楊雪梅，楊康明，李娜

摘要 目的：探究異氟醚通過調節(jié)骨發(fā)生形態(tài)蛋白4（BMP4）及其下游Smad蛋白對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）腦損傷的作用機制。方法：采用隨機數(shù)字表法將48只SHR分為模型組、異氟醚組、陽性藥物組、異氟醚＋LDN193189組，健康大鼠作為健康對照組，每組12只。各組大鼠分別放入氧氣箱中，健康對照組、模型組、陽性藥物組大鼠通入特殊氣體（30%O2、70%N2）1 h，異氟醚組、異氟醚＋LDN193189組通入混雜2%異氟醚的特殊氣體1 h，通過麻醉氣體檢測儀檢測異氟醚含量，確保異氟醚濃度始終保持在2%。通氣結束后，異氟醚＋LDN193189組大鼠腹腔內注射BMP4/Smad通路抑制劑溶液20 μL（LDN193189，5 mg/kg），陽性藥物組大鼠腹腔內注射纈沙坦溶液20 μL（10 mg/kg），健康對照組、模型組、異氟醚組大鼠腹腔內注射等量的生理鹽水。氧氣箱通氣實驗及注射每日1次，持續(xù)10 d。無創(chuàng)血壓檢測儀檢測尾動脈收縮壓變化；神經(jīng)學行為評分評價行為功能；腦含水量檢測腦水腫程度；原位末端轉移酶標記法（TUNEL）染色和尼氏染色觀察海馬組織病理學變化及神經(jīng)元損傷情況；熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）及蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測海馬組織BMP4、Smad2 mRNA及蛋白表達水平。結果：與模型組比較，異氟醚組、陽性藥物組、異氟醚＋LDN193189組大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡減少，尼氏小體增多，血壓、神經(jīng)學評分、腦組織含水量顯著降低，BMP4、Smad2 mRNA及蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）；與異氟醚組比較，異氟醚＋LDN193189組大鼠神經(jīng)細胞凋亡增多，尼氏小體急劇減少，血壓、神經(jīng)學評分、腦組織含水量顯著升高，BMP4、Smad2 mRNA及蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；異氟醚組與陽性藥物組各項數(shù)據(jù)差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：異氟醚可通過促進BMP4/Smad信號通路減輕SHR腦損傷。

關鍵詞自發(fā)性高血壓；腦損傷；異氟醚；骨發(fā)生形態(tài)蛋白4；Smad蛋白

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.04.010

Effect of Isoflurane on Cerebral Injury in Spontaneously Hypertensive Rats through BMP4/Smad Signaling Pathway

YANG Xuemei， YANG Kangming， LI Na

Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture People′s Hospital， Ganzi 626000， Sichuan， China

Corresponding AuthorLI Na， E-mail： iw12pf@163.com

AbstractObjective：To explore the effect of isoflurane on brain injury in spontaneously hypertensive rats（SHR） by regulating bone morphogenetic protein 4（BMP4） and its downstream Smad protein.Methods：Forty-eight SHR rats were randomly divided into model group，isoflurane group，positive drug group，isoflurane＋LDN193189 group，and healthy rats were used as healthy control group，with 12 rats in each group.Rats in each group were placed into oxygen tanks，healthy control group，model group and positive drug group were injected with special gas（30%O2，70%N2） for 1 h，isoflurane group and isoflurane＋LDN193189 group were injected with special gas mixed with 2% isoflurane for 1 h，and isoflurane content was detected by anesthesia gas detector.Ensure isoflurane concentration was maintained at 2% at all times.After ventilation，rats in isoflurane＋LDN193189 group were intraperitoneally injected with BMP4/Smad pathway inhibitor solution of 20 μL（LDN193189，5 mg/kg），the positive drug group was intraperitoneally injected with 20 μL（10 mg/kg） of valsartan solution，and the healthy control group，model group and isoflurane group were intraperitoneally injected with the same volume of normal saline water.Oxygen tank ventilation test and injection were once a day for 10 days.The changes of tail artery systolic blood pressure were detected by non-invasive blood pressure detector.Neurological behavior score was used to evaluate behavioral function.Cerebral water content was used to measured the degree of cerebral edema.The histopathological changes and neuronal injury of hippocampus were detected by terminal deoxyribonucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL） and Nysch staining.Fluorescence quantitative polymerase chain reaction（PCR） and Western Blot were used to detect the mRNA and protein expression levels of BMP4 and Smad2 mRNA and protein in hippocampus.Results：Compared with the model group，the apoptosis of hippocampal nerve cells in isoflurane group，positive drug group and isoflurane＋LDN193189 group decreased，the number of nissellite bodies increased，the blood pressure，neurological score，and cerebral tissue water content decreased significantly，and the mRNA and protein expressions of BMP4 and Smad2 increased significantly（P＜0.05）.Compared with the isoflurane group，the neuronal apoptosis of rats in isoflurane＋LDN193189 group increased，the nissellite bodies decreased sharply，the blood pressure，neurological score，and cerebral tissue water content significantly increased，and the mRNA and protein expressions of BMP4 and Smad2 significantly decreased（P＜0.05）.There was no significant difference between isoflurane group and positive drug group（P＞0.05）.Conclusion：Isoflurane can reduce SHR cerebral damage by promoting BMP4/Smad signaling pathway.

Keywordsspontaneous hypertension; brain damage; isoflurane; bone morphogenetic protein 4; Smad protein

高血壓為我國常見的慢性疾病之一，隨著人口老齡化的加劇，高血壓疾病發(fā)生率逐漸增高，且由于飲食作息等因素，近年來高血壓病人趨于年輕化［1-3］。目前，針對高血壓疾病的治療藥物較多，且多為西藥，盡管具有較好的療效，但易出現(xiàn)一定的副作用［4-5］。高血壓發(fā)病原因多樣，受多條通路調控［6］。骨發(fā)生形態(tài)蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）具有誘導骨形成的作用，不僅大量存在于骨組織中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也高表達，調節(jié)神經(jīng)元生長，在神經(jīng)受損后加速神經(jīng)細胞的生長與分化，從而緩解腦損傷，BMP4通常與其下游蛋白Smad結合，兩者共同發(fā)揮作用［7-8］。異氟醚是一種具有乙醚樣氣味的特殊有機物，作為常見的吸入類麻醉藥物，常用于手術的全身麻醉，具有良好的安全性［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，異氟醚對于腦缺血引起的腦損傷具有良好的治療效果，已被應用于治療缺血缺氧性腦損傷病人的神經(jīng)損傷，對腦神經(jīng)有良好的保護作用［11］。異氟醚可通過調控BMP4/Smad信號通路相關基因的表達緩解缺血再灌注損傷大鼠的腦損傷［12］。本研究以自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）為實驗模型，探究異氟醚是否通過調控BMP4/Smad信號通路對SHR腦損傷產(chǎn)生影響。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

異氟醚（貨號080906）購于美國艾伯維公司，纈沙坦膠囊（國藥準字H20040217，用生理鹽水配成溶液）購于北京諾華制藥有限公司，BMP4/Smad通路抑制劑（LDN193189，貨號HY-12071）購于MedChemExpress公司，原位末端轉移酶標記法（TUNEL）染色試劑盒（貨號FA201-01）購于北京全式金生物技術有限公司，尼氏染色試劑盒（貨號G1432）購于北京索萊寶科技有限公司，3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（貨號ab9485）、BMP4抗體（貨號ab124715）、Smad2抗體（貨號ab280888）購于Abcam公司，羊抗兔二抗（貨號7074S）購于Cell Signaling Technology公司。熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（7500，ABI公司生產(chǎn)），小動物無創(chuàng)血壓檢測儀（panlab NIBP，深圳市瑞沃德生命科技有限公司生產(chǎn)），凝膠成像系統(tǒng)（HE-120，上海生工生物有限公司生產(chǎn)）。

1.2動物分組及干預

由河北省實驗動物中心購得8周齡雄性Wistar SHR 48只、8周齡雄性健康Wistar大鼠12只，許可證號SCXK（冀）2018-004，體質量（250±35）g。通過神經(jīng)學評分［13］評估大鼠行為功能，SHR評分均≥3分，健康大鼠評分均為0分，模型有效，其中，神經(jīng)學評分0分為無抽搐反應，正常行走；1分為出現(xiàn)面部痙攣，伴肌痙攣；2分為間歇性抽搐；3分為伴劇烈強直性痙攣抽搐；4分為全身陣攣抽搐伴站立不穩(wěn)；5分為難以站立，抽搐時間延長。采用隨機數(shù)字表法將SHR分為模型組、異氟醚組、陽性藥物組、異氟醚＋LDN193189組，健康大鼠作為健康對照組，每組12只。各組大鼠分別放入氧氣箱中，健康對照組、模型組、陽性藥物組大鼠通入特殊氣體（30%O2、70%N2）1 h，異氟醚組、異氟醚＋LDN193189組通入混雜2%異氟醚的特殊氣體1 h，通過麻醉氣體檢測儀檢測異氟醚含量，確保異氟醚濃度始終保持在2%。通氣結束后，異氟醚＋LDN193189組大鼠腹腔內注射BMP4/Smad通路抑制劑溶液20 μL（LDN193189，5 mg/kg），陽性藥物組大鼠腹腔內注射纈沙坦溶液20 μL（10 mg/kg），健康對照組、模型組、異氟醚組大鼠腹腔內注射等量的生理鹽水。氧氣箱通氣實驗及注射每日1次，持續(xù)10 d。末次干預24 h后，通過神經(jīng)學評分評估大鼠行為功能。

1.3大鼠血壓監(jiān)測

各組大鼠在首次氧氣箱通氣實驗前及末次干預24 h后，用恒溫水（40 ℃）持續(xù)沖洗大鼠尾部，使大鼠尾部松軟并尾動脈擴張，毛巾擦干尾部后，在大鼠尾部套入小動物無創(chuàng)血壓檢測儀尾套，待血壓測定儀界面出現(xiàn)穩(wěn)定脈搏信號后，開始檢測尾動脈收縮壓，記錄統(tǒng)計結果。

1.4大鼠腦組織含水量檢測

末次檢測血壓后，處死各組大鼠，解剖獲取大鼠腦組織，取出海馬組織，部分組織置于4%多聚甲醛中固定備用，部分組織置液氮處理后研磨成粉，凍存?zhèn)溆谩ＪＳ嗄X組織稱重，記作濕重，而后將腦組織放入烘干箱中，持續(xù)烘干24 h，確保烘干水分，而后取出稱量，記作干重。通過腦組織含水量計算公式計算腦組織含水量＝（濕重－干重）/濕重×100%。

1.5TUNEL染色及尼氏染色檢測神經(jīng)損傷情況

取1.4中在多聚甲醛中固定24 h后的海馬組織，不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯染色透明，石蠟包埋后切片（厚度5 μm），脫蠟至水，分別按照TUNEL染色試劑盒和尼氏染色試劑盒的制造商說明對切片進行處理，最后在光鏡下觀察染色結果并拍照。

1.6熒光定量PCR檢測海馬組織BMP4、Smad2 mRNA水平

取1.4中凍存?zhèn)溆玫暮ｑR組織粉末，使用Trizol試劑提取海馬組織總RNA，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，檢測提取的RNA濃度，定量后反轉錄為cDNA。以cDNA為模板在熒光定量PCR儀上檢測BMP4、Smad2 mRNA水平。以GAPDH為內參，采用2－△△Ct法計算BMP4、Smad2的相對表達水平。mRNA引物序列如下：GAPDH正向引物為5′-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′，反向引物為5′-TACTCAGCACCAGCATCACC-3′；BMP4正向引物為5′-AGAAATGGTGCCTGGAC ACCTCAT-3′，反向引物為5′-TGGTCCCGGTTGTACAGTCCTAAT-3′；Smad2正向引物為5′-CCACTACCAGAGGGTGGAGA-3′，反向引物為5′-CCTGCTGGGAAATTTG TGTT-3′。

1.7蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測海馬組織中BMP4、Smad2蛋白表達

取出剩余的海馬組織粉末，加入蛋白裂解液充分震蕩，溶解蛋白后加入蛋白提取液，再次震蕩，靜置片刻，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，收集上層清液進行蛋白定量。將定量后的蛋白經(jīng)電泳、轉膜處理，然后用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（GAPDH抗體、BMP4抗體、Smad2抗體，1∶1 000），4 ℃孵育過夜。倒出封閉液，用TBST緩沖液清洗3次，每次3 min。加入羊抗兔二抗（1∶1 500），常溫孵育40 min，TBST清洗3次，每次3 min。將發(fā)光液混合后倒于膜上，避光染色1 min后吸凈多余液體，置于光密度掃描系統(tǒng)進行條帶灰度分析。

1.8統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1異氟醚對SHR神經(jīng)學評分及血壓的影響

與健康對照組比較，模型組大鼠干預前后神經(jīng)學評分及血壓顯著升高（P＜0.05）；與本組干預前比較，健康對照組、模型組大鼠干預后神經(jīng)學評分及血壓差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），陽性藥物組、異氟醚組、異氟醚＋LDN193189組干預后神經(jīng)學評分及血壓顯著降低（P＜0.05）。與模型組干預后比較，陽性藥物組、異氟醚組、異氟醚＋LDN193189組大鼠干預后神經(jīng)學評分及血壓顯著降低（P＜0.05）；與異氟醚組干預后比較，異氟醚＋LDN193189組大鼠干預后神經(jīng)學評分及血壓顯著升高（P＜0.05），干預前神經(jīng)學評分及血壓差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；異氟醚組與陽性藥物組比較，大鼠干預前后神經(jīng)學評分及血壓差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.2異氟醚對SHR腦水腫的影響

與健康對照組比較，模型組大鼠腦組織含水量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組、異氟醚組、異氟醚＋LDN193189組大鼠腦組織含水量顯著降低（P＜0.05）；與異氟醚組比較，異氟醚＋LDN193189組大鼠腦組織含水量顯著升高（P＜0.05）；異氟醚組與陽性藥物組比較，大鼠腦組織含水量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

2.3異氟醚對SHR神經(jīng)損傷的影響

TUNEL染色及尼氏染色顯示，健康對照組大鼠海馬組織中神經(jīng)元細胞排列緊密，有大量均勻分布的藍色顆粒狀尼氏小體，未出現(xiàn)凋亡神經(jīng)元。與健康對照組比較，模型組大鼠海馬組織中神經(jīng)元細胞排列松散，尼氏小體減少，觀察到大量神經(jīng)元細胞凋亡；與模型組比較，陽性藥物組、異氟醚組大鼠海馬組織中神經(jīng)元細胞排列較為密集，尼氏小體逐漸增多，神經(jīng)元細胞凋亡減少；與異氟醚組比較，異氟醚＋LDN193189組尼氏小體較少，神經(jīng)細胞凋亡增多，且組織中神經(jīng)元細胞排列分散。詳見圖1、圖2。

2.4異氟醚對SHR海馬組織BMP4、Smad2 mRNA表達的影響

與健康對照組比較，模型組大鼠海馬組織BMP4、Smad2 mRNA表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組、異氟醚組、異氟醚＋LDN193189組大鼠海馬組織BMP4、Smad2 mRNA表達顯著升高（P＜0.05）；與異氟醚組比較，異氟醚＋LDN193189組大鼠海馬組織BMP4、Smad2mRNA表達顯著降低（P＜0.05）；陽性藥物組與異氟醚組比較，大鼠海馬組織BMP4、Smad2mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表3。

2.5異氟醚對SHR海馬組織BMP4、Smad2蛋白表達的影響

與健康對照組比較，模型組大鼠海馬組織BMP4、Smad2蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組、異氟醚組、異氟醚＋LDN193189組大鼠海馬組織BMP4、Smad2蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）；與異氟醚組比較，異氟醚＋LDN193189組大鼠海馬組織BMP4、Smad2蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；陽性藥物組與異氟醚組比較，大鼠海馬組織BMP4、Smad2蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖3、表4。

3討論

高血壓作為我國發(fā)病率較高的疾病，嚴重危害人類健康，長期的高血壓會導致腦動脈粥樣硬化，引起腦缺血，造成腦組織水腫及神經(jīng)功能障礙［14-15］。異氟醚常作為麻醉用藥用于臨床試驗，已證實可參與緩解腦損傷，且在臨床應用，異氟醚預處理可幫助體外循環(huán)手術病人緩解腦損傷，改善認知功能［16］。同時對重度腦損傷病人腦部具有保護作用，可通過降低腦氧代謝率，緩解神經(jīng)損傷［17］。異氟醚還可與其他通用麻醉類藥物如丙泊酚等共同使用，麻醉同時緩解腦部損傷［18］。纈沙坦是治療高血壓及保護腦損傷的常用藥物，故本研究選擇纈沙坦作為陽性對照［19］。本研究結果顯示，模型組大鼠神經(jīng)學評分及血壓顯著升高，說明實驗所用SHR確有高血壓及高血壓引起的腦組織損傷，異氟醚處理及陽性藥物處理后，大鼠神經(jīng)學評分及血壓均顯著降低，表明異氟醚具有與常規(guī)藥物相同的治療效果，可在降低高血壓的同時，減輕腦損傷引起的行為功能障礙。

研究顯示，海馬組織作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的記憶組織，含有大量神經(jīng)元，是判斷腦損傷的重要組織；腦組織含水量是評判腦水腫的重要標志［20-21］。本研究結果顯示，SHR海馬組織尼氏小體大量減少，大量神經(jīng)元細胞凋亡，腦組織含水量顯著升高；陽性藥物纈沙坦及異氟醚處理可增加尼氏小體數(shù)量，抑制神經(jīng)元細胞凋亡，降低腦組織含水量，提示異氟醚可以緩解SHR海馬組織神經(jīng)元損傷，減輕腦水腫，維持腦組織結構正常，但具體的作用機制尚未明確。

研究顯示，BMP4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的保護作用，在腦缺血引起的腦損傷過程中參與保護神經(jīng)細胞，從而緩解腦損傷帶來的神經(jīng)損害，BMP4與下游蛋白Smad結合，共同維護神經(jīng)組織，緩解腦水腫等多種腦組織損害［22］。同時有研究指出，異氟醚可通過調控BMP4/Smad通路相關基因表達影響腦缺血再灌注損傷大鼠的癥狀［23］。故推測異氟醚可能通過調控BMP4/Smad信號通路參與對SHR腦損傷的保護作用。本研究結果顯示，SHR海馬組織中BMP4、Smad2 mRNA和蛋白表達顯著降低，而異氟醚處理可提高大鼠海馬組織BMP4、Smad2 mRNA和蛋白表達，說明BMP4/Smad信號通路參與SHR發(fā)生，而異氟醚很可能通過調控BMP4/Smad信號通路對SHR發(fā)揮作用。進一步研究顯示，BMP4/Smad通路抑制劑可逆轉異氟醚對SHR腦損傷的保護作用，再次驗證了異氟醚通過促進BMP4/Smad信號通路參與緩解SHR腦損傷。

綜上所述，異氟醚可通過促進BMP4/Smad信號通路降低SHR血壓，并減輕大鼠腦神經(jīng)元凋亡及腦水腫，緩解腦組織損傷，減輕大鼠行為功能障礙，從而治療和改善高血壓及其并發(fā)癥。異氟醚治療高血壓具有較好的療效，且安全易操作，有很大的應用空間，但異氟醚是否還通過調節(jié)其他通路間接參與調控高血壓，仍有待進一步的實驗驗證。

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（收稿日期：2021-11-17）

（本文編輯鄒麗）