劉新宇, 趙茂, 楊穎穎, 邱煒

(貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院 & 健康醫(yī)藥現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550025)

包括黑色素瘤在內(nèi)的多種腫瘤中,無(wú)論是否有氧氣參與,腫瘤細(xì)胞都會(huì)傾向?qū)⒈徂D(zhuǎn)換為乳酸,這種狀態(tài)被稱為“Warburg效應(yīng)”[1]。隨著乳酸代謝物不斷積累,最終形成pH介于5.8～7.4的腫瘤酸性微環(huán)境[2]。腫瘤酸性微環(huán)境能誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs)向替代途徑激活的巨噬細(xì)胞(alternatively activated or healing macrophage,M2型)極化[3-5]。M2型TAMs通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、精氨酸酶-1(arginase1,ARG-1)等細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移[6-9]。同時(shí),M2型TAMs積累也被認(rèn)為是患者預(yù)后不良的原因之一[8,10]。因此,腫瘤微環(huán)境中酸性特性如何誘導(dǎo)TAMs向M2型極化已成為T(mén)AMs腫瘤治療的重點(diǎn)研究方向之一[11]。陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有生物相容性好、合成簡(jiǎn)單及可塑性良好等特點(diǎn),是當(dāng)前靶向特定組織和細(xì)胞進(jìn)行基因治療的優(yōu)良載體[12]。周期生物鐘1(period 1,PER1)是晝夜節(jié)律的核心基因之一,在控制哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律、細(xì)胞周期及DNA損傷反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[13];PER1的異常表達(dá)與結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[14-16]。然而,目前PER1對(duì)巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)研究較少。因此,本研究通過(guò)構(gòu)建陽(yáng)離子脂質(zhì)體輔助遞送PER1-小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),進(jìn)而研究PER1對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響,為基于巨噬細(xì)胞極化的腫瘤免疫治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物及細(xì)胞來(lái)源 6～8周齡C57/6J雌性小鼠20只,體質(zhì)量18～20 g,購(gòu)自學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(貴)2023-0001],B16-F10黑色素瘤細(xì)胞和RAW264.7巨噬細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑和儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司),溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基銨(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP)、二油?；柞；掖及?1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇(2000)-琥珀酰胺(DSPE-PEG2000-NHS,西安瑞禧生物技術(shù)有限公司),膽固醇(上海默克化工有限公司),TB Green Premix Ex Taq、TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Trizol試劑(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司),藻紅蛋白-成熟小鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(phycoerythrin-anti-mouse EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1,PE-F4/80)、別藻藍(lán)蛋白-甘露糖受體(allophycocyanin- anti-mannose receptor,APC-CD206;賽默飛世爾科技有限公司),PER1-siRNA以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR detecting,RT-PCR)引物都由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,其他試劑耗材購(gòu)自無(wú)錫耐斯特生物技術(shù)股份有限公司;QuantStudio 3型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(賽默飛世爾科技), 激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司),F-4600熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司),精密酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞提取培養(yǎng)及分組 小鼠飼養(yǎng)于清潔環(huán)境,腹腔注射含5%淀粉的生理鹽水2 mL,連續(xù)3 d,麻醉處死,75%酒精浸泡5 min,置于無(wú)菌超凈臺(tái);去除小鼠腹部皮膚,腹腔注射RPMI-1640培養(yǎng)基5 mL,按摩1～2 min,靜置5 min,回收小鼠腹腔內(nèi)溶液至50 mL離心管;800 r/min離心5 min,棄上清;含10%血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整至合適密度接種至6孔板,置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h;去除懸液,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)溶液清洗6孔板,加完全培養(yǎng)基培養(yǎng),貼壁細(xì)胞即為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞;將等滲鹽酸加入RPMI-1640中,將培養(yǎng)基pH分別調(diào)至6.5、7.3;將1 mol/L乳酸加到pH7.3的RPMI-1640中,使培養(yǎng)基中乳酸的終濃度為20 mmol/L;小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分組設(shè)為pH7.3組、pH6.5組、0.02 mol/L乳酸組,分別加pH7.3、pH6.5、乳酸終濃度為0.02 mol/L的培養(yǎng)基,于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR detecting,RT-PCR)檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中白介素1β(inerleukins-1β,IL-1β)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、ARG-1、VEGF及PER1的表達(dá) 取“1.2.1”項(xiàng)下提取3組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,PBS溶液清洗3次;Trizol試劑提取總RNA,使用微量核酸儀測(cè)定所提取RNA濃度和純度,瓊脂糖膠電泳檢測(cè)RNA降解情況;使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(complementary DNA,cDNA);以此cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s、60 ℃復(fù)性34 s、72 ℃延伸30 s、40個(gè)循環(huán);采用2-ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)量。RT-PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 腹腔巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences for polarization-related genes in peritoneal macrophages

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子IL-10、IL-12、VEGF、TNF-α的分泌量 取“1.2.1”項(xiàng)下3組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,于各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,收集上清液,1 700 r/min離心10 min。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-10、IL-12、VEGF、TNF-α的分泌水平。

1.2.4陽(yáng)離子脂質(zhì)體制備和鑒定 通過(guò)薄膜水合法制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體。首先,稱量DOTAP 1.265 mg、DOPE 1.35 mg、膽固醇0.5 mg、DSPE-PEG2000-NHS(摩爾比為7∶7∶5∶1)0.75 mg充分溶解于氯仿溶液3 mL中,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以60 ℃、120 r/min條件旋蒸1 h,形成脂質(zhì)體薄膜;其次,加無(wú)核酸酶雙蒸水5 mL,超聲水浴儀60℃超聲30 min,置于冰上,超聲探頭超聲水合5 min;最后,使用小型擠壓器按400 nm、200 nm、100 nm的順序通過(guò)聚碳酸酯膜得到單層脂質(zhì)體,置于4℃避光保存。使用無(wú)酶水溶解siRNA,將siRNA與脂質(zhì)體溶液按照1∶10的質(zhì)量比于室溫下震蕩混勻;隨后按照1∶1 000體積比加APC-CD206抗體,室溫避光孵育30 min得到脂質(zhì)體-PER1復(fù)合體(liposome-PER1,Lipo-PER1)陽(yáng)離子脂質(zhì)體。取Lipo-PER1 2 mL按體積比1∶10、1∶100及1∶500加無(wú)菌無(wú)酶雙蒸水稀釋,分別滴加至銅網(wǎng),2%磷鎢酸負(fù)染,室溫通風(fēng)干燥,透射電子顯微鏡于200 KV電壓觀察樣品。PER1-siRNA序列:sense為GACCATTCCCCTATTCGCT,Anti-sense為CTTTATGGCGACCCAACAC。

1.2.5B16-F10黑色素瘤細(xì)胞、RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及共聚焦顯微鏡觀察Lipo-PER1靶向巨噬細(xì)胞 B16-F10黑色素瘤細(xì)胞、RAW264.7巨噬細(xì)胞加入含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的高糖培養(yǎng)基,置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7、B16-F10細(xì)胞按1∶1比例混合并調(diào)整至合適密度,以1∶1 000體積比加PE-F4/80抗體避光孵育30 min;細(xì)胞接種至蓋玻片,加三甲川花菁染料(cyanine 3,cy3)標(biāo)記的Lipo-PER1,加OPTI-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基,置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)6 h,使用共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.6RT-PCR檢測(cè)Lipo-PER1對(duì)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)因子CD86、IL-1β、ARG-1及IL-10表達(dá)的影響 RAW264.7巨噬細(xì)胞接種至6孔板中培養(yǎng),分為空白對(duì)照(Control)組、liposomes(Lps)空白脂質(zhì)體對(duì)照組、Lipo-NC陰性對(duì)照組及Lipo-PER1組,后3組分別加空白脂質(zhì)體、Lipo-NC、Lipo-PER1;加無(wú)血清OPTI-MEM培養(yǎng)基混勻,置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h;更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;PBS溶液清洗3次,Trizol試劑提取總RNA,使用微量核酸儀測(cè)定所提取RNA濃度和純度,瓊脂糖膠電泳檢測(cè)RNA降解情況;使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以此cDNA為模板使用TB Green Premix Ex Taq進(jìn)行RT-PCR檢測(cè);反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s、60 ℃復(fù)性34 s、72 ℃延伸30 s、40個(gè)循環(huán);采用2-ΔΔCt法計(jì)算CD86、IL-1β、ARG-1及IL-10基因的表達(dá)。RT-PCR引物序列見(jiàn)表2。

表2 RAW264.7巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因RT-PCR引物序列Tab.2 RAW264.7 RT-PCR primer sequence of macrophage polarization-related gene

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腹腔巨噬細(xì)胞中ARG-1、VEGF、HIF-1α、PER1 mRNA和蛋白的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果表明(圖1),與pH7.3組對(duì)比,pH6.5組和0.02 mol/L乳酸組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05),ARG-1、VEGF、HIF-1α及PER1mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05);ELISA結(jié)果表明(圖2),相比于pH7.3組,pH6.5與0.02 mol/L乳酸組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-12、TNF-α蛋白水平減少(P<0.000 1),IL-10、VEGF蛋白水平增加(P<0.01)。

注：與pH7.3組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01。

注：與pH7.3組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.0001。

2.2 納米顆粒的表面特征

Lipo-PER1冷凍透射電鏡觀察結(jié)果顯示(圖3),Lipo-PER1是具有明顯雙層膜的類球狀脂質(zhì)體,其粒徑為(113.2±21.03)nm。

注：A為L(zhǎng)ipo-PER1的冷凍透射電鏡圖(12 000×); B為L(zhǎng)ipo-PER1粒徑分布統(tǒng)計(jì)。

2.3 Lipo-PER1轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細(xì)胞

共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示(圖4),Lipo-PER1能夠成功包裹PER1-siRNA(紅色熒光)被RAW264.7巨噬細(xì)胞(綠色熒光)攝取,而黑色箭頭指向B16-F10黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)部無(wú)熒光;RT-PCR結(jié)果表明,與Lipo-NC組相比,Lipo-PER1組RAW264.7巨噬細(xì)胞中PER1 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.000 1)。

注：A為共聚焦顯微鏡觀測(cè)Lipo-PER1靶向RAW264.7巨噬細(xì)胞(600×),綠色熒光為PE-F4/80代表RAW264.7巨噬細(xì)胞,紅色熒光代表Cy3-PER1-siRNA,黑色箭頭指向B16-F10黑色素瘤細(xì)胞;B為RT-PCR檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞中PER1的相對(duì)表達(dá)量;(1)與Lipo-NC組比較,P<0.000 1。

2.4 RAW264.7巨噬細(xì)胞中IL-1β、CD86、ARG-1、IL-10 mRNA和蛋白的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果表明(圖5),與Lipo-NC組相比,Lipo-PER1組RAW264.7巨噬細(xì)胞中IL-1β、CD86mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05或P<0.001),ARG-1、IL-10 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.01或P<0.05);ELISA結(jié)果表明(圖6),與Lipo-NC組相比,Lipo-PER1組RAW264.7巨噬細(xì)胞中TGF-β蛋白表達(dá)增加(P<0.000 1),TNF-α蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。

注：與Lipo-NC比較,(1)P<0.05,(2)P<0.001,(3)P<0.01。

注：與Lipo-NC相比,(1)P<0.05,(2)P<0.0001。

3 討論

巨噬細(xì)胞源自于骨髓中前體細(xì)胞,是先天免疫反應(yīng)中重要成員之一[17]。巨噬細(xì)胞在不同的刺激下改變其表型,如:經(jīng)典途徑激活的巨噬細(xì)胞M1型和M2型[18]。M1巨噬細(xì)胞由輔助性T細(xì)胞1型細(xì)胞因子如干擾素-γ(interferon γ,IFN-γ)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等誘導(dǎo)激活。M1巨噬細(xì)胞能表達(dá)IL-1β、IL-6及TNF-α等細(xì)胞因子,進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用[19]。M2巨噬細(xì)胞由IL-4及IL-13等細(xì)胞因子誘導(dǎo)激活,并通過(guò)表達(dá)M2標(biāo)志分子如TGF-β、VEGF等進(jìn)而抑制炎癥和促進(jìn)傷口愈合[20];腫瘤細(xì)胞的高糖酵解可導(dǎo)致乳酸和H離子積累,并最終形成腫瘤酸性微環(huán)境[21];在缺氧和細(xì)胞外高濃度乳酸的條件下,乳酸可以轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi),通過(guò)不同機(jī)制激活HIF-1α進(jìn)而促進(jìn)TAMs向M2型極化和ARG-1、VEGF的表達(dá)[21]。本研究結(jié)果顯示,乳酸和H離子形成的酸性微環(huán)境能夠上調(diào)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中ARG-1、VEGF、HIF-1α、PER1 mRNA表達(dá),抑制IL-1β mRNA表達(dá),表明酸性微環(huán)境能促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化、抑制M1型極化。這提示PER1可能參與酸性微環(huán)境誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化。PER1是生物鐘機(jī)制的重要組成部分,而生物鐘功能已被證明可以影響巨噬細(xì)胞表型[22];抑制PER1的表達(dá)可上調(diào)由高脂肪飲食誘導(dǎo)的小鼠的脂肪和肝臟組織炎癥中M1型巨噬細(xì)胞占比[23];Xu等[24]發(fā)現(xiàn)通過(guò)上調(diào)PER1的表達(dá),能夠上調(diào)骨髓細(xì)胞中M2巨噬細(xì)胞的占比;Ding 等[25]研究顯示,通過(guò)體外模擬低氧環(huán)境實(shí)驗(yàn)?zāi)苌险{(diào)RAW264.7巨噬細(xì)胞中PER1的表達(dá)。其研究表明PER1能抑制M1巨噬細(xì)胞極化、促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化。本研究結(jié)果也表明,酸性微環(huán)境能上調(diào)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中PER1 mRNA的表達(dá)。在腫瘤微環(huán)境中由于缺氧和異常的糖酵解形成酸性微環(huán)境,這提示腫瘤酸性微環(huán)境可能通過(guò)上調(diào)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中PER1的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PER1對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響,本研究通過(guò)構(gòu)建Lipo-PER1納米顆粒靶向遞送PER1-siRNA,結(jié)果顯示,Lipo-PER1能夠成功靶向RAW264.7巨噬細(xì)胞并下調(diào)PER1 mRNA的表達(dá)。本研究結(jié)果表明,在成功沉默PER1的表達(dá)后,RAW264.7巨噬細(xì)胞中M1標(biāo)志分子CD86、IL-1β mRNA表達(dá)上調(diào),M2標(biāo)志分子ARG-1、IL-10 mRNA表達(dá)下調(diào)。同時(shí),ELISA結(jié)果顯示,相比Lipo-NC組,Lipo-PER1組RAW264.7巨噬細(xì)胞中TGF-β的分泌量上調(diào),TNF-α的分泌量下調(diào)。TGF-β是M2型巨噬細(xì)胞分泌的主要免疫抑制細(xì)胞因子之一。上述結(jié)果提示PER1能促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞M2型極化、抑制M1型極化。

綜上所述,腫瘤酸性微環(huán)境能上調(diào)巨噬細(xì)胞中PER1的表達(dá),進(jìn)而可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化。但本研究還存在一定的局限性,PER1調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化的具體機(jī)制與Lipo-PER1體內(nèi)靶向研究是本課題今后進(jìn)一步的研究方向。