劉磊, 劉美言, 高源1,, 閔潔煜1,, 殷永強, 鐘毅

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 麻醉科, 貴州 貴陽 550001; 2.貴州醫(yī)科大學 麻醉學院, 貴州 貴陽 550004)

膿毒癥是宿主對感染的反應失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙,嚴重時可發(fā)展為膿毒癥休克,甚至死亡[1]。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學修飾,已有研究表明在膿毒癥診療中某些基因的甲基化修飾對患者疾病轉(zhuǎn)歸具有重要作用[2]。在膿毒癥早期炎癥階段,體內(nèi)數(shù)千個基因的表達就已經(jīng)發(fā)生了改變,涉及數(shù)百個基因的DNA甲基化水平也發(fā)生了改變[3-4],這些基因大多與細胞炎癥反應和干擾素(interferon,IFN)信號轉(zhuǎn)導有關,同時還能夠決定T細胞的分化方向[5-6]。Hopp等[7]在對社區(qū)獲得性肺炎患者全血樣本的分析中發(fā)現(xiàn),DNA甲基化在膿毒癥的急性炎癥中起重要作用;新生兒膿毒癥患者中炎癥相關基因的甲基化水平有顯著改變,某些基因的DNA甲基化可作為生物標志物區(qū)分早期和晚期膿毒癥[8]。采用生物信息學分析篩選膿毒癥診斷和預后生物標志物[9],并結合本課題組前期研究,RAS鳥苷酸釋放蛋白1(ras guanyl nucleotide releasing protein 1,RasGRP1)在膿毒癥患者中存在表達差異且甲基化程度高。因此,本研究旨在通過由細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導淋巴細胞炎癥模型,使用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine)與LPS共處理,驗證RasGRP1及其甲基化修飾在LPS誘導淋巴細胞炎癥模型中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株來源 人T淋巴細胞白血病細胞JurkatE6-1(CL-0129),由武漢普諾賽生命科技有限公司提供,由學校轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心保存。

1.1.2主要試劑與儀器 JurkatE6-1細胞專用培養(yǎng)基洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute,RPMI)1640培養(yǎng)基,由武漢普諾賽生命科技有限公司提供;甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2′-脫氧胞苷(美國MedChemExpress公司),脂多糖(北京索萊寶科技有限公司),細胞總RNA、DNA提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司),二喹啉甲酸(bicinchoninicacid,BCA)蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司),DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(北京天根生化科技有限公司),RasGRP1一抗、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)一抗、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases,p-ERK1/2)一抗(武漢ABclonal公司),3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗(武漢三鷹生物技術有限公司),山羊抗兔二抗(英國Abcam公司),實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)第一鏈互補DNA(complementary DNA,cDNA)合成試劑盒、熒光定量試劑盒(上海翌圣生物科技股份有限公司),酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司),乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)測定試劑盒(南京建成生物工程有限公司);酶標儀(美國Thermo Fisher 公司),CFX96實時熒光PCR儀(美國Bio-Rad公司),奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和分組 JurkatE6-1細胞復蘇后使用RPMI-1640培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng);取生長狀態(tài)良好的細胞計數(shù)后接種于培養(yǎng)皿中,細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,使細胞同步化;當細胞生長至融合度達80%左右時傳代并進行后續(xù)實驗;確認細胞生長狀態(tài)良好后,分為對照(完全培養(yǎng)基,C)組、1 mg/L(低濃度)LPS(L1)組、10 mg/L(高濃度)LPS(L2)組及10 μmol/L甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2′-脫氧胞苷+10 mg/L LPS(LA)組。LA組細胞給予10 μmol/L 5-Aza-2′-脫氧胞苷處理4 d,期間每12 h更換含相同濃度5-Aza-2′-脫氧胞苷的完全培養(yǎng)基;C組、L1組及L2組等時等量完全培養(yǎng)基換液4 d。持續(xù)4 d,L1組細胞予1 mg/L LPS處理24 h,L2組和LA組細胞給予10 mg/L LPS處理24 h,C組細胞繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h,1 200 r/min離心3 min,收集細胞、取上清夜,保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化 取“1.2.1”項下處于對數(shù)生長期的JurkatE6-1細胞(5×106個/孔)接種于六孔板,分組及處理同“1.2.1”,置于熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。

1.2.3ELISA法檢測細胞上清液炎癥因子濃度和比色法檢測LDH活性 取“1.2.1”項下處于對數(shù)生長期的JurkatE6-1細胞(5×106個/孔)接種于六孔板,分組及處理同“1.2.1”,參照ELISA試劑盒,使用酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度值,繪制標準曲線,計算腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)濃度;參照LDH測定試劑盒,使用酶標儀測定450 nm處吸光度值,繪制標準曲線,計算LDH活性。

1.2.4RT-qPCR法檢測細胞中總RNA的表達 取“1.2.1”項下處于對數(shù)生長期的JurkatE6-1細胞(5×106個/孔)接種于6孔板,分組及處理同“1.2.1”,參照細胞總RNA提取試劑盒,按照說明書提取細胞總RNA,測定總RNA濃度和純度。按照說明書逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA;使用RT-qPCR試劑盒,按說明書進實驗,擴增條件為95 ℃預變性2 min,95 ℃變性10 s、60 ℃退火延伸30 s、共40個循環(huán);以GAPDH為內(nèi)參,以2-ΔΔCt法計算RasGRP1、ERK1/2、TNF-α、IL-6、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl trans-ferases,DNMT)1、DNMT3a基因mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.2.5Western blotting法檢測細胞RasGRP1、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的表達 取“1.2.1”項下處于對數(shù)生長期的JurkatE6-1細胞(5×106個/孔)接種于六孔板,分組及處理同“1.2.1”,加適量細胞裂解液,充分裂解后4 ℃、12 000 r/min離心10 min,收集上清液,使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度,定量后蛋白質(zhì)經(jīng)95 ℃煮沸10 min變性,-80 ℃冰箱中備用;取待測樣本50 μg于10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,結束后將分離的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF);高效封閉液封閉30 min,加一抗RasGRP1(1∶1 000)、ERK1/2(1∶1 500)、p-ERK1/2(1∶1 000)及GAPDH(1∶2 000),4 ℃孵育過夜;第2天洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶ 6 000)孵育,室溫下輕搖1.5 h,洗膜后于化學發(fā)光法顯色,用紅外成像儀對膜進行掃描;以GAPDH為內(nèi)參,ImageJ軟件進行蛋白灰度值相對定量分析。

1.2.6甲基化特異性PCR(methylating-specific PCR,MSP)法和瓊脂糖凝膠電泳檢測RasGRP1啟動子區(qū)甲基化狀態(tài) 取“1.2.1”項下處于對數(shù)生長期的JurkatE6-1細胞(5×106個/孔)接種于6孔板,分組及處理同“1.2.1”,使用DNA提取試劑盒提取細胞DNA,使用DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒將DNA樣品中非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化胞嘧啶保持不變,因此使用Methyl Primer Express v1.0軟件設計出甲基化引物和非甲基化引物。引物序列如下:RasGRP1非甲基化引物(unmethylation primer,UM)的上游引物序列為5-ATTGTAGTGTTTTGAGTAGTGGTT-3,下游引物序列為5-AAAACAAACTCCCAACTACCA-3;RasGRP1甲基化引物(methylation primer ,M)的上游引物序列為5-GTAGTGTTTCGAGTAGCGGTC-3,下游引物序列為5-AACGAACTCCCGACTACC-3。將經(jīng)過DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒處理后的DNA樣本按照設計好的引物序列進行甲基化特異性PCR,擴增條件:95 ℃ 5 min預變性,94 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s,共35個循環(huán),再以72 ℃擴增5 min。將擴增產(chǎn)物經(jīng)160 V瓊脂糖凝膠電泳25 min,用凝膠成像分析系統(tǒng)對凝膠進行拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學

各組細胞相應處理5 d后,光學顯微鏡結果顯示(圖1),C組JurkatE6-1細胞生長狀態(tài)良好;L1組、L2組使用LPS處理24 h后細胞數(shù)量明顯減少,細胞形態(tài)趨于碎片化,死亡細胞逐漸增加,隨LPS濃度增加而增加;LA組使用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2′-脫氧胞苷預處理4 d、LPS處理細胞24 h后,較L2組細胞數(shù)量及形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。

圖1 各組JurkatE6-1細胞相應處理5 d后明視夜野下細胞數(shù)量及形態(tài)(20×)Fig.1 The number and morphology of JurkatE6-1 cells in each group after 5 days of treatment under bright light field (20×)

2.2 細胞炎癥損傷水平

LPS處理細胞24 h后,ELISA和RT-qPCR結果顯示(表2),與C組比較,L1組細胞上清液LDH活性和TNF-α、IL-6濃度及其mRNA表達升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與L1組比較,L2組細胞上清液LDH活性和TNF-α、IL-6濃度及其mRNA表達升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與L2組比較,LA組細胞上清液LDH活性和TNF-α、IL-6濃度及mRNA表達降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組細胞LDH活性和TNF-α、IL-6濃度及mRNA表達Tab.2 LDH activity, the concentrations and mRNA expression levels of TNF-α and IL-6 in each

2.3 細胞RasGRP1和ERK1/2 mRNA的表達

LPS處理細胞24 h,RT-qPCR結果顯示(表3),與C組比較,L1組細胞RasGRP1 mRNA表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與L1組比較,L2組細胞RasGRP1 mRNA表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與L2組比較,LA組細胞RasGRP1 mRNA表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各組間ERK1/2 mRNA表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 各組細胞RasGRP1和ERK1/2 mRNA的表達Tab.3 mRNA expression levels of RasGRP1 and ERK1/2 in each

2.4 細胞RasGRP1、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的表達

LPS處理細胞24 h,Western blotting結果顯示(圖2),與C組比較,L1組細胞RasGRP1、p-ERK1/2蛋白表達升高(P<0.05),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與L1組比較,L2組細胞RasGRP1、p-ERK1/2蛋白表達降低(P<0.05),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與L2組比較,LA組細胞RasGRP1、p-ERK1/2蛋白表達升高(P<0.05),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各組間ERK1/2 蛋白總量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：A為各組細胞蛋白表達的Western blotting檢測結果;B:各組細胞蛋白表達的定量結果;(1)與C組比較,P<0.05;(2)與L1組比較,P<0.05;(3)與L2組比較,P<0.05。

2.5 細胞DNMT1和DNMT3a mRNA的表達

甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2′-脫氧胞苷預處理4 d,LPS處理細胞24 h后,RT-qPCR結果顯示(表4),與C組比較,L1組DNMT1、DNMT3a mRNA表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與L1組比較,L2組DNMT1、DNMT3a mRNA表達升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與L2組比較,LA組DNMT1、DNMT3a mRNA表達降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 各組細胞DNMT1和DNMT3a mRNA的表達Tab.4 mRNA expressions of DNMT1 and DNMT3a

2.6 RasGRP1啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)

甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2′-脫氧胞苷預處理4 d,LPS處理細胞24 h后,MSP及瓊脂糖凝膠電泳結果顯示(圖3),與C組比較,L1組RasGRP1啟動子區(qū)未檢測到甲基化改變;與L1組比較,L2組RasGRP1啟動子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化表達;與L2組比較,LA組RasGRP1啟動子區(qū)未檢測到甲基化。

注：U為非甲基化引物擴增產(chǎn)物,M為甲基化引物擴增產(chǎn)物。

3 討論

膿毒癥是一種病理生理機制難以闡明的臨床綜合征,現(xiàn)免疫抑制已被公認是膿毒癥患者重要死亡原因之一[10]。近年來,膿毒癥導致的免疫抑制可能比最初的高炎癥反應更能導致死亡率上升,免疫抑制程度較高的基因與死亡率增加相關[11]。在膿毒癥的發(fā)展過程中,淋巴細胞等免疫細胞凋亡可導致免疫功能紊亂,導致對繼發(fā)感染的敏感性增加,促炎反應和抗炎反應失衡,嚴重時可發(fā)展為多器官功能障礙,甚至引起死亡[12-13]。與本研究結果一致,使用LPS處理引起淋巴細胞炎癥損傷,細胞數(shù)量減少,碎片化細胞增多,且隨濃度升高而加重;因此,本研究使用不同濃度LPS誘導JurkatE6-1細胞炎癥模型,探究體外膿毒癥可能的發(fā)病機制。

RasGRP1又稱RAS鳥苷酸釋放蛋白1,是鳥嘌呤核苷酸交換蛋白家族成員之一,主要在T淋巴細胞中表達,通過介導抗原啟動的信號通路激活淋巴細胞中的Ras-Raf-MEK-ERK通路,調(diào)控T細胞激活和發(fā)育[14]。RasGRP1表達異常的患者會出現(xiàn)淋巴細胞功能障礙,而適應性免疫功能受損增加了對各種病原體反復、早發(fā)和嚴重感染的易感性[15]。研究發(fā)現(xiàn),核受體相關轉(zhuǎn)錄因子1(nuclear receptor related 1,Nurr1)通過與RasGRP1基因第二內(nèi)含子中特定位置結合來調(diào)節(jié)LPS誘導的炎癥信號級聯(lián)反應,在轉(zhuǎn)錄水平負向調(diào)節(jié)RasGRP1的表達,在神經(jīng)炎癥中起到抗炎介質(zhì)的作用[16];在自身免疫的患者中,活動性炎癥的嚴重程度與CD4+T細胞中RasGRP1水平降低相關[17]。另外,Guo等[18]在RasGRP1基因敲除小鼠行盲腸結扎穿刺的膿毒癥模型研究中發(fā)現(xiàn),RasGRP1敲除小鼠的IgM抗體分泌和IL-10產(chǎn)生的障礙,且10 d存活率明顯降低,表明RasGRP1基因缺陷增加了小鼠患膿毒癥的敏感性;以上研究表明,RasGRP1與膿毒癥炎癥反應密切相關。與本研究結果一致,JurkatE6-1細胞在低濃度LPS處理后RasGRP1的表達升高;高濃度LPS處理后,RasGRP1表達下降,DNMT1、DNMT3a mRNA的表達升高。不同濃度LPS誘導后RasGRP1表達趨勢相反,可能是低濃度LPS刺激淋巴細胞保護性應激反應使其表達升高,而高濃度LPS刺激細胞導致嚴重的炎癥反應,并可能誘導了RasGRP1啟動子區(qū)高甲基化,基因表達水平受到抑制;為了進一步驗證RasGRP1啟動子區(qū)甲基化改變其及在炎癥反應中調(diào)控作用,本研究使用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2′-脫氧胞苷和LPS共處理JurkatE6-1細胞,使用DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法,將DNA樣品中非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化胞嘧啶保持不變,使用Methyl Primer Express v1.0軟件設計出甲基化引物和非甲基化引物,將硫化后的DNA進行甲基化特異性PCR擴增,并將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RasGRP1啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。

DNA甲基化是指真核生物中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶類將甲基供體S-腺苷甲硫氨酸中的甲基轉(zhuǎn)移到DNA序列中CpG島的胞嘧啶上的過程[19]。在人單核細胞系中,脂多糖刺激導致腫瘤壞死因子啟動子的低甲基化,提高腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)錄水平,促進了炎癥反應[20-21]。Shih等[22]DNMT1抑制劑普魯卡因胺治療內(nèi)毒素休克大鼠的研究顯示,抑制抗炎基因IL27RA的DNA甲基化,對循環(huán)衰竭和多器官功能障礙具有保護作用;Huang等[23]研究表明,DNMT抑制劑5-Aza-2′-脫氧胞苷可抑制膿毒癥性急性肺損傷(acute lung injury,ALI)小鼠炎癥反應和氧化應激;Rump等[24]研究顯示,水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)基因nt-937胞嘧啶位點可與NF-κB結合有關,膿毒癥死亡患者該位點上的甲基化水平明顯高于膿毒癥幸存者。根據(jù)體內(nèi)外研究和現(xiàn)有人類膿毒癥表觀遺傳學研究的數(shù)據(jù)證明,表觀遺傳學修飾可能是膿毒癥發(fā)病機制的核心,DNA甲基化可能是治療膿毒癥和改善器官衰竭的預后靶點。本研究參照文獻[25]方法,使用5-Aza-2′-脫氧胞苷與高濃度LPS同時處理JurkatE6-1細胞,使用MSP法和瓊脂糖凝膠電泳檢測RasGRP1啟動子區(qū)甲基化表達情況,結果顯示,高濃度LPS刺激誘導了細胞RasGRP1啟動子區(qū)高甲基化,甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑預處理逆轉(zhuǎn)了RasGRP1啟動子區(qū)高甲基化,因此RasGRP1及其mRNA表達上調(diào);而細胞培養(yǎng)上清液炎癥因子TNF-α、IL-6濃度以及LDH活性降低,提示細胞炎癥損傷有所減輕。另外,本研究結果表明,細胞p-ERK1/2蛋白表達也隨之上調(diào),ERK1/2總蛋白不受影響,表明RasGRP1可能通過激活MAPK通路,調(diào)節(jié)下游蛋白ERK1/2磷酸化發(fā)揮作用。以上研究結果表明,高濃度LPS刺激細胞的嚴重炎癥反應誘導了RasGRP1啟動子區(qū)高甲基化改變,通過抑制其啟動子區(qū)甲基化,上調(diào)RasGRP1的表達水平,可以減輕細胞炎癥反應,這可能與激活MAPK通路促進ERK1/2磷酸化,調(diào)節(jié)淋巴細胞免疫應答有關,其具體調(diào)節(jié)機制還需深入研究。

綜上所述,本研究結果揭示RasGRP1表達及其啟動子區(qū)甲基化在LPS誘導的JurkatE6-1細胞炎癥模型中可能有調(diào)控作用,甲基化修飾療法可減輕細胞炎癥損傷,并可能通過調(diào)控下游ERK信號通路發(fā)揮作用。