劉 靜

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤婦科,安徽 蚌埠 233000)

宮頸癌被認(rèn)為是影響女性生育能力的重要疾病,其發(fā)病率極高。宮頸癌是一種危害性極大的惡性腫瘤,在發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)的發(fā)病率和死亡率均高于其他癌癥,排名第四位。近10年來(lái)歐美主要國(guó)家采取的宮頸癌初篩、陰道鏡檢查和組織病理學(xué)檢查三步法顯著降低了宮頸癌的死亡率[1]。而且人乳頭瘤病毒(HPV)預(yù)防疫苗的使用也取得了顯著的效果,進(jìn)一步減少了宮頸癌的發(fā)病率。雖然宮頸癌的診斷和治療取得了一定的進(jìn)展,但它仍然是我國(guó)女性生命安全的潛在威脅之一。2022年宮頸癌新增11.93萬(wàn)例,死亡3.19萬(wàn)例,根據(jù)國(guó)家癌癥中心公布的數(shù)據(jù),宮頸癌呈年輕化趨勢(shì),目前我國(guó)宮頸癌初篩方案是細(xì)胞學(xué)和高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)檢測(cè)單獨(dú)或聯(lián)合檢測(cè)。近年來(lái),液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,它不僅提高了細(xì)胞學(xué)檢查的精度,而且還能夠更有效地檢測(cè)到未明顯的非典型鱗狀上皮細(xì)胞[2],盡管目前全球范圍內(nèi)的宮頸癌篩查方法學(xué)依舊采用巴氏涂片(TBS),但液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛,它可能會(huì)提高檢測(cè)的靈敏度,從而更好地預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。由于細(xì)胞學(xué)診斷的準(zhǔn)確率受到50%～70%的影響,由于每位細(xì)胞病理師的個(gè)體差異,導(dǎo)致他們的準(zhǔn)確率往往會(huì)受到影響,從而使得子宮頸癌和更嚴(yán)重的疾病的發(fā)現(xiàn)率更高,因此,許多醫(yī)院會(huì)采取措施來(lái)減少這種漏檢的情況,如通過(guò)陰道鏡和活檢來(lái)確定疾病的類型。美國(guó)陰道鏡與宮頸病理學(xué)會(huì)建議,當(dāng)發(fā)現(xiàn)有低度磷狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)等病理改變時(shí),應(yīng)盡快采取陰道鏡檢查,以確定病理的程度以及是否存在不典型的病理。當(dāng)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)顯示ASCUS,則應(yīng)該考慮對(duì)HR-HPV感染的檢測(cè),并在半年之內(nèi)接受細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)。若HPV呈陽(yáng)性,則應(yīng)該接受陰道鏡檢查,若未能得出準(zhǔn)確的診斷,則應(yīng)該及時(shí)前往醫(yī)院接受宮頸癌細(xì)胞學(xué)檢查。研究發(fā)現(xiàn),超過(guò)九成的女性都曾被HPV病毒所侵襲,但其中絕大多數(shù)只是暫時(shí)性的,未必會(huì)發(fā)展成癌癥。其中,HR-HPV類型有八種,即16、18、31、33、35、45、52、58,其中HPV16和HPV18的陽(yáng)性率高達(dá)76%,研究表明,HPV的長(zhǎng)期感染會(huì)導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。然而,陰道鏡并不能確定是否感染HPV。在這種方法中,高危型非HPV16/18型別感染者可能會(huì)出現(xiàn)ASCUS或更高的類型。隨著中國(guó)政府采取措施,將HPV感染的風(fēng)險(xiǎn)降到最低,但這種做法仍然導(dǎo)致許多女性因HPV感染引發(fā)的焦慮,從而導(dǎo)致她們不斷地尋找治療方案,從而增加了對(duì)于醫(yī)療資源的消耗和經(jīng)濟(jì)壓力。根據(jù)流行病學(xué)研究,許多女性一生中都曾經(jīng)感染過(guò)HPV,但只有10%的人會(huì)持續(xù)感染,進(jìn)而轉(zhuǎn)化成宮頸癌。這說(shuō)明宮頸癌的形成與許多原因有關(guān),如基因變異和遺傳性易感突變,應(yīng)該盡力采取措施來(lái)防止宮頸癌的進(jìn)一步惡變[3]。近期的全球范圍內(nèi)的臨床試驗(yàn)表明,子宮頸癌基因的甲基化水平高度增加會(huì)導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生,特別是PAX1配對(duì)盒基因1的甲基化水平增加會(huì)導(dǎo)致子宮頸鱗癌的發(fā)生。許多實(shí)踐結(jié)果表明,PAX1基因甲基化水平的檢測(cè)可以作為多種預(yù)防措施的一部分,因此,本研究旨在探索PAX1基因甲基化水平對(duì)于宮頸病變的早期發(fā)現(xiàn)、早期預(yù)防乃至早期治療的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2021年1月～2021年12月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受治療的150例HPV感染患者為研究對(duì)象,根據(jù)疾病類型和FIGO的臨床評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)將他們劃分成四組:對(duì)照組48例,低級(jí)別上皮內(nèi)瘤樣變組38例,高級(jí)別上皮內(nèi)瘤樣變(HGCIN)組35例和癌變(ICC)組29例。對(duì)照組的平均年齡為(35.6±2.1)歲,LGCIN組的平均年齡為(38.5±2.1)歲,HGCIN組的平均年齡為(37.7±1.4)歲,ICC組的平均年齡為(37.2±2.5)歲。四組患者的一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡21歲以上女性;②有性生活史;③深入了解研究流程,已簽署ICF,并且完成了所有相關(guān)手續(xù);④經(jīng)過(guò)多種檢測(cè)方法,包括HR-HPV、TCT和PAX1基因甲基化,取得了良好的結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn):①對(duì)于那些曾患有宮頸癌前期病變或其他女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的患者,建議進(jìn)行治療以改善病情;②臨床標(biāo)本項(xiàng)目缺失;③已接種過(guò)HPV疫苗者;④孕產(chǎn)婦及哺乳期女性;⑤已行子宮全切術(shù)。

1.2方法

1.2.1宮頸標(biāo)本采集:患者取截石位,以常規(guī)消毒、鋪巾,取出宮頸病變部位細(xì)胞制備宮頸刮片,然后使用標(biāo)準(zhǔn)的消毒劑和清潔劑來(lái)清潔病變區(qū)域。之后,醫(yī)生會(huì)在陰道鏡下行宮頸病變處活檢,并對(duì)其進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。最后,通過(guò)HPV檢測(cè)將樣本放置在低溫環(huán)境中。經(jīng)過(guò)精心的宮頸刮片和PAX1病理學(xué)檢查,可以準(zhǔn)確檢測(cè)ACKPAX1基因的甲基化水平。

1.2.2宮頸DNA提取、化學(xué)修飾與擴(kuò)增:分別提取出宮頸DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后安排進(jìn)行PAX1基因轉(zhuǎn)錄(參照德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)試劑盒說(shuō)明書(shū)),PAX1基因外側(cè)上游引物、外側(cè)下游引物:5′-AAGTTGATTTAGGGTTTGGGG-3′、5′-ACCCAGCTCATCCACACTCCC-3′。PAX1基因上游引物、下游引物:5′-GTGGAGACTGTGTCGGGAGGG-3′、5′-AAATACCCRAGACTAAACGC-3′。使用生物素來(lái)檢測(cè)引物5′末端。

1.2.3焦磷酸DNA測(cè)序:根據(jù)焦磷酸測(cè)序儀的甲基化標(biāo)準(zhǔn),可以制作出單鏈DNA模板,并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。目的基因用引物(5′-GGAGGTAGGTTTTGGAG-3′)測(cè)PAX1基因9個(gè)胞嘧啶、磷酸、鳥(niǎo)嘌呤,經(jīng)過(guò)PAX1基因測(cè)序可以準(zhǔn)確地反映出每一個(gè)樣本基因在特定檢測(cè)位點(diǎn)上的甲基化程度。通過(guò)使用焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以精確測(cè)定 9 個(gè)特定的靶基因的甲基化水平。該試劑盒包含內(nèi)部 DNA。在樣本分析中,通過(guò)觀察每個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平來(lái)衡量它在內(nèi)部數(shù)據(jù)集上的分布情況,這種方法可以用來(lái)估算每個(gè)位點(diǎn)的甲基化程度。

1.3觀察指標(biāo):通過(guò)4組組織檢查,研究HPV感染的概率以及PAX1基因甲基化的程度;同時(shí)通過(guò)宮頸刮片檢查,評(píng)估PAX1基因甲基化的程度;最后通過(guò)跟蹤觀察,探究四組患者的預(yù)后。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)與方差分析。

2 結(jié)果

2.1四組宮頸組織中HPV陽(yáng)性率與PAX1基因甲基化發(fā)生率比較:通過(guò)觀察四組組織樣本,可以看出HPV陽(yáng)性率和PAX1基因甲基化的情況有所不同。經(jīng)過(guò)四組組織的研究,HPV陽(yáng)性率和PAX1基因甲基化水平各組間差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 四組病變組織中HPV陽(yáng)性率與 PAX1 基因甲基化發(fā)生率比較[n(%)]

2.2四組宮頸刮片和宮頸組織中PAX1基因甲基化水平比較:通過(guò)四組宮頸刮片檢查,發(fā)現(xiàn)PAX1基因在組織細(xì)胞內(nèi)的甲基化水平存在顯著差異(P<0.05)。經(jīng)過(guò)四組宮頸刮片檢查及組織分析,發(fā)現(xiàn)PAX1基因甲基化水平存在顯著的變化,其變化程度具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而癌變組的PAX1基因的甲基化水平則要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)正常組、低級(jí)別組及高級(jí)別組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 四組宮頸刮片檢查PAX1基因在組織樣本甲基化程度

3 討論

在臨床實(shí)踐中,宮頸癌的發(fā)現(xiàn)通常需要數(shù)年或數(shù)10年的時(shí)間。在這段時(shí)間中宮頸癌的初期表現(xiàn)通常并不突出,直到它的嚴(yán)重程度增強(qiáng)才會(huì)被診斷出來(lái)。根據(jù)過(guò)去的研究,宮頸癌變進(jìn)程涉及許多遺傳和調(diào)節(jié)基因機(jī)制,當(dāng)中DNA甲基化變化尤為突出[4]。這種變化會(huì)引起基因調(diào)控遺傳的突變,從而影響基因功能,并有助于宮頸癌的形成和惡化。在宮頸癌患者體內(nèi),65%～95%的樣本都會(huì)出現(xiàn)DNA甲基化變化。因而,基因甲基化技術(shù)可以被用來(lái)對(duì)宮頸脫落細(xì)胞和宮頸組織進(jìn)行活體檢查,從而幫助醫(yī)生更準(zhǔn)確地識(shí)別和預(yù)防宮頸癌[5]。

隨著最新的診斷技術(shù)、細(xì)胞學(xué)研究的進(jìn)步以及HPV的大規(guī)模應(yīng)用,宮頸癌的早期癥狀已經(jīng)得到了有效的檢測(cè)與治療,從而大大減少了宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)率。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,感染HPV的人并不總是會(huì)患上癌癥,這暗示著可能存在其他潛在的危險(xiǎn)因素,可能會(huì)加速宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。隨著基因和蛋白質(zhì)水平的變化,一種新的、具有特異性的檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)了。最新的研究顯示,癌癥患者的基因表達(dá)異常可能會(huì)對(duì)他們的健康造成嚴(yán)重的危害,包括影響細(xì)胞的增殖和分裂;此外,異常的甲基化也有可能導(dǎo)致抑制癌癥的基因的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的形成。根據(jù)最新的研究結(jié)果,PAX1基因的甲基化水平顯著升高[6]。這種變化與宮頸癌的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),而且宮頸癌患者的脫落細(xì)胞也能夠發(fā)現(xiàn)這種甲基化的存在。最新的研究發(fā)現(xiàn),PAX1基因的陽(yáng)性甲基化水平可以作為宮頸癌的重要指示因素,它可以幫助醫(yī)生更準(zhǔn)確地識(shí)別宮頸癌的類型以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況,從而為宮頸癌的早期診斷提供依據(jù)。當(dāng)前許多研究都集中于定性檢測(cè)PAX1基因的甲基化狀態(tài),但這種方法很難準(zhǔn)確地量化和評(píng)估這一狀態(tài)。

根據(jù)過(guò)去的研究,PAX1基因的甲基化能夠提高宮頸癌的早期識(shí)別能力,研究表明,通過(guò)PAX1基因的甲基化能夠更精細(xì)的檢測(cè)脫落細(xì)胞以及活體組織,甚至能夠替代50%的陰道鏡檢查[7]。研究表明PAX1基因甲基化的水平能夠作為宮頸癌的一種有效的預(yù)防措施,它能夠有效地將CIN2病變與正常組織的差異降低到0.66,而將CIN3病變的差異降低到0.77,將CIN3病變的差距縮小到0.92,并且能夠有效地降低ROC曲線的下降幅度,從而提高宮頸癌的預(yù)防效果,這種方法的診斷效果非常好。

研究發(fā)現(xiàn),結(jié)合細(xì)胞學(xué)和病毒學(xué)的雙重技術(shù),構(gòu)建一個(gè)完善的宮頸癌篩查體系,能夠有效降低宮頸癌的發(fā)生概率。相比于傳統(tǒng)的陰道鏡檢測(cè),這種雙重技術(shù)更具有靈活性和準(zhǔn)確性,能夠有效減少患者的就醫(yī)次數(shù),從而極大地改善宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療效果。

在中國(guó)的宮頸癌患者中,ASC-US和非16/18型HR-HPV均呈陽(yáng)性,這種情況非常普遍,并且需要進(jìn)行多次的跟蹤治療,這將消耗大量的資源。宮頸癌仍然是一個(gè)嚴(yán)重的健康問(wèn)題,由于人口眾多、區(qū)域性醫(yī)療資源匱乏、衛(wèi)生知識(shí)普及程度較低、規(guī)范的治療方案實(shí)施困難以及專業(yè)讀片醫(yī)師的短缺,使得宮頸癌的發(fā)病率和死亡率都在不斷上升,而且這種情況很難得到有效的緩解。雖然“兩癌”的篩選工作受到了政府的高度重視,但目前還無(wú)法達(dá)到持久而有效的結(jié)果。根據(jù)北京大學(xué)人民醫(yī)院的一項(xiàng)最新研究,超過(guò)一半的宮頸癌患者沒(méi)有接受宮頸癌篩查,這說(shuō)明宮頸癌的預(yù)防和控制仍處于初級(jí)階段。

綜上,通過(guò)對(duì)宮頸癌高危人群的定量研究,發(fā)現(xiàn)PAX1基因甲基化的存活率和定量水平都很高。這種定量技術(shù)具有高靈活性和高準(zhǔn)確性,能夠作為臨床診斷的重要參考。