韓 笑,朱 平,卓 倩,李 軍,許 研

(淮安市腫瘤醫(yī)院 淮安市淮安醫(yī)院 1.病理科,江蘇 淮安 223200;2.內(nèi)分泌科)

宮頸癌在世界范圍內(nèi)癌癥發(fā)病率中排名第三,在發(fā)展中國家中是女性最常見的癌癥[1],是我國女性惡性腫瘤第二大死亡原因,嚴(yán)重威脅著女性生命健康。在我國中晚期宮頸癌的5年生存率平均為59.8%,如果癌癥擴散到身體的遠(yuǎn)處,5年生存率僅為17%,但如果能早期發(fā)現(xiàn),干預(yù)治療及時,5年生存率可以達(dá)到90%以上[2]。并且隨著社會發(fā)展,宮頸癌的發(fā)病年齡逐步年輕化,所以“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”在宮頸癌中尤為重要。本文通過對宮頸細(xì)胞DNA倍體定量分析進行初篩,結(jié)合宮頸活檢病理組織學(xué)檢查及P16免疫組織化學(xué)染色檢查,旨在為宮頸癌早期發(fā)現(xiàn)提供有意義的初篩方法。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2020年3月～2021年3月淮安市腫瘤醫(yī)院的門診及住院患者,進行宮頸細(xì)胞DNA倍體分析檢查4 334例為研究對象,年齡19～74歲,平均46.5歲。所有患者均在知情同意情況下進行,并通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1宮頸細(xì)胞DNA倍體定量分析:宮頸取材患者采取截石位,用無菌棉球拭去宮頸口分泌物,使用宮頸取樣刷沿宮頸管順時針旋轉(zhuǎn)5圈以上,然后將刷頭放入細(xì)胞保存液瓶中。將放有刷頭的細(xì)胞保存液送至本院病理科,由本院病理科技術(shù)人員將標(biāo)本瓶放到振蕩器上,振蕩5～10 s。然后離心制片經(jīng)Feulgen染色后,由全自動高分辨率細(xì)胞DNA圖像定量分析Motic系統(tǒng)進行掃描分析篩選,細(xì)胞核DI(DNA index)值≥2.5為倍體異常。

1.2.2活檢組織病理學(xué)檢查:陰道鏡下對倍體細(xì)胞數(shù)≥3個的女性進行宮頸活組織檢查,送至本院病理科,用4%的中性甲醛固定4～6 h后,由病理科診斷人員對送檢標(biāo)本取材,后放入全自動脫水機進行脫水、浸蠟,病理科技術(shù)人員對浸蠟后組織進行包埋、切片、脫蠟、染色等步驟后制成組織HE切片,由具有高級職稱的病理科診斷醫(yī)師閱片、判讀、發(fā)出病理診斷報告。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色:病理技術(shù)人員將包埋好的組織蠟塊連續(xù)切片2張,厚度為3 μm,免疫組織化學(xué)染色采用SP法檢測P16蛋白的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色按試劑盒說明進行,用PBS緩沖液作為一抗,作為陰性對照;用已知的陽性片作為陽性對照。P16抗體、SP試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。由具有高級職稱的病理科診斷醫(yī)師閱片、判讀,發(fā)出報告。

1.3結(jié)果判定

1.3.1DNA倍體異常細(xì)胞:0個:未見DNA倍體異常細(xì)胞,定期復(fù)查;1～2個:可見少量DNA倍體異常細(xì)胞,4～6個月復(fù)查;≥3個:可見DNA倍體異常細(xì)胞,臨床陰道鏡檢查及活體組織檢查。有病理科醫(yī)師將假陽性細(xì)胞進行去偽存真,保留真異常細(xì)胞。

1.3.2宮頸活檢組織病理學(xué)檢查:分為宮頸慢性炎(見挖空細(xì)胞、伴儲備細(xì)胞增生和或腺體鱗化)、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN1、CIN2、CIN3)或伴累及腺體、宮頸癌(鱗狀細(xì)胞癌和腺癌)。

1.3.3P16蛋白表達(dá):于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)。光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)里呈現(xiàn)棕黃色顆粒,根據(jù)著色程度分別計0分、1分、2分、3分。陽性細(xì)胞<10%計0分,10%～25%計1分,25%～50%計2分,>50%計3分。綜合判定取著色強度和陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分值之積:0分為陰性,計為(-);1分以上為陽性,其中1分、2分計為(+),3分、4分計為(),6～9分計為()?！?～”均記作陽性(+)。所有切片由本院病理科具有高級職稱病理診斷醫(yī)師進行閱片、判讀。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行χ2檢驗。

2 結(jié)果

檢測分析4 334例中發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞1～2個有140例,異常細(xì)胞≥3個有202例。202例進行宮頸活檢病理組織學(xué)(圖1)發(fā)現(xiàn)150例為CIN1以上,同時對活檢202例進行P16蛋白染色(圖2)發(fā)現(xiàn)隨著病變級別增高,P16表達(dá)百分比也隨之上升,通過χ2檢驗發(fā)現(xiàn)P16蛋白在宮頸上皮內(nèi)瘤變中表達(dá)有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.889,P=0.003)。見表1。

表1 DNA倍體異常細(xì)胞≥3個宮頸活檢組織學(xué)與P16染色結(jié)果(n)

圖1 宮頸活檢病理組織學(xué)(HE,×400)

圖2 P16在宮頸活檢組織中的表達(dá)(DAB,×400)

3 討論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤,我國每年新增宮頸癌約13.15萬例,占世界宮頸癌新發(fā)總數(shù)的1/3[3],而且死亡率居高不下。宮頸癌的治療方法包括手術(shù)切除、放化療等,對于中晚期患者不建議手術(shù)治療;早期患者,結(jié)合患者情況采取手術(shù)切除,輔以放化療;對于癌前期病變即CIN,可以結(jié)合患者情況行宮頸錐切或子宮全切。早發(fā)現(xiàn)、早治療,可以大大提高患者的生存質(zhì)量及生存率,所以宮頸癌的預(yù)防及早期發(fā)現(xiàn)尤為重要。宮頸癌的成功預(yù)防、診斷和臨床管理在很大程度上依賴于早期篩查[4]。細(xì)胞學(xué)檢查是較常用、創(chuàng)傷小、方便快捷的檢查方法。相比其他細(xì)胞學(xué)篩查,宮頸細(xì)胞DNA倍體定量分析有其特有的優(yōu)勢,如智能分析、結(jié)果客觀、靈敏度和特異性高等。

在生理情況下,DNA的復(fù)制是處于相對靜止的狀態(tài),含量相對穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞受到致癌因素的作用,處于增殖甚至異常增殖時,DNA的含量甚至結(jié)構(gòu)都會發(fā)生改變。DNA含量的變化可以作為腫瘤細(xì)胞異常增殖的一項重要的生物學(xué)指標(biāo),鑒于癌變或者有癌變傾向的細(xì)胞內(nèi)核酸含量會發(fā)生異常增生,且核酸含量的變化早于細(xì)胞形態(tài)的變化,所以DNA倍體定量分析技術(shù)被發(fā)明及廣泛應(yīng)用于宮頸癌早期篩查[5]。

宮頸細(xì)胞DNA倍體定量分析主要是通過對細(xì)胞核內(nèi)DNA含量的測定,來判斷細(xì)胞的生理狀態(tài)、病理改變[6]。對細(xì)胞進行特殊染色,細(xì)胞核DNA著色后,細(xì)胞核染色強度與其含量會成正比,利用全自動DNA圖像分析系統(tǒng)可以分析每個細(xì)胞核內(nèi)DNA的積分光密度值(IOD),檢測其含量的變化,且按細(xì)胞DNA含量由高到低自動排序,將核酸含量DI值≥2.5的用紅色字體標(biāo)記,方便識別,并用DNA直方圖、散點圖來顯示標(biāo)本的惡性程度。細(xì)胞的惡變首先會出現(xiàn)染色質(zhì)的改變,出現(xiàn)異倍體細(xì)胞核,如不及時干擾最終發(fā)生癌變[7],宮頸細(xì)胞也不例外,當(dāng)發(fā)生病變時,首先會產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞,即異倍體細(xì)胞,從而被系統(tǒng)識別。DNA倍體定量分析技術(shù)是基于以上理論基礎(chǔ),所以該項技術(shù)在發(fā)現(xiàn)宮頸CIN方面要較常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查更為靈敏。本研究中發(fā)現(xiàn)的202例異常倍體細(xì)胞≥3個,活檢病理組織學(xué)證實有150例為CIN1以上,陽性率達(dá)74%,相對于其他宮頸細(xì)胞學(xué)檢查陽性率要高。宮頸細(xì)胞DNA倍體定量分析技術(shù)由于快速、準(zhǔn)確、客觀、創(chuàng)傷小等優(yōu)點,可以作為宮頸癌篩查的有效方法。

P16又叫MTS基因,是美國科學(xué)家Kamb等發(fā)現(xiàn)的抗癌基因,位于人類染色體9p21上,是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控因子,其所表達(dá)的P16蛋白是一種腫瘤抑制蛋白,可以直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控,被喻為細(xì)胞周期中的剎車裝置,一旦P16這個剎車裝置失靈,會引起細(xì)胞惡性增殖,導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。P16蛋白表達(dá)的改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8]。在正常細(xì)胞中的表達(dá)較低,而當(dāng)細(xì)胞增殖失控時,P16蛋白表達(dá)被激活,抑制細(xì)胞增殖[9]。P16蛋白激活后會結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6 (CDK4/6),抑制細(xì)胞周期蛋白D1和CDK4/6的結(jié)合,進而阻止視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白的磷酸化,并最終將細(xì)胞增殖阻止在細(xì)胞周期的G1期,從而減緩細(xì)胞生長[10]。Peter等[11-12]發(fā)現(xiàn)P16蛋白的異常表達(dá)與胰腺癌、食管癌、肺癌等關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示P16蛋白的表達(dá)隨著CIN級別的增高其表達(dá)亦增高。

當(dāng)宮頸發(fā)生病變時,CIN的演變是不可預(yù)測的[13]。對生物標(biāo)志物的分析可能有助于確定病變的進展或消退,而P16蛋白的免疫染色表達(dá)是被證實有用的,尤其對于宮頸高級別病變的診斷,意義更大[14]。陳春麗等[15]已經(jīng)證實P16蛋白在宮頸癌篩查中有意義。LAST指南也推薦了組織學(xué)判讀后四種需要應(yīng)用P16染色檢查的情況,其中對CIN1、CIN2、CIN3,尤其是病理專家考慮到CIN2診斷時,推薦使用P16免疫組化染色輔助判讀;而當(dāng)細(xì)胞學(xué)判讀結(jié)果和病理組織學(xué)不一致,細(xì)胞學(xué)診斷為高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、意義不明的非典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)等,活檢標(biāo)本組織學(xué)被診斷為CIN1及以下病變,也推薦使用P16免疫組化染色檢測作為一種輔助的形態(tài)學(xué)評估指標(biāo)。

宮頸癌篩查的目的是發(fā)現(xiàn)CIN1以上病變,能夠及時干預(yù)治療。理想的宮頸癌篩查手段應(yīng)該是在提高細(xì)胞學(xué)檢測敏感性的同時,能夠不損失其特異性,或者可以通過客觀的生物標(biāo)志物,標(biāo)記出高級別病變的細(xì)胞,以輔助細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果的判讀和診斷。本文正是通過細(xì)胞DNA倍體定量分析篩查出陽性病例,活檢后組織病理學(xué)檢查與P16蛋白免疫染色結(jié)合起來,旨在提高檢出率,為宮頸癌篩查提供更有意義的方法,為宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)提供更多的思路。