蔡秀英,曾慧意,葉萍萍

(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬泉州市正骨醫(yī)院小兒骨科,福建 泉州 362000)

骨肉瘤(OS)又名成骨肉瘤,是兒童和青少年時期最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一,其發(fā)病率2～4人/(年·百萬人),是一種致命的惡性腫瘤,5年生存率為50%～65%[1]。發(fā)生于青少年的OS,具有轉(zhuǎn)移能力強、預(yù)后差的特點,是導(dǎo)致青少年死亡的第二大病因,也是青少年因病致殘最常見的原因之一[2]。盡管20世紀70年代末隨著新輔助化療的應(yīng)用使OS生存率得到大幅度提高,但仍有20%～30%患者需要接受截肢治療,因此OS是一種預(yù)后較差的惡性腫瘤[3]。高遷移率族核小體結(jié)合蛋白 3(HMGN3)是高遷移率族蛋白N(HMGN)家族中的一員,研究表明HMGN可能密切參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并與惡性腫瘤的預(yù)后有關(guān)[4]。目前 HMGN3在腫瘤中的研究較少,一些研究表明HMGN3 mRNA在乳腺癌中的表達水平上調(diào);而在子宮內(nèi)膜癌中的表達水平被下調(diào),說明HMGN3在不同腫瘤中可能具有不同的作用[5]。目前HMGN3在骨肉瘤中的表達狀態(tài)及其預(yù)后價值尚未被報道,本研究擬從GEO數(shù)據(jù)庫篩選OS表達芯片,并結(jié)合隨訪資料進行預(yù)后分析,以探討HMGN3在骨肉瘤中的表達狀態(tài)及預(yù)后。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源及篩選:以“Osteosarcoma”作為關(guān)鍵詞在GEO公共數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并獲取相關(guān)基因表達譜數(shù)據(jù)。最終確定了GSE12865、GSE14359、GSE21257三個數(shù)據(jù)集作為數(shù)據(jù)分析來源。其中,GSE12865數(shù)據(jù)集是基于GPL6244平臺獲得的測序數(shù)據(jù),包含了12例OS樣本和2例正常人成骨細胞(HOB)樣本的基因表達數(shù)據(jù)[6]。GSE14359數(shù)據(jù)集是基于GPL96平臺獲得的測序數(shù)據(jù),包含10例原發(fā)骨肉瘤組織、8例骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織和2例HOB樣本[7]。GSE21257數(shù)據(jù)集是GPL10295平臺獲得的測序數(shù)據(jù),包含53例OS長期隨訪信息[8]。

1.2差異表達分析(DEA):利用R軟件中的limma軟件包,分別對GSE12865、GSE14359芯片的骨肉瘤樣本和正常對照樣本進行DEA,分別提取HMGN3基因的DEA結(jié)果,根據(jù)LogFC絕對值>1和校正P值(FDR)<0.05判斷HMGN3基因表達狀態(tài)。

1.3預(yù)后分析(PA):使用R軟件中的“survival”和“survminer”兩個包進行預(yù)后分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理:采用R 4.2.0軟件中的“l(fā)imma”包進行差異基因表達分析,采用“survival”和“survminer”包等進行生存分析。三組計量資料采用單因素方差分析。Kaplan-Meier 法繪制生存曲線。COX比例風(fēng)險回歸模型用于評價HMGN3基因不同表達狀態(tài)的預(yù)后價值,以風(fēng)險比(HR)作為主要效應(yīng)指標。

2 結(jié)果

2.1HMGN3基因差異表達分析結(jié)果:GSE12865、GSE14359兩個數(shù)據(jù)集中,HMGN3基因均呈現(xiàn)高表達狀態(tài),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 HMGN3基因差異表達分析結(jié)果

2.2HMGN3基因的預(yù)后分析:HMGN3基因高表達組1年、3年、5年生存率分別為89.66%、50.98%、45.90%,而低表達組分別為95.83%、83.33%、74.56%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線見圖1。HMGN3基因高表達患者死亡風(fēng)險為HR=2.58,95%CI=(1.07,6.22),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 HMGN3基因在骨肉瘤中的生存曲線圖

2.3不同轉(zhuǎn)移狀態(tài),HMGN3基因的表達結(jié)果:GSE21257數(shù)據(jù)集中,根據(jù)是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移發(fā)生的時間,將53例樣本分為無轉(zhuǎn)移(19例)、初診時轉(zhuǎn)移(14例)以及后期轉(zhuǎn)移(20例),無轉(zhuǎn)移組HMGN3基因表達水平為14.73±3.17,初診時轉(zhuǎn)移組HMGN3基因表達水平為24.13±14.21,后期轉(zhuǎn)移組HMGN3基因表達水平為19.03±9.25。三組患者HMGN3基因的表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.021,P<0.05),其中初診時發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者,其HMGN3基因的表達水平最高。

3 討論

OS是青少年時期最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤,也是目前人類異質(zhì)性最高、預(yù)后較差的實體腫瘤之一。OS在腫瘤確診早期即有可能發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,因此,其病死率高且預(yù)后較差[2]。OS具有高度異質(zhì)性,這種異質(zhì)性不僅表現(xiàn)在病理學(xué)層面,而且還表現(xiàn)在基因組、轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳水平上[9]。有研究表明,不同臨床表型的OS,其基因表達譜存在顯著差別[10]。OS可以發(fā)生于任何年齡,但以青少年人群發(fā)病率最高,其發(fā)生發(fā)展機制尚不明確[11]。轉(zhuǎn)錄組測序為探索OS腫瘤異質(zhì)性以及腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用提供了強有力的手段。近年來,GEO數(shù)據(jù)庫的微陣列數(shù)據(jù)的共享,為揭示各類疾病發(fā)生發(fā)展的機制提供了便利[12]。

HMGN家族成員廣泛存在于真核生物的細胞中,是含量最為豐富的非組蛋白家族,廣泛參與細胞發(fā)育和細胞分化的調(diào)節(jié)[13]。研究表明,HMGN家族成員與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。如HMGN1參與小鼠肝癌的發(fā)生過程,并引起癌細胞表觀遺傳變化[15]。HMGN2 通過抑制連接組蛋白 H1與染色質(zhì)調(diào)節(jié)區(qū)的結(jié)合,繼而增強了STAT5對啟動子的調(diào)控,最終促進乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[16]。HMGN4也被證明參與了乳腺癌惡性行為的轉(zhuǎn)化[17]。HMGN5通過FGF/FGFR信號通路促進直腸癌的增殖和侵襲[18]。HMGN3是HMGN家族的成員之一,主要功能是調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)并通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[19]。HMGN3與多種癌癥的發(fā)展有關(guān),然而其潛在機制仍不清楚。Sorin等[20]發(fā)現(xiàn),HMGN3的高表達與肝吸蟲感染誘導(dǎo)的膽管癌(CCA)的轉(zhuǎn)移特性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),膽管癌細胞中HMGN3的敲除顯著降低了集落形成、遷移和侵襲的致癌能力。研究顯示,HMGN3抑制CCA細胞中上皮調(diào)節(jié)基因(如CDH1/E-cadherin和TJAP1基因)的表達并阻斷其胞內(nèi)極性。染色質(zhì)免疫沉淀測序分析顯示,HMGN3通過與轉(zhuǎn)錄因子SNAI2結(jié)合并抑制上皮調(diào)節(jié)基因的表達,也可能通過抑制組蛋白脫乙酰酶(HDACs)抑制上皮調(diào)節(jié)因子重新激活,導(dǎo)致細胞遷移能力受損。因此,HMGN3過度表達通常以依賴于SNAI2基因和HDACs的方式抑制CCA細胞中上皮調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄并阻斷其極性,從而提升了CCA細胞的致癌特性。目前HMGN3的生物學(xué)作用還有待繼續(xù)探索。

本研究提示HMGN3基因參與了OS的疾病發(fā)生過程。Su等[21]研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌細胞中HMGN3 mRNA的表達水平比正常乳腺細胞上調(diào),提示其可能與乳腺癌發(fā)生相關(guān)。李迎春[22]在肺癌中研究發(fā)現(xiàn),與正常癌旁組織相比,肺癌組織HMGN3基因表達水平顯著升高,并參與了肺癌的惡性行為,如促進遷移、侵襲及 EMT 過程。上述研究表明,HMGN3 是重要的致癌基因[23]。Zierau等[24]通過在小鼠子宮內(nèi)膜癌細胞株研究發(fā)現(xiàn),HMGN3在子宮內(nèi)膜癌中表達下調(diào),但這種低表達可能受miR-203表達調(diào)控,其具體機制還有待進一步研究。

目前關(guān)于HMGN3基因在惡性腫瘤中的預(yù)后價值尚未得到學(xué)者的報道,因此有必要開展研究探索HMGN3基因的預(yù)后價值。本研究提示,HMGN3基因是重要的癌基因,與其致癌特性相符,HMGN3基因參與了OS的發(fā)展過程。本研究為進一步開展免疫組化等檢查等驗證HMGN3基因在OS中的生物學(xué)作用提供了研究方向。

綜上,HMGN3基因在OS中呈高表達狀態(tài),而且HMGN3基因高表達對OS患者的預(yù)后具有顯著影響,但其具體機制,還需要進一步探索。