許琳潔，史大卓，馬曉娟，黃弘博，張瑩

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法探討潤肝養(yǎng)心方治療心臟神經(jīng)癥（CN）的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索并篩選出潤肝養(yǎng)心方（麥冬、酸棗仁、柏子仁、炒白芍、當(dāng)歸、五味子、茯苓、炙甘草）的藥物活性成分及作用靶點，利用基因名片數(shù)據(jù)庫（GeneCard）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫篩選CN疾病靶點，將藥物和疾病靶點兩者取交集后獲得的共有靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫獲得蛋白互作關(guān)系，應(yīng)用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)；采用R語言ClusterProfiler程序包（3.18.0）對關(guān)鍵靶點進行基因本體（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，并利用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建關(guān)鍵靶點-功能-通路圖及關(guān)鍵靶點中藥藥理調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；采用AutoDock Tools 1.5.6進行分子對接研究。結(jié)果：潤肝養(yǎng)心方篩選得到活性成分146個、作用靶點245個、CN及潤肝養(yǎng)心方共有靶點如白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）等38個。KEGG富集分析關(guān)鍵靶點主要被富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）-糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等信號通路，涉及對異源刺激的反應(yīng)、管徑調(diào)節(jié)、血管直徑維持等生物過程。分子對接驗證顯示關(guān)鍵靶點與槲皮素、芍藥苷、山柰酚的結(jié)合活性較好。結(jié)論：潤肝養(yǎng)心方中主要活性成分可能通過調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6、TNF等關(guān)鍵靶點基因及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等多通路以發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平等作用治療CN。

關(guān)鍵詞心臟神經(jīng)癥；潤肝養(yǎng)心方；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.04.004

Molecular Mechanism of Rungan Yangxin Recipe in the Treatment of Cardiac Neurosis? Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

XU Linjie， SHI Dazhuo， MA Xiaojuan， HUANG Hongbo， ZHANG Ying

Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; National Clinical Research Center for Chinese Medicine Cardiology， Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China

Corresponding AuthorZHANG Ying， E-mail： echo993272@sina.com

AbstractObjective：To explore the material foundation and mechanism of Rungan Yangxin Recipe for the treatment of cardiac neurosis（CN） based on network pharmacology and molecular docking method.Methods：Traditional Chinese medicine（TCM） system pharmacology database（TCMSP），PubChem and Swiss Target prediction databases were used to search and screen the active components and action targets of Rungan Yangxin Recipe（ophiopogon japonicus，wild jujube kernel，cypress kernel，fried white peony，angelica sinensis，schisandra chinensis，poria cocos，roasted licorice）.CN disease targets were screened using GeneCard database（GeneCard），Online Human Mendelian Genetic Database（OMIM） and DisGeNET database.The common targets were obtained after the intersection of drug，and disease targets were imported into STRING database to obtain the protein interaction relationship，and the protein interaction（PPI） network was constructed by Cytoscape 3.8.2 software.The gene ontology（GO） and the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） were enriched and analyzed for key targets using the R ClusterProfiler package（3.18.0）.The key target-function-pathway diagram and the key target pharmacology regulatory network of TCM were constructed by? Cytoscape 3.8.2.Molecular docking was studied using AutoDock Tools 1.5.6.Results：A total of 146 active ingredients and 245 targets were obtained from Rungan Yangxin Recipe.CN and Rungan Yangxin Recipe shared 38 targets such as interleukin（IL）-1β，IL-6，tumor necrosis factor（TNF），etc.The key targets of KEGG enrichment analysis were mainly enriched in neuroactive ligand-receptor interaction，advanced glycation end products（AGE）-receptor for advanced glycation end products（RAGE） signaling pathways，lipid and atherosclerosis signaling pathways，involving biological processes such as response to xenobiotic stimulus，tube diameter regulation，and vessel diameter maintenance.Molecular docking test showed that the key target showed better binding activity with quercetin，paeoniflorin and kaempferol.Conclusion：The main active components of Rungan Yangxin Recipe may play anti-inflammatory and neurotransmitter role for treating cardiac neurosis by regulating key target genes such as IL-1β，IL-6，TNF，neuroactive ligand-receptor interaction，AGE-RAGE signaling pathway，lipid and atherosclerosis and other pathways.

Keywords cardiac neurosis; Rungan Yangxin Recipe; network pharmacology; molecular docking

心臟神經(jīng)癥（cardiac neurosis，CN）又稱神經(jīng)性循環(huán)系統(tǒng)功能障礙或焦慮性神經(jīng)癥，是典型的循環(huán)系統(tǒng)心身疾?。?］。臨床表現(xiàn)以病人主觀感受到的心血管和神經(jīng)系統(tǒng)功能異常癥狀為主，且伴有明顯的焦慮、抑郁等相關(guān)癥狀。由于缺乏實驗室證據(jù)，臨床上CN一般會在有癥狀、體征較少且無器質(zhì)性心血管疾病病人中診斷［2］。本病好發(fā)于20～50歲中青年，女性多于男性。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，CN臨床患病率高達(dá)25%～35%［3］，且發(fā)病率在全球呈逐年上升趨勢［4］。隨著人們生活方式的改變及社會競爭的日益激烈，醫(yī)學(xué)模式逐漸向生物-心理-社會醫(yī)學(xué)模式轉(zhuǎn)型，各種心理因素如焦慮、抑郁在循環(huán)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中日益受到重視。病人因CN所承受的心理負(fù)擔(dān)及精神痛苦，嚴(yán)重時可影響正常工作和生活，長期發(fā)展將進一步加重心血管器質(zhì)性疾?。?］。

由于CN的發(fā)病與精神、神經(jīng)-內(nèi)分泌、循環(huán)及神經(jīng)遞質(zhì)受體基因表達(dá)等均有密切聯(lián)系，且目前對其發(fā)病機制、臨床特征和治療方法認(rèn)識尚不完善，因此，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)僅以心理治療輔助藥物對癥治療（如鎮(zhèn)靜劑、β-受體阻滯劑、維生素及抗焦慮抑郁劑等），但尚無療效明確藥物，整體效果欠佳，不能很好地預(yù)防和控制CN的發(fā)生發(fā)展。中醫(yī)學(xué)雖沒有心臟神經(jīng)癥的病名，但根據(jù)其臨床特征可按“驚悸”“胸痹心痛”“郁證”“臟燥”等進行診斷和辨證論治［6］。通過本課題組長期臨床實踐發(fā)現(xiàn)，自擬潤肝養(yǎng)心方（藥物組成：麥冬、酸棗仁、柏子仁、炒白芍、當(dāng)歸、五味子、茯苓、炙甘草）治療CN的整體有效率達(dá)86.48%，能明顯改善病人胸悶、心慌、氣短、焦慮等癥狀［7］，作用安全且耐受性高，可有效改善癥狀或恢復(fù)其社會功能。但目前潤肝養(yǎng)心方治療CN的具體作用靶點尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的誕生和發(fā)展為探究中藥成分的藥理機制、復(fù)方干預(yù)疾病的分子機制提供了新思路［8］。通過構(gòu)建成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)和整體角度探求中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制，這在很大程度上與中醫(yī)的整體觀念相契合［9］。故本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對潤肝養(yǎng)心方治療CN的靶點進行預(yù)測，初步探究其作用機制，以期對其治療CN的分子機制進行全面剖析，為本方在臨床的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1資料與方法

1.1藥物活性成分篩選及靶點預(yù)測

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/index.php）、TCM-ID數(shù)據(jù)庫（http：//bidd.group/TCMID/index.html）分別對麥冬、酸棗仁、柏子仁、白芍、當(dāng)歸、五味子、茯苓、炙甘草的活性成分進行檢索，結(jié)合文獻(xiàn)挖掘，獲得此復(fù)方的成分信息。同時，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18為過濾條件［10］，篩選出此8味中藥的活性成分。將篩選得到的化合物分別輸入至TCMSP、有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem，https：//pubchem.Ncbi.nih.gov/search/），前者預(yù)測出化合物的潛在蛋白靶點，后者獲得化合物的簡化分子線性輸入規(guī)范（SMILES表達(dá)式）。將獲取的SMILES表達(dá)式輸入到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.Swisstargetprediction.ch/），限定物種為人（homo sapiens），篩選出可能性（probability）＞0.8的靶點。類似的利用STITCH數(shù)據(jù)庫（http：//stitch.embl.de/），通過SMILES表達(dá)式預(yù)測出相似性評分（tanimoto score）＞0.9的潛在靶點。整合上述預(yù)測出的蛋白靶點，利用UniProt（http：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，設(shè)定屬性為人，將靶點轉(zhuǎn)化為基因官方名稱（official gene symbol）。

1.2疾病潛在靶點篩選

使用基因名片數(shù)據(jù)庫（GeneCard，https：//www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：// www.omim.org/）和DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測關(guān)鍵詞“cardiac neurosis”的相關(guān)疾病靶點，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選條件為相關(guān)性分?jǐn)?shù)（relevance score）≥20。再根據(jù)文獻(xiàn)挖掘補充未預(yù)測到的活性成分的已知靶點，整理并剔除重復(fù)靶點，將疾病靶點與中藥成分潛在靶點取交集，獲得潤肝養(yǎng)心方治療CN的作用靶點。

1.3交集靶點的蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

PPI是指從生物化學(xué)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和遺傳網(wǎng)絡(luò)的角度研究化合物和疾病相關(guān)蛋白質(zhì)分子之間的相關(guān)性。通過應(yīng)用Excel 2016軟件，篩選出潤肝養(yǎng)心方及CN的共有靶點，運用R語言Venn Diagram包（1.6.20）繪制韋恩圖。將交集關(guān)鍵靶點導(dǎo)入STRING（https：//string-db.org）軟件［11］中，選擇物種為“智人”，設(shè)置靶點關(guān)聯(lián)的置信度為0.40（confidence＝0.40）。然后，采用Cytoscape（3.8.2）軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)圖進行美化，并根據(jù)節(jié)點大小和顏色深度反映其連接度大小［12］。

1.4交集靶點基因的基因本體（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

GO系統(tǒng)包含生物學(xué)過程（biological process，BP）、分子功能（molecular functions，MF）、細(xì)胞組分（cellular components，CC）3個部分。對關(guān)鍵靶點做GO功能注釋和KEGG通路，挖掘各基因所代表的生物學(xué)意義。使用R語言Cluster Profiler包（3.18.0）對關(guān)鍵靶點進行基于GO及KEGG的富集分析（P＜0.05），并使用enrich plot包（1.10.2）繪制條形圖及氣泡圖對富集結(jié)果進行可視化。

1.5交集靶點-功能-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

1.5.1交集靶點-功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

將GO富集結(jié)果BP、CC和MF按P值從小到大排序，分別取前20個條目及其對應(yīng)的關(guān)鍵靶點展示，構(gòu)建交集靶點-功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，并使用Cytoscape 3.8.2進行可視化。

1.5.2交集靶點-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

將KEGG通路富集結(jié)果按P值從小到大排序，取前50位的通路及其對應(yīng)的靶點，構(gòu)建交集靶點-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，并使用Cytoscape 3.8.2進行可視化。

1.6交集靶點中藥藥理調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過提取交集靶點對應(yīng)活性成分，構(gòu)建中藥藥理調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape 3.8.2進行可視化。

1.7核心靶點分子對接

從PDB（https：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫得到靶點蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)，并且去除其原本帶有的小分子及水分子，通過AutoDock Tools（1.5.6）完成蛋白質(zhì)加氫、計算電荷。從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載活性成分三維結(jié)構(gòu)，并且使用AutoDock Tools對小分子進行電荷平衡、可旋轉(zhuǎn)的鍵檢查。后根據(jù)受體活性中心選擇對接盒子的范圍。最后，使用AutoDock vina計算受體、配體對接，選擇輸出結(jié)果中結(jié)合自由能最低的結(jié)構(gòu)（結(jié)合親和力最高）。最后利用PyMol 2.4.1軟件進行可視化及美化。

2結(jié)果

2.1潤肝養(yǎng)心方活性成分篩選及靶點預(yù)測

通過查閱TCMSP、TCM-ID數(shù)據(jù)庫及檢索文獻(xiàn)，查找出潤肝養(yǎng)心方8味中藥活性成分?jǐn)?shù)量：酸棗仁33個，柏子仁28個，白芍85個，當(dāng)歸125個，五味子39個，茯苓34個，甘草280個，由于麥冬未收錄在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，因此，在TCM-ID數(shù)據(jù)庫中獲得麥冬活性成分14個。并按照設(shè)定的閾值（OB≥30%，DL≥0.18），在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選復(fù)方的活性成分，剔除重復(fù)后共得到146個活性成分，OB值排名前30位的化合物見表1。并根據(jù)TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction、STITCH數(shù)據(jù)庫得到117個（29個成分無作用靶點）活性成分作用的245個藥物潛在靶點。

2.2CN潛在靶點預(yù)測

通過GeneCards、OMIM和DisGeNET數(shù)據(jù)庫預(yù)測關(guān)鍵詞“cardiac neurosis”的相關(guān)疾病靶點，共預(yù)測得到244個靶點。將上述獲得的藥物靶點與疾病靶點取交集，最終得到潤肝養(yǎng)心方治療CN的共用靶點38個，并通過R1.6.20繪制Venn圖。結(jié)果見圖1。

2.3交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過STRING數(shù)據(jù)庫對38個交集靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，共得到38個蛋白互作關(guān)系，包括38個節(jié)點、215條邊，見圖2。使用節(jié)點的連接度（Degree）識別交集靶點基因，其中，白細(xì)胞介素（IL）1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）在網(wǎng)絡(luò)中處于重要位置。詳見圖2。

2.4交集靶點GO功能富集和KEGG通路富集分析

使用Cluster Profiler中默認(rèn)背景基因集，共富集到1 089條GO過程（P＜0.05 & count＞2），其中BP 937個，CC 107個，MF 45個，潤肝養(yǎng)心方干預(yù)CN涉及對異源刺激的反應(yīng)、管徑的調(diào)節(jié)、血管直徑維持等生物學(xué)過程。KEGG富集到90條通路（P＜0.05 & count＞2），關(guān)鍵通路包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）-糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等。詳見圖3、圖4。

2.5交集靶點-功能-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.5.1交集靶點-功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

共包含60個GO條目、37個交集靶點、388個關(guān)系對。詳見圖5。

2.5.2交集靶點-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

共包含50條KEGG通路、36個交集靶點、296個關(guān)系對。詳見圖6。

2.6交集靶點中藥藥理調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

共包含潤肝養(yǎng)心方8味中藥、藥物活性成分95個、交集靶點38個、249個關(guān)系對。詳見圖7。

2.7分子對接結(jié)果

挑選PPI網(wǎng)絡(luò)中連接度最高的3個靶點IL-1β、TNF、IL-6為核心靶點與活性成分槲皮素（quercetin）、芍藥苷（paeoniflorin）、山柰酚（kaempferol）進行分子對接。從PDB下載以上3個靶點對應(yīng)的晶體結(jié)構(gòu)，選擇IL-1β對應(yīng)的晶體結(jié)構(gòu)PDB ID為5R8Q，IL-6對應(yīng)的為1ALU，TNF對應(yīng)的為5UUI。一般認(rèn)為對接結(jié)合能越低，配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定［13］，結(jié)合能＜0提示配體與受體可自發(fā)結(jié)合［14］，本研究選擇20次對接結(jié)合能最低的構(gòu)象繪制。IL-1β、TNF、IL-6與活性成分槲皮素、芍藥苷、山柰酚的分子對接模式見圖8。圖中綠色環(huán)狀模型為活性分子，活性分子附近的青色棍棒結(jié)構(gòu)是與其有氫鍵相互作用的氨基酸殘基，黃色虛線為活性分子和氨基酸殘基之間形成的氫鍵。

3討論

CN是心血管系統(tǒng)疾病的一種特殊類型，發(fā)病機制復(fù)雜且尚未完全闡明，但目前認(rèn)為焦慮等精神心理因素在CN發(fā)病中起重要作用［15］。本病因焦慮、抑郁等精神心理因素、外界環(huán)境刺激、機體極度疲勞、壓力過大等引起交感神經(jīng)、迷走神經(jīng)功能紊亂，進而導(dǎo)致心臟自主神經(jīng)功能紊亂而誘發(fā)，但無器質(zhì)性病變。病人神經(jīng)類型可分為抑郁、焦慮、憂愁型［16］。因此，CN病人在出現(xiàn)心慌、氣短、心前區(qū)疼痛、胸悶、心率增快等心血管臨床癥狀的同時，還伴有明顯的焦慮、抑郁相關(guān)表現(xiàn)，且癥狀輕重與情緒波動關(guān)系密切。有研究認(rèn)為，CN在伴有焦慮和抑郁障礙時，癥狀的發(fā)作與去甲腎上腺素（NE）和5-羥色胺（5-HT）等中樞神經(jīng)遞質(zhì)功能障礙緊密相關(guān)［17］。

中醫(yī)學(xué)對CN 的認(rèn)識可歸屬于“胸痹”“驚悸”“郁證”等范疇［6］，認(rèn)為其病位在心，與肝、脾、腎密切相關(guān)?！端貑枴れ`蘭秘典論》曰：“心主身之血脈”“心者，君主之官也，神明出焉”“心主血，精神之所舍也”，心之血脈不通則發(fā)為胸悶、胸痛、心悸，心主神明失司則出現(xiàn)憂愁、焦慮，肝主疏泄，調(diào)暢情志，心、肝二臟與精神情志病變關(guān)系密切。本病或由先天稟賦薄弱、久病、心勞過度等內(nèi)因造成氣血陰陽虧虛，或由情志失調(diào)等外因引發(fā)，尤與情緒關(guān)系密切，《黃帝內(nèi)經(jīng)》云：“余知百病生于氣也，怒則氣上……驚則氣亂，思則氣結(jié)”。本病病機為心失所主、肝失疏泄，或肝郁脾虛、心肝陰虛、肝腎陰虛。各種外界影響導(dǎo)致情緒不暢，肝失疏泄，肝氣郁結(jié)，發(fā)為胸悶、氣短、焦慮、抑郁；或過勞體虛，氣血虧損，心耗過度，心血失調(diào)，出現(xiàn)心悸、失眠、乏力；“肝木克脾土”，肝郁乘脾，脾失健運，運化失調(diào)，氣血無以生化，氣血兩虛，心神失養(yǎng)，則心神不寧，心悸、失眠；后期精血漸耗，窮必及腎，出現(xiàn)心肝陰虛、肝腎陰虛之證。因此，治療應(yīng)以疏肝健脾、養(yǎng)心安神為法。近10年來，本課題組通過對CN的中醫(yī)證候規(guī)律及有效藥物進行相關(guān)研究分析，自擬潤肝養(yǎng)心方治療CN，整體有效率達(dá)86.48%［7］。本方在改善病人心悸、乏力、氣短、胸悶、胸痛等臨床癥狀的同時，對焦慮、抑郁相關(guān)精神癥狀療效亦佳，且安全、病人耐受性高。全方潤肝斂陰、養(yǎng)心寧神。方中酸棗仁味酸甘，入心、脾、肝、膽四經(jīng)，功效潤肝寧心安神；柏子仁歸心、腎、大腸經(jīng)，養(yǎng)心安神兼顧斂汗護陰，兩藥合用，能滋潤肝陰之不足、頤養(yǎng)心神之不安。麥冬滋陰清熱；當(dāng)歸、炒白芍補血潤燥；五味子斂心氣、安心神；茯苓、炙甘草補益心脾。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，借助多種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件等構(gòu)建了潤肝養(yǎng)心方治療CN的成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)，并對核心靶點進行了分子對接，共篩選得到潤肝養(yǎng)心方藥物活性成分146個、作用靶點245個，本方通過IL-1β、IL-6、TNF等38個共有靶點與CN相互作用。IL-1β、IL-6及TNF為機體重要的炎性因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［18］。隨著對炎性因子與CN關(guān)系的不斷研究，認(rèn)為亞臨床炎癥反應(yīng)與自主神經(jīng)功能紊亂關(guān)系緊密，其機制可能與自主神經(jīng)系統(tǒng)可有效調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、釋放神經(jīng)遞質(zhì)激活淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞及炎癥細(xì)胞有關(guān)［19］。IL-6、IL-1β具有調(diào)節(jié)免疫、參與機體信號傳遞等作用，TNF-α能反映機體非特異性炎癥反應(yīng)，目前已被證實在心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，還可通過影響神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，參與抑郁的發(fā)生發(fā)展［20］。臨床研究顯示，CN病人體內(nèi)TNF-α水平較健康對照組明顯增高（P＜0.05），存在異常增高的炎性反應(yīng)及內(nèi)皮功能受損［21］。申永輝等［22］研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥病人經(jīng)選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRI）類藥物治療后，血清炎性細(xì)胞因子水平明顯下降（P＜0.05），抑郁癥狀顯著改善。因此，炎癥反應(yīng)能夠加速自主神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展，在CN的發(fā)病中作用亦不可小覷，可以推測，潤肝養(yǎng)心方有效治療CN可能與通過IL-1β、IL-6、TNF等靶標(biāo)抑制炎性因子和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生從而發(fā)揮抗炎作用相關(guān)。5-HT轉(zhuǎn)運體（5-HTT）編碼基因SLC6A4在多種精神心理疾病的發(fā)生發(fā)展中作用較大［23-25］，SLC6A4編碼細(xì)胞膜上的5-HTT，5-HTT將突觸間隙的5-HT回吸收突觸前膜，降低突觸間隙5-HT濃度，參與調(diào)控神經(jīng)元間興奮的傳遞。5-羥色胺能神經(jīng)元廣泛分布于下丘腦、垂體、腎上腺等人腦與社會情感壓力感知、維持、控制相關(guān)的區(qū)域［26］，與情緒調(diào)控、精神心理密切相關(guān)［27］。5-羥色胺能突觸與5-HT密切相關(guān)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT含量及功能異常會導(dǎo)致抑郁、焦慮等精神類疾病。Wankerl等［28］研究發(fā)現(xiàn)，五羥色胺轉(zhuǎn)運體基因（5-HTTLPR）、早期逆境相應(yīng)的SLC6A4表達(dá)改變通過影響5-HT系統(tǒng)來傳達(dá)不同的疾病易感性。多巴胺（DA）是一類使機體產(chǎn)生愉悅感的神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中起重要作用，通過多巴胺受體調(diào)節(jié)如獎賞、成癮、記憶、新陳代謝和激素分泌等多種生理過程。多巴胺受體D1（DRD1）是多巴胺受體兩個亞家族之D1類受體的一種，可增強神經(jīng)元興奮性，參與個體快感的維持［29］。DRD1和多巴胺受體D5（DRD5）通過激活Gs/Golf和刺激環(huán)磷酸腺苷（CAMP）的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)獎賞、運動和認(rèn)知，并在外周組織發(fā)揮有益的作用，包括抑制炎癥反應(yīng)和維持心血管和腎臟的動態(tài)平衡。神經(jīng)受體假說認(rèn)為，抑郁癥與DRD1等多巴胺受體異常表達(dá)密切相關(guān)［30］，而CN的抑郁相關(guān)表現(xiàn)可能也與DRD1有關(guān)。根據(jù)本研究結(jié)果，可以推測潤肝養(yǎng)心方活性成分治療CN有可能通過SLC6A4、DRD1等靶點調(diào)節(jié)機體神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，改善病人焦慮、抑郁等相關(guān)臨床癥狀。

本研究通過GO及KEGG富集分析共得到潤肝養(yǎng)心方治療CN的神經(jīng)活性配體-受體相互作用、AGE-RAGE信號通路脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等信號通路，涉及對異源刺激的反應(yīng)、管徑調(diào)節(jié)、血管直徑維持等生物過程。潤肝養(yǎng)心方治療CN主要作用于5-羥色胺受體2A（HTR2A）、5-羥色胺受體3A（HTR3A）、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白基因SLC6A2、鈉依賴型多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白基因SLC6A3、5-HT轉(zhuǎn)運蛋白基因SLC6A4、DRD1、IL-6、IL-1β等關(guān)鍵靶點，通過神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、AGE-RAGE信號通路對神經(jīng)遞質(zhì)水平和炎癥反應(yīng)進行調(diào)節(jié)。神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路的受體有4類，分別為A類（視紫紅質(zhì)樣）、B類（分泌素樣）、C類（親代謝性谷氨酸鹽/外激素）和離子通道/其他受體，當(dāng)出現(xiàn)焦慮時會導(dǎo)致A類受體表達(dá)下調(diào)［31］。實驗研究顯示，小鼠SLC6A2基因敲除后，缺乏去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體，可導(dǎo)致抗應(yīng)激行為［32］；另有研究表明，SLC6A2、SLC6A3等基因的交互作用可能與中國漢族人群抑郁的發(fā)病相關(guān)［33］。AGE-RAGE信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、凋亡和遷移等方面發(fā)揮重要作用［34］，此通路的激活可通過調(diào)節(jié)炎性因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)［35］。越來越多研究表明，炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)還可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，是抑郁癥、焦慮癥發(fā)病機制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［36-37］。因此，潤肝養(yǎng)心方可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)活性配體-受體相互作用、AGE-RAGE 信號通路達(dá)到治療CN的目的。

通過分子對接驗證顯示，潤肝養(yǎng)心方及CN共有關(guān)鍵靶點IL-6、IL-1β、TNF與槲皮素、芍藥苷、山柰酚的結(jié)合活性較好。槲皮素是黃酮類化合物六大亞類之一，廣泛存在于黃芪、川芎等多種中藥中，通過保護機體神經(jīng)和血管［38］，降低心血管疾病發(fā)病率和死亡率，具有抗氧化、抗凋亡、降脂、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及保護心肌缺血-再灌注損傷等功能［39-41］；芍藥苷是芍藥中的主要活性成分之一，是一種雙向抗炎免疫調(diào)節(jié)藥，可降低慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證焦慮模型大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平，有效改善焦慮、抑郁［42-44］，還具有解痙鎮(zhèn)痛、解熱、抗凝血、調(diào)節(jié)血脂、改善神經(jīng)突觸可塑性損傷等作用［45］。山柰酚為白芍主要活性成分，亦具有抗炎［46］、抗氧化［47］、抗癌［48］、抗骨質(zhì)疏松［49］等作用。另外，槲皮素、山柰酚均可抑制單胺氧化酶活性［50］，可增加腦內(nèi)去甲狀腺素（NE）、5-HT、多巴胺等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平而發(fā)揮抗抑郁作用。因此，可以推測潤肝養(yǎng)心方可能主要通過槲皮素、山柰酚、芍藥苷等活性成分治療CN，并同時改善焦慮、抑郁等相關(guān)癥狀。

4小結(jié)

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，初步得到潤肝養(yǎng)心方通過干預(yù)IL-1β、IL-6、TNF等多靶點及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、AGE-RAGE信號通路等多通路，發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平等作用治療CN，同時還可改善CN病人顯著的焦慮、抑郁等臨床癥狀。本研究為臨床應(yīng)用潤肝養(yǎng)心方治療CN提供了理論依據(jù)，但限于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的局限性，今后尚需進一步實驗驗證。

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（收稿日期：2022-10-21）

（本文編輯鄒麗）