趙瑄, 鄭紅梅, 王雨虹, 巨佳曦, 朱貴明*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院&健康醫(yī)藥現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院, 貴州 貴陽 550025)

游離脂肪酸(free fatty acids,FFAs)是機體內(nèi)重要的能量來源,根據(jù)碳鏈的長度可以分為短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)、中鏈脂肪酸(medium-chain fatty acids,MCFAs)及長鏈脂肪酸(long-chain fatty acids,LCFAs)[1-2]。FFAs在各種生理條件下表現(xiàn)出信號傳導(dǎo)、基因表達及調(diào)節(jié)機體能量穩(wěn)態(tài)等關(guān)鍵功能[3]。FFAs受體(FFAs receptors,FFARs)也稱為G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCRs),FFARs根據(jù)激活的FFAs的碳鏈長度進行分類,游離脂肪酸受體2(free fatty acid receptor 2,FFAR2)與FFAR3可被SCFAs激活,MCFAs和LCFAs作為配體可激活膜受體FFAR1與FFAR4[4-6]。FFAR4可被天然配體以及非內(nèi)源性激動劑激活,天然配體主要為多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs),它是一類含有2個或2個以上的雙鍵且含碳原子個數(shù)>18的直鏈脂肪酸,通常分為歐米伽-6PUFAs(omega-6,ω-6或n-6)系和n-3系,其中n-3 PUFAs對高血壓、動脈粥樣硬化及心肌梗死等心血管疾病產(chǎn)生積極的影響[7-9]。研究發(fā)現(xiàn),n-3 PUFAs激活FFAR4后在脂肪因子與細(xì)胞因子產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用,過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)和核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)也參與了該途徑[10-12];在糖尿病小鼠(db/db)模型中,FFAR4激動劑可使脂肪組織胰島素增敏,達到抗糖尿病的效果[13];靜脈注射魚油脂乳劑(fish oil fat emulsion,FOLE)可預(yù)防小鼠腸外營養(yǎng)(parenteral nutrition,PN)誘導(dǎo)的肝損傷,逆轉(zhuǎn)PN誘導(dǎo)的小兒膽汁淤積;Fell等[14]研究顯示,FOLE能夠保護小鼠肝臟,部分是通過激活FFAR4、PPARγ及血小板反應(yīng)蛋白受體(thrombospondin receptor,CD36)。因此,本研究利用能夠?qū)-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n-3 PUFAs的Δ15脂肪酸去飽和酶(Δ15 fatty acid desaturase,Δ15 Des)轉(zhuǎn)基因小鼠,探究PUFAs對小鼠睪丸結(jié)構(gòu)和功能的影響及其機制,為后續(xù)研究PUFAs與雄性小鼠生殖功能的聯(lián)系提供實驗及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 4周齡SPF級C57BL/6野生型(wild type,WT)雄性小鼠5只,實驗室前期使用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建表達Δ15 Des活性的轉(zhuǎn)基因4周齡雄性小鼠(即Δ15 Des轉(zhuǎn)基因小鼠)5只,體質(zhì)量為18～22 g,飼養(yǎng)于學(xué)校實驗動物中心[SYXK(黔)2018-0001];飼養(yǎng)環(huán)境為日平均溫度22～26 ℃、濕度60%～80%、光照周期為12 h光照及12 h黑暗。

1.1.2主要儀器及試劑 HP5890氣相色譜儀(昆山塞特科學(xué)儀器有限公司),石蠟包埋機(武漢俊杰電子有限公司),病理切片機(上海徠卡儀器有限公司);定制小鼠飼料[6%花生四烯酸(arachidonic acid,ARA)]、動物組織總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]。

1.2 研究方法

1.2.1實驗分組及取樣 取C57BL/6 WT小鼠和Δ15 Des轉(zhuǎn)基因小鼠分別作為對照組(WT組)和實驗組(TG組),含6% ARA飼料飼喂8周,麻醉處死,于冰上迅速分離小鼠完整的睪丸組織及附睪組織,用于后續(xù)實驗。

1.2.2氣相色譜(gas chromatography,GC)檢測睪丸組織總脂肪酸的組成及含量 取“1.2.1”項下2組小鼠睪丸組織,采用三氟化硼/甲醇(boron trifluoride/methyl alcohol,CH3OH/BF3)法提取睪丸組織的總脂肪酸,GC檢測睪丸組織總脂肪酸的組成,標(biāo)準(zhǔn)品對照法對比待測樣品中的PUFAs組成,N2000色譜數(shù)據(jù)離線工作站計算脂肪酸的含量。

1.2.3小鼠精子運動活力檢測及精子超微結(jié)構(gòu)分析 精子獲能液200 μL于胚胎培養(yǎng)皿中,37 ℃恒溫臺上預(yù)熱5 min;取“1.2.1”項下2組小鼠附睪組織的附睪尾快速放入精子獲能液中,刺破附睪尾,使精子充分游出;迅速把胚胎培養(yǎng)皿放于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10 min;取精子獲能液的上層懸液20 μL于載玻片上,置蓋玻片,載玻片置于顯微鏡載物臺處;計算機輔助精子分析(computer-aided sperm analysis,CASA)系統(tǒng)檢測小鼠的精子活力指標(biāo),包括精子總活力、直線運動精子活力、精子平均路徑速度(average path velocity,VAP)、精子曲線速度(curvilinear velocity,VCL)及精子直線速度(straight-line velocity,VSL),并截取精子3個不同視野的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察睪丸組織的形態(tài)學(xué)特征 取“1.2.1”項下2組小鼠睪丸組織,置于4%多聚甲醛固定24 h,乙醇梯度脫水,二甲苯透明處理,石蠟包埋、切片、脫水、染色,顯微鏡下觀察腓腸肌組織結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5實時熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)檢測睪丸組織中膜受體FFARs(FFAR1、FFAR2、FFAR3及FFAR4)、核受體PPARs(PPARα、PPARβ及PPARγ) 信使RNA(messenger RNA,mRNA)的表達 取“1.2.1”項下2組小鼠睪丸組織20 mg,利用Trizol法提取小鼠總RNA,定量為1 μg,將總RNA反轉(zhuǎn)錄成互補DNA(complementary DNA,cDNA)。RT-qPCR檢測在睪丸組織中膜受體FFARs(FFAR1、FFAR2、FFAR3、FFAR4)及核受體PPARs(PPARα、PPARβ、PPARγ)mRNA表達;反應(yīng)體系為cDNA樣品1 μL、上下游引物各0.4 μL、TB Green 5 μL及超純(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水3.2 μL;反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s、退火60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s、40個循環(huán);儀器上測出各個樣品的循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)后,根據(jù)2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測睪丸組織中FFAR4與PPARγ的表達 取“1.2.1”項下2組小鼠睪丸組織提取總蛋白,利用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒以及酶標(biāo)儀測定蛋白濃度。將蛋白置于100 ℃水浴5 min變性,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?制備12%分離膠于5%濃縮膠進行電泳,于聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上蛋白轉(zhuǎn)移,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,洗膜后一抗孵育(β-tubulin、FFAR4、PPARγ)4 ℃過夜,β-tubulin、FFAR4以及PPARγ抗體的稀釋倍數(shù)均為1∶1 000,加1∶5 000比例配置的辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)二抗,室溫孵育40～60 min,進行凝膠成像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 睪丸組織中脂肪酸的GC檢測

GC檢測結(jié)果顯示(圖1),與WT組相比,TG組小鼠睪丸組織中ARA(20∶4n-6)與二十二碳四烯酸(docosatetraenoic acid,DTA;22∶4n-6)含量降低(P<0.05或P<0.01),亞油酸(linoleic acid,LA;18∶2n-6)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA;20∶5n-3)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA;22∶6n-3)含量升高(P<0.05或P<0.01)。

注：A為WT組,B為TG組,C為脂肪酸的定量結(jié)果;與WT組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

2.2 精子形態(tài)

探究轉(zhuǎn)化的n-3 PUFAs與轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)的Δ15 Des基因是否對小鼠的精子形態(tài)及運動活力產(chǎn)生影響,通過顯微鏡觀察,選取同鼠附睪組織在3個不同視野下的精子形態(tài),結(jié)果顯示2組小鼠的精子形態(tài)及數(shù)量無明顯差異(圖2)。

圖2 WT組和TG組小鼠精子的形態(tài)觀察(40×)Fig.2 Morphological observation of sperm in WT and TG groups(40×)

2.3 精子運動活力

CASA系統(tǒng)分析小鼠精子的運動活力,結(jié)果顯示(圖3),與WT組相比,TG組小鼠精子的直線運動精子活力、VSL升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);精子總活力、VAP、VCL比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：A為精子總活力、直線運動精子活力的定量結(jié)果,B為VAP、VCL及VSL的定量結(jié)果;(1)與WT組相比,P<0.05。

2.4 睪丸結(jié)構(gòu)

睪丸組織的HE染色結(jié)果顯示(圖4),與WT組相比,TG組小鼠睪丸管腔內(nèi)精子發(fā)生密集,靠近管腔的圓形精子及管腔內(nèi)的長形精子數(shù)量增加;WT組小鼠可見生精小管排列松弛,管腔較大,間質(zhì)松散,精原細(xì)胞和精母細(xì)胞較TG組有所減少,管腔內(nèi)的長形精子數(shù)量有所減少。

圖4 WT組和TG組小鼠睪丸組織的HE染色(40×)Fig.4 HE staining of testicular tissue in WT and TG groups(40×)

2.5 睪丸組織FFAR2、FFAR3、FFAR4及PPARα、PPARβ、PPARγ mRNA的表達

RT-qPCR結(jié)果顯示(圖5),與WT組相比,TG組小鼠睪丸組織中FFAR4、PPARα mRNA表達上調(diào)(P<0.01或P<0.05),PPARβ mRNA表達下調(diào)(P<0.05),FFAR1、FFAR2、FFAR3及PPARγ mRNA表達無差異(P>0.05)。

注：A為FFAR2、FFAR3、FFAR4 mRNA定量結(jié)果,B為 PPARα、PPARβ及PPARγ mRNA定量結(jié)果;與WT組相比,(1)P<0.001,(2)P<0.05。

2.6 睪丸組織中FFAR4與PPARγ蛋白的表達

采用Western blot分析小鼠睪丸組織中FFAR4、PPARγ蛋白的水平,結(jié)果表明(圖6),與WT組相比,TG組小鼠睪丸組織中FFAR4蛋白水平增加(P<0.05),PPARγ蛋白水平無變化(P>0.05)。

注：A為Western blot檢測結(jié)果,B為定量結(jié)果;(1)與WT組相比,P<0.01。

3 討論

作為n-3FFAs的受體,在人體與許多哺乳動物中FFAR4發(fā)揮著重要的生理作用,研究表明,2型糖尿病、肥胖、急性肝損傷及其他免疫疾病時,FFAR4是一個重要的治療靶點[15-18]。然而,FFAR4影響小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)報道尚比較缺乏。本研究利用精子質(zhì)量分析儀與CASA系統(tǒng)分析小鼠精子的運動活力,從精子的形態(tài)以及運動指標(biāo)可看出,轉(zhuǎn)化的n-3PUFAs能使轉(zhuǎn)基因小鼠在不影響小鼠精子總動能的前提下,提高小鼠的直線運動精子活力及VSL,說明轉(zhuǎn)化的n-3PUFAs以及轉(zhuǎn)入的Δ15 Des基因的并不會影響精子的形態(tài)及總運動水平;通過HE染色分析發(fā)現(xiàn),與WT組小鼠相比,TG組小鼠睪丸組織內(nèi)的曲細(xì)精管排布規(guī)整,曲細(xì)精管內(nèi)空泡較少,在曲細(xì)精管管腔處形成的成熟精子較多。根據(jù)上述現(xiàn)象可以認(rèn)為,PUFAs影響小鼠睪丸組織內(nèi)精子發(fā)生的途徑可能為FFAR4通路。有研究表明,n-3PUFAs或FFAR4激動劑激活FFAR4后,會刺激纖毛產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)直接激活交換蛋白(exchange proteins directly activated,EPAC),從而促進脂肪生成[19-21];Miyamoto等[22]研究顯示,MCFAs和LCFAs可同時激活FFAR1與FFAR4,SCFAs可以激活FFAR2與FFAR3;此外,FFAR1結(jié)合n-3 PUFAs配體的親和力和FFAR4相差不大[23-25]。本研究采取n-6系的ARA飼喂小鼠,TG組小鼠將其轉(zhuǎn)化為n-3系的EPA以及碳鏈更長的DHA后,可能通過激活FFAR4,影響下游基因的表達;與WT組小鼠相比,TG組小鼠睪丸組織中FFAR4 mRNA和蛋白的表達上升,PPARγmRNA和蛋白的表達無差異,表明在睪丸組織中n-3PUFAs不能以配體的形式結(jié)合PPARγ。

綜上所述,n-3PUFAs可能以配體-受體的方式結(jié)合FFAR4,激活下游信號分子,從而改善小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)和功能,但FFAR4是否將胞外信號傳遞給cAMP,進而對睪丸組織產(chǎn)生影響,仍需進一步的研究。