晏青, 程芝梅, 張帥, 周石 *

(貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)影像學(xué)院, 貴州 貴陽 550004)

近年來,慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)患病率逐年遞增,患者年齡也越來越年輕化,因其極易進(jìn)展到終末期腎病(end-stagere-nal disease,ESRD)導(dǎo)致患者只能依靠透析治療或腎移植維持生命,因此已成為全球性公共健康問題之一[1-2]。腎纖維化是各種原因所致腎臟疾病發(fā)展到ESRD的共同途徑,也是貫穿CKD發(fā)展全過程的病理改變[3]。目前腎纖維化已經(jīng)成為治療CKD的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),故而探索安全有效的抗腎纖維化藥物是當(dāng)前臨床的迫切需求及研究熱點(diǎn)[4]。吡非尼酮(pirfenidone,PFD)是一種口服的小分子吡啶酮類化合物[5],因有廣譜的抗纖維化、抗氧化及抗炎作用,因此被廣泛認(rèn)識及深入研究[6]。已有研究顯示,PFD能夠有效減輕肺纖維化、肝纖維化程度以及延緩青光眼術(shù)后瘢痕形成的進(jìn)展[7-8],因此PFD已被臨床用于多種臟器纖維化疾病的治療,但是關(guān)于PFD在腎纖維化中的作用研究較少且大多數(shù)都處于初級階段,且其腎纖維化防治作用的機(jī)制通路也尚未完全明確。有研究認(rèn)為,PFD可保留受損腎細(xì)胞中線粒體嵴結(jié)構(gòu),減少線粒體腫脹,保留其部分抗氧化功能,從而達(dá)到保護(hù)腎臟的作用[9]。沉默信息調(diào)節(jié)因子3(Silence information regulator 3,SIRT3)是Sirtuin蛋白家族中位于線粒體內(nèi)的重要成員之一,可以調(diào)節(jié)線粒體結(jié)構(gòu)和功能[10-11]。目前SIRT3因抗氧化作用而被廣泛認(rèn)識[12]。大量研究表明,SIRT3廣泛分布于腎小管細(xì)胞中且對腎臟具有保護(hù)作用,可能與該分子可以促進(jìn)線粒體融合、維持腎小管細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等功能有關(guān),但具體機(jī)制尚不明確[13-14]。因此,本研究旨在探究PFD對腎纖維化大鼠腎臟的治療作用及可能的分子機(jī)制, 從而為臨床靶向治療腎纖維化提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 Sprague-Dawley(SD) 雄性大鼠30只,體質(zhì)量180～200 g,由學(xué)校實(shí)驗(yàn)動物中心提供,本研究已獲學(xué)校實(shí)驗(yàn)室動物倫理委員會的批準(zhǔn)(1702161)。

1.1.2主要試劑和儀器 PFD(北京康蒂尼藥業(yè)有限公司)、98%四氯化碳(CCL4,上海麥克林生化科技有限公司)、橄欖油(大連美侖生物技術(shù)有限公司),尿素測定試劑盒、肌酐測定試劑盒、尿酸測定試劑盒(深圳雷杜生命科學(xué)有限公司),二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA) 蛋白定量試劑盒、蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司),Masson三色染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司),鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、鼠抗人金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitors of metalloproteinase 1,TIMP1)及鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP2)單克隆抗體(美國Novus Biologicals公司),兔抗人Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ, ColⅠ)單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司),兔抗人Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ, Col Ⅲ)單克隆抗體、兔抗人缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α ,HIF-1α)單克隆抗體(上海愛必信生物科技有限公司),兔抗人β-肌動蛋白(beta-actin ,β-actin)和鼠抗人轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)單克隆抗體(美國Affinity公司),兔抗人SIRT3單克隆抗體(美國Proteintech公司),小型垂直電泳轉(zhuǎn)印儀器、快速蛋白轉(zhuǎn)印儀器、凝膠成像儀器(美國Bio-Rad 公司)。

1.2 研究方法

1.2.1造模 30只SD大鼠隨機(jī)均分為對照組、模型組及治療組,模型組和治療組大鼠按1 mL/kg劑量腹腔注射50%濃度CCl4油溶液,對照組大鼠按1 mL/kg劑量腹腔注射橄欖油,均為2次/周、連續(xù)5周;處理結(jié)束,隨機(jī)抽取各組大鼠2只處死,取右腎行病理檢查作為金標(biāo)準(zhǔn)判定造模是否成功,造模成功標(biāo)準(zhǔn)為HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察到大鼠正常腎組織結(jié)構(gòu)破壞,腎小球肥大或硬化,腎小球系膜細(xì)胞增生,腎小管上皮細(xì)胞脫落,腎小管擴(kuò)張、腫脹或塌陷,腎間質(zhì)纖維化等改變[15]。造模成功后,治療組大鼠采用PFD以200 mg/(kg·d)劑量連續(xù)4周灌胃給藥,模型組和對照組大鼠按相同體積生理鹽水灌胃,其中模型組大鼠于造模成功后4周內(nèi)繼續(xù)予CCl4油溶液腹腔注射(1次/周),對照組大鼠則腹腔注射橄欖油,劑量計(jì)算同前。

1.2.2一般情況觀察 觀察各組大鼠處理過程中的一般情況,包括進(jìn)食飲水量、精神狀態(tài)及活動量、毛發(fā)及大小便顏色變化等情況,每周末以及處死大鼠前稱體質(zhì)量并記錄。

1.2.3取材和標(biāo)本收集 取“1.2.1”項(xiàng)下第9周給藥24 h后的各組大鼠8只,麻醉處死,取心臟血,游離右腎周脂肪和被膜后取右腎,去除包膜和結(jié)締組織,洗凈并瀝干;所采集樣本妥善處置并保存以待后續(xù)檢測。

1.2.4血清腎功能指標(biāo)檢測 取“1.2.3”項(xiàng)下各組大鼠血樣本,室溫靜置1 h,2～8 ℃下3 000 r/min離心機(jī)中離心15 min,取上層血清,通過全自動生化分析儀檢測血清中尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,Scr)以及尿酸(uric acid, UA)含量。

1.2.5HE和Masson染色 取“1.2.3”項(xiàng)下各組大鼠右腎組織,常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋及切片;根據(jù)HE和Masson染色試劑盒說明書進(jìn)行染色操作,中性樹膠封片;200倍光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織學(xué)改變并采集圖像。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達(dá) 取“1.2.3”項(xiàng)下各組大鼠腎組織檢測SIRT3、HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、ColⅠ、Col Ⅲ、TIMP1及MMP2蛋白水平。具體方法如下:取腎組織50～100 mg,裂解研磨,12 000 r/min離心15 min,取上清,按BCA試劑盒測定蛋白濃度后變性蛋白;制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗及二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔IgG)、曝光;Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

開始造模后,模型組和治療組大鼠的進(jìn)食、活動量較造模前逐漸減少,且明顯少于對照組大鼠,毛色由白色逐漸變黃,精神開始萎靡,大小便發(fā)黃,大便稀軟易散開;經(jīng)過PFD治療后,治療組大鼠進(jìn)食及活動量較前增多,毛色發(fā)黃及精神狀態(tài)較前改善、小便略黃,大便正常;模型組大鼠第2、5、7、9周體質(zhì)量較對應(yīng)時(shí)點(diǎn)對照組大鼠體質(zhì)量減少(P<0.05),治療組大鼠第7、9周時(shí)體質(zhì)量較對應(yīng)時(shí)點(diǎn)模型組大鼠體質(zhì)量增多(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)過程中體質(zhì)量的變化Tab.1 Changes in body mass of rats in each group during the experimental

2.2 血清BUN、Scr及UA

與對照組比較,模型組大鼠血清BUN、Scr及UA含量增高(P<0.05);PFD治療4周后,治療組大鼠血清BUN、Scr及UA含量較模型組降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清BUN、Scr及UA含量Tab.2 Serum BUN, Scr, and UA contents of

2.3 腎臟組織學(xué)特征

HE染色結(jié)果顯示(圖1),對照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)正常,無明顯破壞;模型組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)明顯破壞,腎小管擴(kuò)張、腫脹,上皮細(xì)胞脫落;治療組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)破壞介于對照組和模型組之間,腎小球系膜增生、腎小管上皮細(xì)胞脫落減少以及腎小管擴(kuò)張程度均較模型組程度減低。Masson染色顯示(圖1),對照組大鼠僅見大血管周圍少許纖維,模型組腎間質(zhì)及血管周圍見大量藍(lán)染膠原纖維沉積,治療組大鼠藍(lán)染膠原纖維沉積較模型組減少且纖維化程度有明顯減輕。

圖1 各組大鼠腎臟的組織學(xué)特征(200×)Fig.1 Histological characteristics of kidneys of rats in each group(200×)

2.4 MMP2和TIMP1蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果表明(圖2),模型組大鼠腎組織MMP2表達(dá)較對照組降低(P<0.05),治療組MMP2表達(dá)較模型組增高(P<0.05);模型組大鼠腎組織TIMP1表達(dá)較對照組增高(P<0.05),治療組TIMP1表達(dá)較模型組降低(P<0.05)。

注：A為MMP2、TIMP1蛋白的檢測結(jié)果,B為MMP2、TIMP1蛋白表達(dá)的定量結(jié)果;(1)與對照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

2.5 Col Ⅰ、Col Ⅲ和α-SMA蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果表明(圖3),模型組大鼠腎組織ColⅠ、Col Ⅲ和α-SMA表達(dá)較對照組增高(P<0.05),PFD治療4周后,治療組大鼠腎臟組織中ColⅠ、Col Ⅲ和α-SMA表達(dá)較模型組降低(P<0.05)。

注：A為ColⅠ、ColⅢ及α-SMA蛋白的檢測結(jié)果,B為ColⅠ、Col Ⅲ及α-SMA蛋白的定量表達(dá);(1)與對照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

2.6 SIRT3、HIF-1α及TGF-β1蛋白的表達(dá)

結(jié)果表明(圖4),模型組大鼠腎臟組織中SIRT3表達(dá)較對照組降低(P<0.05),PFD治療4周后的治療組SIRT3表達(dá)較模型組增高(P<0.05);模型組大鼠腎臟組織中HIF-1α、TGF-β1表達(dá)較對照組增高(P<0.05),PFD治療4周后的治療組大鼠腎臟組織中HIF-1α、TGF-β1表達(dá)較模型組降低(P<0.05)。

注：A為SIRT3、HIF-1α及TGF-β1蛋白的檢測結(jié)果,B為SIRT3、HIF-1α及TGF-β1蛋白的定量結(jié)果;(1)與對照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

3 討論

腎臟纖維化可以作為CKD的標(biāo)志,腎纖維化程度越嚴(yán)重CKD也就越嚴(yán)重,兩者嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[16],所以延緩甚至逆轉(zhuǎn)腎臟的纖維化是目前治療CKD的切入點(diǎn)。PFD能阻止甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的積聚,已被大量研究證實(shí)在多種器官纖維化中均有良好的抗纖維化作用[17]。目前PFD對腎纖維化防治作用的信號通路尚未完全探究清楚。腎纖維化形成主要是由于ECM的異常增多與過度累積,ECM異常沉積主要與其生成和降解失衡相關(guān)[18]。研究顯示,肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致ECM異常大量生成的重要細(xì)胞[19],成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)可促使ECM降解,也可以分泌MMPs組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMPs)抑制MMPs的活性,促使ECM合成,這兩類蛋白分子可以調(diào)節(jié)腎臟ECM的合成和降解,維持其相對平衡狀態(tài)[20-21]。腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(endothelial-mesenchymal transition,EMT)也是肌成纖維細(xì)胞的主要來源之一[22]。TIMP1、MMP2能反映腎臟ECM情況[23];ColⅠ、Col Ⅲ是ECM的主要成分,能反映腎間質(zhì)纖維化的情況[24];α-SMA、TGF-β1是EMT的間質(zhì)形成標(biāo)志物,尤其是TGF-β1作為生物體內(nèi)一種重要的促纖維化生長因子,可以獨(dú)立啟動和完成EMT的整個(gè)過程[25-26]。已有很多臨床結(jié)果表明,在患病腎臟標(biāo)本及尿液中TGF-β1的含量明顯增高,且腎纖維化程度越高,TGF-β1含量越高,兩者關(guān)系呈正相關(guān)[27]。目前許多研究顯示,EMT過程與組織缺氧有非常緊密的聯(lián)系,HIF-1α在EMT過程中處于重要地位,正常腎組織中HIF-1α無活性,而缺氧條件下HIF-1α可被激活且積聚在腎間質(zhì)內(nèi),激活的HIF-1α可以促進(jìn)多種促纖維化因子介導(dǎo)臟器纖維化的發(fā)生[28]。亦有研究顯示,HIF-1α可直接結(jié)合TGF-β1啟動子的缺氧反應(yīng)元件,從而驅(qū)動TGF-β1表達(dá)上調(diào),加劇腎纖維化程度[29]。本研究造模5周后,模型組和治療組大鼠出現(xiàn)腎臟損傷,腎組織結(jié)構(gòu)破壞,血清腎功能指標(biāo)BUN、Scr及UA含量較對照組增高,與病理HE染色結(jié)果一致;Masson染色證實(shí)大鼠腎臟組織膠原纖維沉積、纖維化發(fā)生;Western blot檢測腎組織TIMP1、ColⅠ、ColⅢ、α-SMA、TGF-β1及HIF-1α表達(dá)增高,MMP2表達(dá)降低,以上結(jié)果說明大鼠腎纖維化模型建立成功。PFD持續(xù)治療4周后,治療組大鼠腎臟損傷及纖維化程度較模型組明顯減輕,上述血清腎功能指標(biāo)含量以及腎纖維化相關(guān)蛋白TIMP1、ColⅠ、Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1及HIF-1α表達(dá)均較模型組降低,MMP2表達(dá)增高,說明PFD可以有效減輕CCL4誘導(dǎo)的腎損傷及纖維化程度。

已有研究表明,SIRT3蛋白可通過抑制HIF-1α/TGF-β1通路的激活發(fā)揮抗纖維化的作用[30]。本研究成功建立大鼠腎纖維化模型后,與對照組比較,模型組大鼠腎組織中SIRT3蛋白表達(dá)降低,HIF-1α和TGF-β1表達(dá)增高;PFD治療4周后,治療組SIRT3蛋白表達(dá)較模型組明顯增高,HIF-1α和TGF-β1表達(dá)降低,提示SIRT3蛋白可通過抑制HIF-1α/TGF-β1信號通路的激活發(fā)揮抗腎纖維化作用,與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致。

綜上所述,本研究表明PFD可減輕大鼠腎纖維化程度,恢復(fù)部分受損腎功能,提示對大鼠腎纖維化具有較好的防治作用,其機(jī)制可能與上調(diào)SIRT3蛋白表達(dá),從而抑制HIF-1α/TGF-β1信號通路的激活有關(guān)。這為PFD治療腎纖維化提供了新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù),但信號通路還需進(jìn)一步的細(xì)胞或基因?qū)用鎸?shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。