何 靜，李佛生，王晶金，高婷彥，顏 鈁，唐 琳

（四川大學 生命科學學院，四川 成都 610064）

0 引言

麻瘋樹（Jatropha curcas L.）是大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹屬（Jatropha）植物，小喬木或灌木，在我國，麻瘋樹主要分布于廣東、廣西、海南、云南、四川、貴州、臺灣、福建等省區(qū)［1］。麻瘋樹種子含油量高達40%，是理想的生物能源植物，具有很高的經(jīng)濟價值［2］。除了作為油料作物，麻瘋樹中還含有其他豐富的化學成分，目前已從麻瘋樹中鑒定出數(shù)百種化合物［3-5］。徐俊駒等對麻瘋樹酚性成分進行了研究，從麻瘋樹莖的甲醇提取物中分離并鑒定了14個酚性化學成分［6］；馬惠芬等對麻瘋樹樹葉的揮發(fā)性化學成分進行了研究，利用乙醇回流法進行提取，最終鑒定出40 種化合物，包括醛、酮、酯、萜類化合物等［7］。藥理學分析表明麻瘋樹提取物具有抗菌［8］、抗 病 毒［9］、抗 炎［10］、抗 氧 化［11］等 生 物 活性［12］。陸志科等對麻瘋樹葉的抗菌作用進行了研究，通過抑菌圈實驗，發(fā)現(xiàn)麻瘋樹葉乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有較好的抑制效果，對霉菌和酵母菌的抑制效果較弱，測得大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC 為0.156mg/L［8］；Rahu等對麻瘋樹不同部位進行提取研究，結(jié)果表明，其提取物具有抗細菌和抗真菌活性［13］。但大量研究都集中在酚類和萜類化合物中，對于香豆素類化合物的活性成分及作用機理研究較少。

高效液相色譜—質(zhì)譜串聯(lián)分析（LC -MS/MS）將液相色譜的良好分離性與質(zhì)譜選擇靈敏性好結(jié)合起來，鑒于傳統(tǒng)分離鑒定方法耗時且繁瑣，更快速的達到對天然產(chǎn)物化學成分解析的目的。同時輔以標準物質(zhì)比對，能夠準確地對化學物質(zhì)進行定性和定量［14］。如張晨曦等應用LC -MS 在正負離子模式下分析連翹中的主要化學成分，鑒定了24 個化合物，其中有5 個化合物：3，4 -二羥基苯乙醇苷、2 -甲氧基-3，4，5 -三羥基苯乙醇苷、β -羥基化連翹酯苷H、6 -羥基二氫黃酮、二氫楊梅素為首次從連翹中得到鑒定［15］。

香豆素類化合物是一類含苯駢α 吡喃酮結(jié)構(gòu)的芳香含氧雜環(huán)化合物，在中藥材中廣泛存在，具有抗癌、抗菌、抗炎、抗氧化等多種生物活性［16］。研究發(fā)現(xiàn)，天然香豆素類化合物具有良好的抗菌效果，花椒毒酚、異茴芹內(nèi)酯等表現(xiàn)出了對金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌、銅綠假單胞菌的抑制作用［17］。香豆素化合物具有分子量小、結(jié)構(gòu)類型豐富、抗菌活性強等優(yōu)點，具有良好的抗菌潛能［18］。

本文通過乙醇—乙酸（1∶ 1）混合溶劑，提取麻瘋樹中的香豆素類化合物，采用LC -MS 進行定性及定量分析。此外，通過體外抑菌實驗驗證麻瘋樹提取物的抑菌效果，進而采用肉湯微量稀釋法測定麻瘋樹提取物的MIC和MBC，最后通過生長曲線進一步驗證了麻瘋樹提取物的抑菌效果及麻瘋樹枝葉中香豆素類化合物的抗菌機制。

1 材料、儀器及試劑

1.1 材料

麻瘋樹新鮮枝葉（10 年以上樹木的新鮮枝葉）：2022 年4 月采自四川省涼山州金陽縣，由四川德農(nóng)生物能源股份有限公司提供。大腸桿菌（E.coli）ATCC25922、金黃色葡萄球菌（S.aureus）ATCC25923購自上海保藏生物技術(shù)中心。

1.2 儀器及試劑

主要儀器：RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；JP-500B -8 高速多功能粉碎機（上海市久品工貿(mào)有限公司）；電子精密分析天平（瑞士Mettler公司）；液相色譜串聯(lián)飛行時間高分辨質(zhì)譜儀（SCIEX QToF 5600 ＋）、液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（SCIEX Triple Quad QqQ 5500）；連續(xù)波長酶標儀（Thermo scientific）。

主要試劑：甲醇（色譜純）購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司；乙醇、乙酸（分析純）購于成都科龍化工試劑廠；佛手柑內(nèi)酯、黃芩素、野漆樹苷標準品購于上海詩丹德生物技術(shù)有限公司。

2 實驗方法

2.1 麻瘋樹提取物樣品的制備

采用雙溶劑法進行提取，將麻瘋樹新鮮枝葉于粉碎機中粉碎后，稱取麻瘋樹粉末按1∶ 20、1∶ 15料液比于95%乙醇和乙酸（1∶ 1）混合的溶劑中，70℃水浴提取2h，過濾，收集濾液，濾渣按粉末重1∶ 15料液比于95%乙醇和乙酸（1∶ 1）混合的溶劑中，70℃水浴提取2h，過濾，合并兩次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃濃縮至浸膏狀，以蒸餾水溶出，將樣品置于-80℃中預凍24h，隨后于凍干機中-80°C，真空度9pa 條件下凍干24h，收集凍干樣品，置于-20℃冰箱中密閉冷藏備用。用蒸餾水稀釋樣品粉末至1.2mg/mL，得麻瘋樹提取物（JE）用于抑菌實驗。

2.2 紫外掃描吸收光譜

將麻瘋樹提取物粉末用甲醇配制成0.5mg/mL的溶液，于連續(xù)波長酶標儀上在200nm—1 000nm間進行吸收光譜掃描。

2.3 LC-MS非靶標分析

2.3.1 色譜—質(zhì)譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18 色譜柱（2.1mm×100mm，1.8μm），流動相A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈，流速0.4mL/min，采用梯度洗脫方法：2%B（0—1min），2%—95%B（1—10min），95%B（10—12min），95%—2%B（12—12.1min），2%B（12.1—15min）；樣品室溫25℃、柱溫40℃；進樣量10μL。

離子源：電噴霧離子源（ESI ＋）；掃描方式：正負離子掃描；正離子模式下，噴霧電壓：5 500v；去溶劑溫度：500℃；氣簾氣：35psi；霧化氣：50psi；輔助加熱氣：50psi；負離子模式下，噴霧電壓：-4 500v；去溶劑溫度：500℃；氣簾氣：35psi；霧化氣：50psi；輔助加熱氣：50psi。

2.3.2 樣品制備

稱取制備的麻瘋樹提取物粉末，用甲醇制備成500ng/mL樣品液，乙醇和乙酸按1：1 混合作空白對照，0.22μm PVDF微孔濾膜過濾后備用。

2.4 定量分析

2.4.1 色譜條件

色譜柱為Thermo Hypersil Gold C18（2.1mm ×100mm，1.9μm），流動相A 為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈，流速0.4mL/min，采用梯度洗脫方法：5%B（0—0.5min），5%—95% B（0.5—6min），95% B（6—8min），95%—5%B（8—8.1min），5%B（8.1—10min）；樣品室溫25℃、柱溫40℃；進樣量1μL。

2.4.2 標準品溶液的制備

精密稱取黃芩素、野漆樹苷、佛手柑內(nèi)酯標準品適量，用80%色譜甲醇分別配制成1mg/mL 母液。將各對照品原液梯度稀釋后用于標準曲線測定，具體稀釋濃度如表1 所示。

表1 黃芩素、佛手柑內(nèi)酯、野漆樹苷的標準曲線濃度Table 1 Gradient dilution of control stock solution

2.4.3 樣品溶液的制備

稱取制備的麻瘋樹提取物樣品粉末（JE），使用80%甲醇（色譜級）配制成500ng/mL 樣品液，0.22μm PVDF微孔濾膜過濾后備用。

2.5 體外抑菌實驗

培養(yǎng)基的制備。LB 肉湯培養(yǎng)基：取蛋白胨10.0g，酵母膏粉5.0g，氯化鈉10.0g，加1 000mL 蒸餾水，加熱溶解，121℃滅菌20min；LB 瓊脂培養(yǎng)基：取蛋白胨10.0g，酵母膏粉5.0g，氯化鈉10.0g，瓊脂20g，加1 000mL 蒸餾水，加熱溶解，121℃滅菌20min。MH液體培養(yǎng)基：稱取22g 培養(yǎng)基干粉加1 000mL蒸餾水溶解，121 ℃滅菌20min。

菌懸液的制備。將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌凍干粉活化，全部接種至2 只斜面上于37 ±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18—24h。用接種環(huán)挑取菌接種于50mLLB液體培養(yǎng)基中，37 ±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12—18h，使用LB 肉湯培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度，以此作為后續(xù)實驗菌懸液，菌懸液在4℃條件下保存。將試管斜面貯存于4℃冰箱內(nèi)作為保存菌備用。

抑菌活性的測定。采用濾紙片法測定麻瘋樹提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌活性。取用冷卻至55℃左右的LB 瓊脂培養(yǎng)基20mL 于無菌平板中，加入100μL 菌懸液涂布均勻，制成檢測平板備用。將浸泡麻瘋樹樣品稀釋液的6mm 飽和濾紙片晾干，貼在檢測平板表面，倒置于37 ± 1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈，測量抑菌圈直徑大小，以75%乙醇作為陽性對照。

菌落計數(shù)實驗。將0.5mL 菌液放入4.5mL 樣品中反應10min后，將反應后的樣品液梯度稀釋后取100μL涂布平板，倒置于37 ±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，選擇菌落數(shù)為30—300 的平板測量菌落個數(shù)，以無菌水作為對照。計算殺滅對數(shù)值，計算公式為：殺滅對數(shù)值（KL）＝對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（No）-實驗組活菌濃度對數(shù)值（Nx）。

參考CLSI M07 -A9 方法［19］，采用肉湯微量稀釋法測定提取物的MIC 和MBC。取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液，MH 液體培養(yǎng)基調(diào)整菌體濃度為1 ×106CFU/mL，加入提取液使終濃度分別為0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25 和12.5mg/mL，加入等體積的生理鹽水為陽性對照，以不加菌液的培養(yǎng)基作為陰性對照。37℃培養(yǎng)24h，觀察細菌生長狀況，與陰性對照相比無顯著變化為MIC，吸取100μL上述培養(yǎng)液涂布，37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形成情況，將不長菌落的平板所對應的濃度定為MBC。

生長曲線的測定。將細菌菌液用LB 液體培養(yǎng)基調(diào)整菌體濃度為108CFU/mL。向含菌LB培養(yǎng)基中加入提取物使其最終濃度分別為1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC，加入等體積0.85 %生理鹽水作為對照，頭孢作為陽性對照，37℃下180r/min 培養(yǎng)。每隔2h 取樣，測定600nm波長處的吸光值，連續(xù)測定24h。

3 結(jié)果及分析

3.1 麻瘋樹提取物紫外光譜掃描結(jié)果

將麻瘋樹提取物在200—1 000nm 范圍內(nèi)進行光譜掃描（圖1），麻瘋樹提取物在275nm、287nm、310nm處出現(xiàn)吸收峰。未取代的香豆素，其紫外吸收光譜一般可呈現(xiàn)275nm、284nm和310nm3 個吸收峰［20］，表明麻瘋樹提取物中主要成分為香豆素類化合物。

圖1 麻瘋樹提取物200—1 000nm光譜掃描結(jié)果Figure 1 Spectral scan of Jatropha curcas extracts at 200 -1 000nm

3.2 麻瘋樹香豆素類化合物非靶標物質(zhì)篩選

本實驗采用了LC -MS，對麻瘋樹樹葉樣品粗提液中的化學成分進行定性分析（表2）。經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對及文獻查閱從麻瘋樹提取液中確定了11 種物質(zhì)，如2S-2 -羥基丁二酸、原兒茶酸、葡萄糖酸等。

表2 麻瘋樹提取物化學成分分析結(jié)果Table 2 The results of component identification of J.curcas by LC-MS

3.3 麻瘋樹3 種單體化合物定量分析

紫外光譜分析表明，麻瘋樹提取物中主要成分為香豆素類化合物。通過非靶標篩選到具有抑菌作用的佛手柑內(nèi)酯。在提取物中，同時還發(fā)現(xiàn)了具有抑菌作用黃芩素、野漆樹苷。對佛手柑內(nèi)酯、黃芩素和野漆樹苷進行定量分析，其標準品與樣品提取的離子流圖如圖2—4 所示。結(jié)果（表3、圖5—7）表明，佛手柑內(nèi)酯相對含量最高，達18.66%，黃芩素次之（2.76%），野漆樹苷含量最少（0.16%）。佛手柑內(nèi)酯為首次在麻瘋樹化學成分鑒定中發(fā)現(xiàn)。

圖2 佛手柑內(nèi)酯標準品與麻瘋樹樣品的提取離子流Figure 2 Ion chromatogram shows the calibration standard of Bergapten and JE sample.

圖3 黃芩素標準品與麻瘋樹樣品的提取離子流Figure 3 Ion chromatogram shows the calibration standard of Baicalein and JE sample.

圖4 野漆樹苷標準品與麻瘋樹樣品的提取離子流Figure 4 Ion chromatogram shows the calibration standard of Rhoifolin and JE sample.

圖5 佛手柑內(nèi)酯標準曲線Figure 5 The standard curve of Bergapten

圖6 黃芩素標準曲線Figure 6 The standard curve of Baicalein

圖7 野漆樹苷標準曲線Figure 7 The standard curve of Rhoifolin

表3 麻瘋樹提取物中3 種化合物的定量分析結(jié)果Table 3 The quantitative analysis of three compounds in JE

3.4 JE對S.aureus、E.coli的抑菌活性結(jié)果

為了探究JE的抑菌活性，研究選取金黃色葡萄球菌（S.aureus）和大腸桿菌（E.coli）作為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的代表，測定了抑菌圈直徑（表4）。經(jīng)過JE處理培養(yǎng)24h后發(fā)現(xiàn)，與75%乙醇處理相比，S.aureus和E.coli均產(chǎn)生明顯的抑菌圈，最大抑菌圈直徑達14.43 mm。在對JE 進行稀釋后，結(jié)果表明50%濃度的提取物處理時，S.aureus和E.coli依然可以形成明顯的抑菌圈；10%濃度的提取物處理時，S.aureus 和E.coli 的抑菌圈消失（圖8），表明JE對S.aureus和E.coli的抑制效果呈劑量依賴性。實驗證明JE 顯著抑制S.aureus 和E.coli的生長。

圖8 （A）麻瘋樹提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性（B）麻瘋樹提取液對大腸桿菌的抑菌活性Figure 8 （A）Bacteriostatic activity of Jatropha curcas extract against S.aureus（B）Bacteriostatic activity of Jatropha curcas extract against E.coli.

表4 JE對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑Table 4 Diameters of antibacterial circles when S.aureus and E.coli.treated with JE.

進一步對抑菌圈的直徑進行顯著性分析。由圖9 可見，JE 各處理組對S.aureus 和E.coli 的抑菌圈直徑均顯著大于75%乙醇處理組，JE不同處理組對S.aureus的抑菌圈直徑均與E.coli 有顯著性差別。將JE 處理菌液10 min 后進行平板涂布，結(jié)果證明實驗組平板上均無菌落生長，其殺滅對數(shù)值分別達8.7、8.79（表5）。證明麻瘋樹提取物對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有良好的抑制效果，且對于金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于大腸桿菌。

圖9 JE對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑Figure 9 Diameters of antibacterial circles when S.aureus and E.coli.treated with JE.

表5 JE的殺滅對數(shù)值Table 5 Killing log value of JE

3.5 最小抑菌濃度和最低殺菌濃度測定

通過肉湯微量稀釋法測定金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC和MBC（表6）。由表6 可見，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC分別為1.56 mg/mL和3.125 mg/mL，MBC為6.25 mg/mL。

表6 JE的MIC和MBCTable 6 MIC and MBC measurement of JE treatment

3.6 JE對S.aureus、E.coli的生長曲線測定

以不同濃度的麻瘋樹提取物（1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC）處理金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，并用頭孢處理作為陽性對照，測定其生長情況進一步驗證麻瘋樹提取物的殺菌作用（圖10、11）。

圖10 JE對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響Figure 10 Effect of JE on the growth curve of S.aureus

圖11 JE對大腸桿菌生長曲線的影響Figure 11 Effect of JE on the growth curve of E.coli

從圖10、11 可見，對于金黃色葡萄球菌，細菌的生長速度隨著JE 的濃度升高而減慢。在前8h，細菌迅速生長，8h 后生長速度變慢，MIC 處理組和頭孢（陽性對照）處理組的OD 值在24h 內(nèi)無明顯變動。對于大腸桿菌，對照組生長長勢良好，1/2MIC組在8 h 后開始生長，MIC 處理組和頭孢（陽性對照）處理組OD值無明顯變化。

4 討論

植物是提取天然產(chǎn)物的重要來源，為藥理學研究提供了豐富的資源［21］。麻瘋樹作為能源資源植物，枝葉在民間習用于體外給藥［13］。在抗炎，抗菌，抗腫瘤方面，目前已經(jīng)成為研究熱點。然而，麻瘋樹中具有活性成分的單體化合物依然不明確。

香豆素類化合物廣泛存在于植物中，目前在麻瘋樹中鑒定出的香豆素類化合物包括5 -羥基-6，7 -二甲氧基香豆素、5，6 -二羥基-7 -甲氧基香豆素（Isofraxetin）、異紫花前胡內(nèi)酯（Marmesin）、Propacin、東莨菪素（Scopaletin）、6 -甲氧基-7 -羥基香豆素、麻瘋樹素（Jatrophin）等［4］。本研究經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對、查閱文獻等，首次在麻瘋樹中鑒定得到佛手柑內(nèi)酯（Bergapten）。將干燥枝葉采用同樣的提取方法進行提取，也鑒定到了佛手柑內(nèi)酯，推測是由于提取方法的改變，以往麻瘋樹樹枝葉的提取方法主要是利用甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯等溶劑進行提?。?］，由于乙酸乙酯在生產(chǎn)應用上具有爆炸的風險，因此我們采用乙醇＋乙酸雙混合溶劑的提取方法。此外，本研究使用高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)分析，對提取物中的片段進行鑒定，具有高靈敏度，高精度的特點。通過數(shù)據(jù)庫進行比對，可以發(fā)現(xiàn)更多未知的化學成分。因此，本研究采用雙溶劑法提取，結(jié)合高效液相色譜—質(zhì)譜串聯(lián)分析，首次從麻瘋樹提取物中鑒定到佛手柑內(nèi)酯。

有研究表明，植物的提取物具有抑菌活性。Auwal研究發(fā)現(xiàn)麻瘋樹根皮水浸提液具有抑菌活性，作用濃度為12.5mg/mL［22］；Igbinosa在對麻瘋樹莖皮的抑菌活性的研究中發(fā)現(xiàn)其甲醇提取物、乙醇提取物、水提取物均顯示抑菌活性，能夠抑制酵母菌、念珠菌等真菌生長［23］。本研究使用乙醇和乙酸（1：1）混合提取了麻瘋樹枝葉提取液，對大腸桿菌的MIC為3.125mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC為1.56mg/mL，表現(xiàn)出良好的抑菌活性。經(jīng)LC -MS鑒定了三種化合物，其中佛手柑內(nèi)酯含量最高。既往研究表明，佛手柑內(nèi)酯有抗炎、抗菌及預防骨質(zhì)疏松等多重作用［24］。Golfakhrabadi 研究發(fā)現(xiàn)佛手柑內(nèi)酯對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌具有抑制作用，且推測其C5 上的OCH3基團是抑菌活性的功能位點［25］。與前人研究結(jié)果一致，本研究經(jīng)體外抑菌實驗證實了麻瘋樹中的香豆素類化合物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用，其殺滅對數(shù)值分別達8.7、8.79。

在對抑菌活性的研究中，不同濃度處理下細菌的生長情況反映了該藥物對細菌的抑制情況，對藥物的劑量研究有非常重要的參考價值。Lovato等研究了綠茶提取物的抑菌活性物質(zhì)，生長曲線表明，提取物對單芽孢桿菌具有抑制作用［26］；岳明等通過生長曲線測定法，對洋甘菊殘渣乙酸乙酯提取物進行了抑菌測試并發(fā)現(xiàn)其顯著抑制了對數(shù)期金黃色葡萄球菌的生長［27］。本研究分析了麻瘋樹提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長曲線的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MIC濃度下，麻瘋樹提取物可完全抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長；1/4 MIC和1/2 MIC濃度不能完全抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長，表明麻瘋樹提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用存在劑量依賴性。

5 結(jié)論

本研究通過乙醇—乙酸回流法從麻瘋樹提取物中定量了三種具有抑菌作用的化合物，其中佛手柑內(nèi)酯含量最高，相對含量達18.66%。體外抑菌實驗證明麻瘋樹提取物具有良好的抑菌效果，在濃度為1.56mg/mL時可對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制生長的作用。佛手柑內(nèi)酯作為其中的香豆素類化合物，是麻瘋樹枝葉抑菌的有效活性成分之一，后續(xù)有待對其作用機制進行進一步研究。