,熒光多功能酶標(biāo)儀于488 nm激發(fā)光、525 nm發(fā)射光下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.3Mt-22S3對(duì)C.albicans線粒體膜電位作用的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C.albicans菌懸液,與終濃度為0、125、250及500 mg/L Mt-22S3作用,同時(shí)設(shè)氧化磷酸化解偶聯(lián)劑(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,cccp)作為陽(yáng)性對(duì)照,放置于37 ℃溫箱培養(yǎng)12 h,4 000 r/min離心5 min,獲取C.albicans菌體,經(jīng)染色工作液洗滌3次,棄上清液,保留菌體沉淀物。按試劑盒方法加染色工作液,37 ℃培養(yǎng)箱中避光染色20 min,染色緩沖液洗滌并重懸3次。采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度,設(shè)置485 nm激發(fā)波長(zhǎng),將發(fā)射波長(zhǎng)從525 nm(綠光、FL1)轉(zhuǎn)換為590 nm(紅光、FL2),并通過計(jì)算熒光比值判斷線粒體膜電位變化。

1.2.4Mt-22S3對(duì)C.albicans細(xì)胞凋亡的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C.albicans菌懸液,與終濃度為0、125、250及 500 mg/L Mt-22S3作用,置于37 ℃溫箱培養(yǎng)12 h,4 000 r/min離心5 min,獲取C.albicans菌體,經(jīng)無(wú)菌PBS洗滌3次,棄上清液,保留菌體沉淀物。依照試劑盒方法作FITC-Annexin-V/PI 染色,通過正置熒光顯微鏡觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5Mt-22S3對(duì)C.albicansDNA條帶遷移率的影響 按“1.2.1”中方法培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C.albicans,依據(jù)真菌DNA提取試劑盒方法提取DNA并檢測(cè)其純度。將C.albicansDNA分別與終濃度為0、125、250、500 mg/L AMPsMt-22S3混合,于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h取出。將各組樣品與6×Loading Dye混合均勻后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,并運(yùn)用凝膠成像分析儀觀察和記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞內(nèi)ROS含量

熒光顯微鏡下可見,125 mg/L Mt-22S3處理12 h后,C.albicans細(xì)胞內(nèi)開始產(chǎn)生綠色熒光,即出現(xiàn)ROS累積現(xiàn)象;Mt-22S3濃度增加時(shí),出現(xiàn)綠色熒光的C.albicans細(xì)胞數(shù)大量增加(圖1A)。多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著Mt-22S3濃度逐漸升高,C.albicans細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度逐漸增高;當(dāng)Mt-22S3濃度達(dá)250 mg/L、500 mg/L時(shí),C.albicans細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度較0 mg/L Mt-22S3組升高(P<0.05或P<0.01,圖1 B)。

注：A為熒光顯微鏡下ROS的表達(dá)(1 000×),B為ROS的定量表達(dá);(1)與0 mg/L Mt-22S3組比較,(1)P<0.05, (2)P<0.01。

2.2 線粒體膜電位

結(jié)果顯示,與0 mg/L Mt-22S3組比較,陽(yáng)性對(duì)照cccp作用于C.albicans后,可見菌細(xì)胞線粒體的FL2∶FL1的比值明顯減小,線粒體膜電位降低(P<0.000 1);125、250及500 mg/L Mt-22S3作用C.albicans后,均可以導(dǎo)致菌細(xì)胞線粒體的熒光比值較0 mg/L Mt-22S3組明顯減小(P<0.01),且隨著Mt-22S3濃度的升高,菌細(xì)胞線粒體熒光比值隨之減小,線粒體膜電位降低越明顯(圖2)。

2.3 細(xì)胞凋亡

熒光顯微鏡下可見(圖3),125、250及500 mg/L AMPsMt-22S3作用于C.albicans后,菌細(xì)胞均可出現(xiàn)帶有紅色熒光的壞死菌細(xì)胞和帶有綠色熒光的凋亡菌細(xì)胞,且隨著Mt-22S3濃度的增高,出現(xiàn)紅色或綠色熒光C.albicans細(xì)胞不斷增多,呈劑量依賴性。

注：紅、綠及黃色熒光分別表示壞死、早期凋亡及晚期凋亡菌細(xì)胞。

2.4 Mt-22S3對(duì)DNA的影響

當(dāng)C.albicans的DNA與250及500 mg/L Mt-22S3作用3 h 后,相較于0 mg/L Mt-22S3組,出現(xiàn)了明顯的凝膠阻滯現(xiàn)象,導(dǎo)致大量C.albicansDNA被阻塞在凝膠加樣孔附近,同時(shí)DNA電泳條帶呈現(xiàn)出不同程度的變暗;此外,隨著AMPs Mt-22S3濃度的增加,DNA條帶的亮度也逐漸減弱。見圖4。

注：1～4表示Mt-22S3濃度依次為 0、125、250及500 mg/L。

3 討論

ROS是在細(xì)胞在代謝過程中自然生成的具有化學(xué)活性的含氧分子,正常生理?xiàng)l件下在細(xì)胞信號(hào)傳遞和體內(nèi)平衡中起著重要作用[12]。但是各種環(huán)境壓力可導(dǎo)致ROS增加,從而對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重的破壞。有研究顯示,過量ROS可通過破壞多種細(xì)胞功能分子(包括核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì))、增加細(xì)胞膜通透性等方式導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。有研究表明,誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生是抗真菌藥物的一種普遍作用方式,有助于抗真菌藥物殺傷病原微生物[14-17]。不同的抗真菌藥物,包括咪康唑、兩性霉素B可以促使細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加來(lái)殺滅C.albicans[14-15]。有研究表明,AMPs可以影響線粒體氧化還原平衡,誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生和積累,而ROS的積累則會(huì)導(dǎo)致C.albicans的死亡[16-17]。Seyedjavadi等[16]研究表明,高濃度AMPs MCh-AMP1作用C.albicans細(xì)胞后,菌細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生大量ROS,表明MCh-AMP1可通過誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化損傷。本研究結(jié)果顯示,250 mg/L、500 mg/L Mt-22S3作用后,染上綠色熒光的C.albicans細(xì)胞明顯增多,熒光強(qiáng)度增高(P<0.05),提示經(jīng)Mt-22S3作用的C.albicans細(xì)胞內(nèi)ROS大量增加,表明一定濃度的Mt-22S3也能誘導(dǎo)C.albicans細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS,提示Mt-22S3可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生而發(fā)揮抗C.albicans作用。

線粒體是能量代謝的重要細(xì)胞器,而能量代謝又與細(xì)胞生理學(xué)和完整性密切相關(guān)。研究表明,細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和積累能引發(fā)細(xì)胞線粒體膜電位去極化,導(dǎo)致線粒體功能障礙[18]。此外,大量的ROS會(huì)對(duì)線粒體的結(jié)構(gòu)組成造成嚴(yán)重?fù)p害,進(jìn)而影響線粒體膜的完整性。文獻(xiàn)報(bào)道,某些AMPs可以使C.albicans細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)生ROS,引起線粒體膜電位去極化,使線粒體膜完整性破壞,從而導(dǎo)致線粒體失去其正常的生物學(xué)功能[19]。本研究中,使用熒光染料檢測(cè)C.albicans細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化,結(jié)果表明,經(jīng)過不同濃度的Mt-22S3作用后,C.albicans細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì),Mt-22S3作用濃度越高,C.albicans細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位去極化越明顯(P<0.01),上述結(jié)果表明,Mt-22S3可以使線粒體膜電位降低,引起線粒體的去極化現(xiàn)象,進(jìn)而對(duì)線粒體的正常功能造成損害。

近年來(lái)研究表明,ROS是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,ROS的產(chǎn)生是凋亡途徑啟動(dòng)相關(guān)的早期因素之一,高水平的ROS會(huì)使線粒體膜去極化,而線粒體膜的去極化在細(xì)胞凋亡中起著重要作用[18-20]。Chen等[21]研究顯示,AMPs hep25誘導(dǎo)C.albicans細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS,使線粒體膜電位降低,導(dǎo)致線粒體膜電位去極化,最后誘導(dǎo)C.albicans凋亡;Ma等[22]發(fā)現(xiàn)AMP-17導(dǎo)致ROS水平增加、線粒體膜電位的去極化及細(xì)胞周期的變化,最終導(dǎo)致C.albicans細(xì)胞凋亡和壞死。正常情況下,磷脂酰絲氨酸分布于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè),即與細(xì)胞質(zhì)相鄰的一側(cè),當(dāng)細(xì)菌處于凋亡初期時(shí),這些磷脂酰絲氨酸會(huì)被翻轉(zhuǎn)到細(xì)菌膜外[22];Annexin Ⅴ屬于Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,可以特異性結(jié)合凋亡細(xì)胞中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸,在激發(fā)光作用下,與凋亡細(xì)胞磷脂酰絲氨酸結(jié)合的Annexin Ⅴ-FITC可使細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光[22]。PI是一種熒光核酸染料,不能穿透完好無(wú)損的細(xì)胞膜,可透過破損的細(xì)胞膜進(jìn)入壞死的細(xì)胞內(nèi),使細(xì)胞產(chǎn)生紅色熒光[23]。本研究中,Mt-22S3作用于C.albicans細(xì)胞后可促使菌細(xì)胞產(chǎn)生綠色或紅色熒光,表明Mt-22S3不僅可以使C.albicans細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻,還能破壞細(xì)胞膜完整性,增加細(xì)胞膜通透性,從而提示Mt-22S3可以使C.albicans細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死現(xiàn)象。念珠菌中的細(xì)胞凋亡主要通過2條途徑發(fā)生,第一種是半胱氨酸蛋白酶依賴性途徑,第二種是半胱氨酸蛋白酶非依賴性途徑[19-20]。ROS增加、線粒體功能障礙及鈣離子的積累是激活半胱氨酸蛋白酶依賴性途徑使細(xì)胞凋亡的重要因素。由本研究結(jié)果可見,Mt-22S3可以使C.albicans細(xì)胞大量產(chǎn)生ROS,引起線粒體膜電位降低,線粒體功能受損,提示Mt-22S3可能通過半胱氨酸蛋白酶依賴性途徑誘導(dǎo)C.albicans發(fā)生細(xì)胞凋亡。

有研究顯示,某些AMPs進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)可通過靜電結(jié)合等方式與菌細(xì)胞DNA結(jié)合,導(dǎo)致菌細(xì)胞的正常生理功能受阻,從而發(fā)揮其抗菌活性[24]。有研究表明,瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的電泳遷移率可用于評(píng)估AMPs與菌細(xì)胞DNA之間的結(jié)合情況[11,25]。當(dāng)AMPs與C.albicans的DNA分子結(jié)合時(shí),其所形成的結(jié)合物在電泳中的遷移率將受到抑制,導(dǎo)致其出現(xiàn)滯后于單獨(dú)存在的DNA分子[11,25]。本研究凝膠電泳結(jié)果顯示,相較于陰性對(duì)照,與Mt-22S3共孵育的DNA出現(xiàn)顯著的凝膠阻滯現(xiàn)象,大量C.albicans的DNA 被阻止并停滯在凝膠加樣孔附近,結(jié)果表明Mt-22S3進(jìn)入細(xì)胞后與C.albicans細(xì)胞的DNA分子發(fā)生了結(jié)合作用,從而阻撓DNA的復(fù)制等生理功能,最終發(fā)揮了抗C.albicans的效果。

綜上所述,Mt-22S3進(jìn)入C.albicans細(xì)胞內(nèi)后,可通過誘導(dǎo)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS、去極化線粒體、誘導(dǎo)凋亡、與DNA分子結(jié)合等方式破壞C.albicans細(xì)胞的正常生理機(jī)能,發(fā)揮抗C.albicans作用。