吳敏 瞿怡倩 黃蘇敏

摘要 目的：觀察葡萄籽原花青素對多柔比星（DOX）誘導(dǎo)的心臟毒性以及核因子E2相關(guān)基因（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1）通路的作用。方法：通過DOX構(gòu)建小鼠急性心臟毒性模型，本實(shí)驗(yàn)分為對照組（正常小鼠）、葡萄籽原花青素組、DOX組、DOX＋葡萄籽原花青素組、DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組。超聲心動(dòng)圖檢查小鼠心功能；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察小鼠心肌病理改變；原位末端標(biāo)記測定法（TUNEL）檢測小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）水平；試劑盒檢測心肌組織中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）測定Nrf2/HO-1通路蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與對照組比較，DOX組小鼠心肌損傷加重，左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD），血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平及心肌組織ROS、MDA及心肌細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），射血分?jǐn)?shù)（EF）、短軸縮短分?jǐn)?shù)（FS）、心肌組織SOD、Nrf2、HO-1蛋白水平降低（P＜0.05）；葡萄籽原花青素組小鼠心肌損傷，LVESD、LVEDD、EF、FS水平，血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平，心肌組織ROS、MDA、SOD、Nrf2、HO-1蛋白，心肌細(xì)胞凋亡率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與DOX組比較，DOX＋葡萄籽原花青組小鼠心肌損傷減輕，LVESD、LVEDD降低，血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平降低，心肌組織ROS、MDA、心肌細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），EF、FS及心肌組織SOD、Nrf2、HO-1蛋白水平升高（P＜0.05）；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組小鼠心肌損傷加重，LVESD、LVEDD及血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平、心肌組織ROS、MDA、心肌細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），EF、FS、心肌組織SOD、Nrf2、HO-1蛋白水平降低（P＜0.05）。結(jié)論：葡萄籽原花青素可能通過激活Nrf2/HO-1通路，對DOX誘導(dǎo)的心臟毒性小鼠發(fā)揮保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞 葡萄籽原花青素；核因子E2相關(guān)基因；血紅素加氧酶1；多柔比星；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.03.011

Grape Seed Proanthocyanidins Attenuates Doxorubicin-induced Cardiotoxicity by Regulating Nrf2/HO-1 Pathway

WU Min，QU Yiqian，HUANG Sumin

Nankai Traditional Chinese Medicine Hospital， Tianjin 300102， China， E-mail： 975350882@qq.com

Abstract Objective：To observe grape seed proanthocyanidins could alleviate doxorubicin（DOX）-induced cardiotoxicity and the role of nuclear factor E2-related gene（Nrf2）/heme oxygenase-1（HO-1） pathway on it.Methods：The mice model with acute cardiotoxicity was established by DOX，and the experiment was divided into the control group（normal mice），grape seed proanthocyanidin group，DOX group，DOX＋grape seed proanthocyanidin group，DOX＋grape seed proanthocyanidin＋ML385 group.Echocardiography was used to detect cardiac function in mice;hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the pathological changes of myocardial cells in mice;the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL） assay was used to detect the apoptosis of cardiomyocytes;enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to measure serum creatine kinase isoenzyme（CK-MB），interleukin-6（IL-6），and interleukin-1β（IL-1β） levels;The kit was used to detect reactive oxygen species（ROS），malondialdehyde（MDA），and superoxide dismutase（SOD） levels in myocardial tissue;Western Blot was used to determine the expression levels of Nrf2/HO-1 pathway proteins.Results： Compared with the control group，the myocardial injury of the mice in the DOX group aggravated;the left ventricular end-diastolic diameter（LVEDD），left ventricular end-systolic diameter（LVESD），serum CK-MB，IL-6，IL-1β levels，myocardial tissue ROS，MDA，myocardial cell apoptosis rate increased（P＜0.05）;ejection fraction（EF），fractional shortening（FS），myocardial tissue SOD，Nrf2，and HO-1 protein levels decreased（P＜0.05）.In the seed proanthocyanidin group，the difference in myocardial injury，LVESD，LVEDD，EF，F(xiàn)S，serum CK-MB，IL-6，IL-1β levels，myocardial tissue ROS，MDA，SOD，Nrf2，HO-1 protein，and cardiomyocyte apoptosis rate was not statistically significant（P＞0.05）.Compared with the DOX group，the myocardial injury of the mice in the DOX＋grape seed proanthocyanidin group alleviated;LVESD，LVEDD，serum CK-MB，IL-6，IL-1β levels，myocardial tissue ROS，MDA，and myocardial cell apoptosis rate reduced（P＜0.05）;EF，F(xiàn)S，protein levels of SOD，Nrf2，and HO-1 in myocardial tissue increased（P＜0.05）.Compared with the DOX＋ grape seed proanthocyanidin group，myocardial injury in the DOX＋ grape seed proanthocyanidin＋ML385 group aggravated;LVESD，LVEDD，Serum CK-MB，IL-6，IL-1β levels，myocardial tissue ROS，MDA，and myocardial cell apoptosis rate increased（P＜0.05）;EF，F(xiàn)S，myocardial tissue SOD，Nrf2，and HO-1 protein levels decreased（P＜0.05）.Conclusion：Grape seed proanthocyanidins may protect against DOX^-induced cardiotoxicity in mice by activating the Nrf2/HO-1 pathway.

Keywords grape seed proanthocyanidins;nuclear factor E2 related gene;heme oxygenase 1;doxorubicin;experimental study

基金項(xiàng)目 天津市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.2018-HBCD-18）

作者單位 1.天津市南開區(qū)中醫(yī)醫(yī)院（天津 300102），E-mail：975350882@qq.com；2.上海市普陀區(qū)真如鎮(zhèn)街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心

引用信息 吳敏，瞿怡倩，黃蘇敏.葡萄籽原花青素調(diào)控Nrf2/HO-1通路減弱多柔比星誘導(dǎo)的心臟毒性［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（3）：464-469.

多柔比星（DOX）屬于蒽環(huán)類藥物，是應(yīng)用較為廣泛的化療藥物，對腫瘤組織有強(qiáng)大的殺傷作用，但其在殺傷腫瘤的同時(shí)也會對正常組織造成傷害，心臟是首當(dāng)其沖的器官^［1-2］，保留DOX抗腫瘤作用并降低其心臟毒性是臨床中亟待解決的問題之一。DOX造成心臟毒性的機(jī)制較為復(fù)雜，其通過提升心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平造成心肌細(xì)胞凋亡可能是原因之一^［3］。核因子E2相關(guān)基因（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1）是在細(xì)胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路之一，虎杖苷可通過激活此通路抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷^［4］；異甘草素可通過調(diào)控此通路抑制活性氧（ROS）的產(chǎn)生，對阿霉素誘導(dǎo)的胰腺炎發(fā)揮保護(hù)作用^［5］。因此，本研究從Nrf2/HO-1氧化應(yīng)激通路入手尋求降低DOX所致心臟毒性的有效藥物。葡萄籽中含大量原花青素，原花青素素是多酚類物質(zhì)，可有效清除氧自由基，在心腦血管疾病中發(fā)揮防控作用，如葡萄籽原花青素可保護(hù)嗜鉻神經(jīng)瘤細(xì)胞（PCI2）免受過氧化氫誘導(dǎo)的損傷^［6］；還可通過降低氧化應(yīng)激發(fā)揮對雙酚A誘導(dǎo)的急性神經(jīng)炎癥雄性大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用^［7］。本研究通過構(gòu)建DOX誘導(dǎo)的急性心臟毒性小鼠模型，探究葡萄籽原花青素對其的保護(hù)作用以及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑

近交品系實(shí)驗(yàn)鼠（C57BL/6）小鼠60只，體質(zhì)量20～25 g，購自吉林大學(xué)，許可證號：SYXK（吉）2021-0003，本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)。葡萄籽原花青素（Y70767）購自上海源葉；Nrf2通路抑制劑ML385（S8790）購自selleck；肌酸激酶同工酶（CK-MB，ml037723）、白細(xì)胞介素-6（IL-6，ml063159）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β，ml301814）的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)；ROS（S0033S）、丙二醛（MDA，S0131S）、超氧化物歧化酶（SOD，S0101S）試劑盒購自上海碧云天；Nrf2（ab62352）、HO-1（ab52947）、GAPDH一抗（ab9485）、山羊抗兔IgG二抗（ab205718）購自美國Abcam。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的構(gòu)建

給小鼠腹腔注射2.5 mg/kg的DOX，2周內(nèi)注射6次，合計(jì)劑量為15 mg/kg，誘導(dǎo)心臟毒性模型^［8］。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理情況

60只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組（正常喂養(yǎng)小鼠，飲食、飲水自由）、DOX組、葡萄籽原花青素（500 mg/kg）組^［9］、DOX＋葡萄籽原花青素組（造模成功后給予500 mg/kg的葡萄籽原花青素）、DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組（ML385劑量30 mg/kg）^［10］，每組12只。對照組和葡萄籽原花青素組給予腹腔注射10 mL/kg生理鹽水，其余各組腹腔注射2.5 mg/kg DOX，2周內(nèi)注射6次構(gòu)建心臟毒性模型；其中葡萄籽原花青素組、DOX＋葡萄籽原花青素組每日給予500 mg/kg葡萄籽原花青素灌胃，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組每日灌胃500 mg/kg葡萄籽原花青素的同時(shí)腹腔注射30 mg/kg ML385，連續(xù)干預(yù)14 d。給藥結(jié)束后，超聲心動(dòng)圖檢測各組小鼠心功能指標(biāo)左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、短軸縮短分?jǐn)?shù)（FS）。

1.2.3 ELISA法檢測小鼠血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平

各組小鼠心功能指標(biāo)檢測結(jié)束后，收集小鼠靜脈血血清，按照血清CK-MB、IL-6、IL-1β各自試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定各項(xiàng)指標(biāo)值。

1.2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色檢測小鼠心肌組織病理變化

取血完成后斷頭處死小鼠，分離小鼠心臟，修剪后制備石蠟切片，參照HE染色試劑盒說明書處理，封片后顯微鏡下觀察各組小鼠心肌組織病理變化。

1.2.5 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記測定法（TUNEL）檢測小鼠心肌細(xì)胞凋亡

收集制備的石蠟切片，脫蠟后通過TUNEL試劑盒進(jìn)行TUNEL染色，并顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算小鼠心肌細(xì)胞凋亡率，凋亡率（%）＝凋亡細(xì)胞（黃褐色）數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 小鼠心肌組織ROS、MDA、SOD水平檢測

取部分心臟組織，稱量后制備10%心肌組織勻漿，離心（3 000 r/min，15 min）后收集上清液，按照試劑盒說明書測定小鼠心肌組織中ROS、MDA、SOD水平。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測Nrf2/HO-1通路蛋白

取部分小鼠心臟組織，勻漿后離心（12 000 r/min，15 min）得上清液，聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，封閉，加入稀釋一抗Nrf2、HO-1（稀釋均為1∶1 000，內(nèi)參GAPDH稀釋比為1∶5 000），4 ℃孵育24 h后，添加1∶5 000稀釋比的二抗，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)現(xiàn)試劑（ECL）顯色液顯色，分析Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x^-±s）表示，組間比較進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩組間比較行LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 葡萄籽原花青素對心臟毒性小鼠心功能的改善

與對照組比較，DOX組小鼠LVESD、LVEDD升高（P＜0.05），EF、FS降低（P＜0.05）；葡萄籽原花青素組LVESD、LVEDD、EF、FS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DOX組比較，DOX＋葡萄籽原花青素組小鼠LVESD、LVEDD降低（P＜0.05），EF、FS升高（P＜0.05）；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組小鼠LVESD、LVEDD升高（P＜0.05），EF、FS降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 葡萄籽原花青素對心臟毒性小鼠CK-MB、IL-6、IL-1β水平的影響

與對照組比較，DOX組小鼠血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平升高（P＜0.05），葡萄籽原花青素組CK-MB、IL-6、IL-1β水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DOX組比較，DOX＋葡萄籽原花青素組小鼠CK-MB、IL-6、IL-1β水平降低（P＜0.05）；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組小鼠CK-MB、IL-6、IL-1β水平升高（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 葡萄籽原花青素對心臟毒性小鼠ROS、MDA、SOD指標(biāo)的影響

與對照組比較，DOX組小鼠ROS、MDA水平升高（P＜0.05），SOD水平降低（P＜0.05），葡萄籽原花青素組ROS、MDA、SOD水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DOX組比較，DOX＋葡萄籽原花青素組小鼠ROS、MDA水平降低（P＜0.05），SOD水平升高（P＜0.05）；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組小鼠ROS、MDA水平升高（P＜0.05），SOD水平降低（P＜0.05）。詳見表3。

2.4 葡萄籽原花青素對心臟毒性小鼠心肌病理的改善

對照組心肌細(xì)胞排列正常；DOX組心肌細(xì)胞存在水腫、破裂，細(xì)胞排列紊亂；葡萄籽原花青素組無明顯變化；葡萄籽原花青素處理可改善DOX組小鼠心肌損傷程度；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組心肌損傷程度加深。詳見圖1。

2.5 葡萄籽原花青素對心臟毒性小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，DOX組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），葡萄籽原花青素組心肌細(xì)胞凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DOX組比較，DOX＋葡萄籽原花青素組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.6 葡萄籽原花青素激活心臟毒性小鼠心肌組織Nrf2/HO-1通路

與對照組比較，DOX組小鼠心肌組織表達(dá)Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），葡萄籽原花青素組心肌組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DOX組比較，DOX＋葡萄籽原花青素組小鼠心肌組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組小鼠心肌組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。詳見圖3、表5。

3 討 論

DOX引發(fā)的心臟毒性是阻礙其發(fā)揮抗腫瘤作用的原因，探究其引發(fā)心臟毒性的機(jī)制并尋求有效防治藥物是研究方向。DOX誘導(dǎo)的心臟毒性機(jī)制包括對心肌細(xì)胞肌小節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞^［11］、氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡^［12］、自噬^［13］等。

本研究從氧化應(yīng)激角度進(jìn)行探討，通過腹腔注射DOX構(gòu)建小鼠急性心臟毒性模型，小鼠LVESD、LVEDD明顯升高，EF、FS明顯降低，即模型小鼠心功能下降；CK-MB、IL-6、IL-1β水平較正常小鼠明顯升高，提示模型小鼠心肌損傷、炎癥水平升高；ROS、MDA水平的升高與SOD水平的下降提示小鼠心肌氧化應(yīng)激水平升高；HE染色與TUNEL染色結(jié)果顯示模型小鼠心肌水腫、破裂，細(xì)胞排列紊亂、凋亡率升高，心臟損傷加劇，由此表明，DOX可引發(fā)心臟毒性。

DOX產(chǎn)生的副作用為產(chǎn)生過量細(xì)胞內(nèi)ROS，過量的氧化劑（自由基）在體內(nèi)游離會破壞DNA與組織，產(chǎn)生心臟毒性，但ROS反映的下游分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮著更關(guān)鍵的作用^［14］。Nrf2是內(nèi)源性抗氧化劑，可與抗氧化原件結(jié)合，激活抗氧化酶的基因表達(dá)，其受ROS調(diào)控，Nrf2是HO-1的誘導(dǎo)劑之一，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可發(fā)揮對HO-1的調(diào)控作用^［15］。正常狀態(tài)下Nrf2與Keap1相互作用保持低轉(zhuǎn)錄狀態(tài)活性，但受ROS等氧化應(yīng)激刺激下解離，進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)HO-1等抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄^［16］。姜黃素可劑量依賴性地減少人鼻腔成纖維細(xì)胞ROS的生成，并促進(jìn)Nrf2/HO-1通路激活^［17］；沒食子酸通過激活彈性蛋白酶誘導(dǎo)的肺氣腫大鼠Nrf2/HO-1/核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB通路，抑制氧化應(yīng)激與炎癥^［18］；丁酸可通過激活Nrf2通路激活抗氧化途徑減輕大鼠神經(jīng)功能缺損^［19］；激活Nrf2/HO-1通路可保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的心肌組織損傷^［20］。以上研究均說明Nrf2/HO-1通路在抗氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮積極作用。

原花青素是一種天然抗氧化劑，葡萄籽中原花青素含量豐富，是由兒茶素、沒食子酸、表兒茶素組成的多聚體，其多羥基結(jié)構(gòu)使其擁有高抗氧化作用。方歡樂等^［21］研究顯示，葡萄籽原花青素可降低D-半乳糖致衰老模型肝組織、血液、皮膚組織中MDA水平，并提高SOD水平，對大鼠肝臟的病理狀態(tài)有改善作用；云少君等^［22］研究顯示原花青素對鐵過量引起的大鼠腎臟鐵超載、氧化損傷及細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用；本研究中，原花青素可改善DOX引發(fā)的心功能損傷，降低CK-MB、IL-6、IL-1β、ROS、MDA水平、心肌細(xì)胞凋亡率，而原花青素對正常小鼠心功能、氧化應(yīng)激、心肌酶譜等無作用，提示原花青素可改善DOX引發(fā)的小鼠氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、心肌損傷。DOX誘導(dǎo)的心肌組織Nrf2、HO-1水平降低，經(jīng)原花青素處理后小鼠心肌組織Nrf2、HO-1水平升高；提示原花青素對DOX誘導(dǎo)的小鼠心臟毒性的保護(hù)作用，可能與激活Nrf2/HO-1通路有關(guān)。在原花青素處理基礎(chǔ)上增添Nrf2抑制劑，抑制Nrf2激活，此心臟毒性的保護(hù)作用被削弱，進(jìn)一步提示葡萄籽原花青素可能通過激活Nrf2/HO-1通路發(fā)揮對DOX誘導(dǎo)的心臟毒性小鼠發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，葡萄籽原花青素可能通過激活Nrf2/HO-1通路，對DOX誘導(dǎo)的心臟毒性小鼠發(fā)揮保護(hù)作用，但本研究仍存在一定局限性，有待今后研究補(bǔ)充體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（收稿日期：2022-03-28）

（本文編輯 王雅潔）