徐鳳霞 , 孫萬里 , 張亞文 , 常 爽 , 王一新 , 趙 鵬

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 , 山東 泰安 271018)

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病(Reticuloendotheliosis,RE)是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)感染引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的常見腫瘤病之一[1],是以肝臟和法氏囊等器官組織出現(xiàn)大小不一的灰色結(jié)節(jié)和彌漫性病變?yōu)橹饕卣鞯囊环N病理綜合征[2-3]。雖然雞群感染REV一般不會(huì)直接導(dǎo)致死亡,但會(huì)引起患雞發(fā)生嚴(yán)重免疫抑制,進(jìn)而極易遭受其他病毒或細(xì)菌的侵害。近年來研究表明,REV易與其他病毒發(fā)生混合感染[4-5],并可通過污染的禽活疫苗進(jìn)行傳播[6-7],導(dǎo)致雞群在接種污染的疫苗后不僅沒有產(chǎn)生免疫保護(hù)效力,甚至增強(qiáng)了REV對(duì)無特定病原體(Specific pathogen free,SPF)雞的致病作用。雖然Ren等[8]將提取的表面糖蛋白gp90與胞嘧啶-鳥嘌呤寡脫氧核苷酸(Cytosine phospho guanine oligodeoxynucleotide,CpG-ODN)佐劑一起用于種雞免疫時(shí),確定gp90蛋白疫苗誘導(dǎo)的母源抗體可有效保護(hù)大多數(shù)雛雞免受REV感染,但迄今尚未有商品化疫苗或藥物可用于RE防控,為最大程度降低REV感染帶來的危害,有針對(duì)性的設(shè)計(jì)凈化方案、完善凈化程序并建立可靠的檢測(cè)方法是有效控制該病的重要途徑之一。為此,本試驗(yàn)利用不同的感染途徑將REV感染雞胚或雛雞,運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)和間接免疫熒光試驗(yàn)(Indirect immunofluorescence assay,IFA)3種檢測(cè)方法分析感染雞的排毒規(guī)律,為未來實(shí)施種源凈化提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 REV毒株LN1201為2012年本實(shí)驗(yàn)室從某父母代肉種雞場(chǎng)疑似感染REV的雞血漿中分離得到,已完成全基因組測(cè)序(GenBank登錄號(hào):KU641115.1),經(jīng)RT-qPCR鑒定無馬立克氏病毒(Marek's disease virus,MDV)、傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)和雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的污染,經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)鑒定無禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)的污染。SPF雞胚,購(gòu)自山東濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(魯)2018—0005,雞胚經(jīng)75%酒精消毒后在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽腫瘤病與免疫抑制病實(shí)驗(yàn)室孵化箱內(nèi)孵化至21日齡,之后飼養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)動(dòng)物房負(fù)壓隔離器內(nèi)。LN1201毒株在雞成纖維細(xì)胞系(Douglas foster-1,DF-1)上增殖后,按照Reed-Muench法測(cè)定其組織半數(shù)感染量(50% tissue culture infective dose,TCID50)。

1.2 主要試劑 FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體,購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;病毒RNA提取試劑盒,購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司;Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green ProTaqHS預(yù)混型qPCR試劑盒II,均購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司;REV特異性單克隆抗體11b118小鼠純化腹水,由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽腫瘤病與免疫抑制病實(shí)驗(yàn)室制備和保存,其效價(jià)為1∶8 000;4%多聚甲醛細(xì)胞固定液,購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 PCR儀,購(gòu)自德國(guó) Eppendorf 公司;電泳槽,購(gòu)自北京六一儀器公司;凝膠成像儀,購(gòu)自BIO-RAD公司;熒光定量PCR儀,購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司;恒溫水浴鍋,購(gòu)自英國(guó)Grant公司;超凈臺(tái),購(gòu)自加拿大Cabinets公司;核酸定量?jī)x,購(gòu)自Pharmacia Biotech公司;倒置熒光顯微鏡,購(gòu)自日本NIKON公司。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將140枚SPF雞胚隨機(jī)分為5個(gè)組,分別為卵黃囊感染組(50枚)、卵黃囊感染同居組(20枚)、腹腔感染組(30枚)、腹腔感染同居組(20枚)和空白對(duì)照組(20枚)。卵黃囊感染組于6胚齡經(jīng)卵黃囊接種LN1201病毒液,接種劑量為1 500 TCID50/枚;卵黃囊感染同居組將6胚齡SPF雞胚與卵黃囊感染組在同一孵化箱孵化出殼和飼養(yǎng);腹腔感染組隨機(jī)挑選正常孵化后的無REV、MDV、IBDV、CIAV和ALV污染的SPF雞(陰性SPF雞)20只,1日齡時(shí)經(jīng)腹腔接種LN1201病毒液,接種劑量為2 000 TCID50/只;腹腔感染同居組隨機(jī)挑選同期孵化的陰性SPF雞10只與腹腔感染組共同飼養(yǎng);以同期孵化陰性SPF雞作為空白對(duì)照組。在為期10周的試驗(yàn)周期內(nèi),每隔7 d進(jìn)行1次體重測(cè)定,并繪制體重增長(zhǎng)曲線;觀察雞群死亡情況,計(jì)算死亡率并繪制生存曲線。動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SDAUA-2021-038),嚴(yán)格按照山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的倫理和生物安全準(zhǔn)則進(jìn)行。

1.5 樣品采集 采集各組SPF雞感染后第1、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70天時(shí)的抗凝血,于3 000 r/min離心2 min分離血漿,無菌置于1.5 mL離心管中備用。

1.6 IFA檢測(cè)病毒血癥 DF-1細(xì)胞培養(yǎng)于24孔細(xì)胞板,待細(xì)胞密度為70%～80%時(shí),每孔接種80 μL雞血漿樣品,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,更換含1%胎牛血清的維持液,繼續(xù)培養(yǎng)6～7 d后棄去培養(yǎng)液;貼壁加入PBS以沖洗剩余培養(yǎng)液,緩慢貼壁加入4%多聚甲醛細(xì)胞固定液,25 ℃固定5～8 min后棄去固定液;貼壁加入PBS以沖洗剩余固定液,加入250 μL REV特異性單克隆抗體11b118小鼠純化腹水,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育60 min;棄去單克隆抗體后以PBS沖洗3遍,加入FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體250 μL,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育60 min,PBS沖洗3遍后滴入50%甘油,置于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7 RT-PCR檢測(cè)REV核酸陽性率 根據(jù)GenBank上發(fā)表的REV全基因組序列,使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)pol基因的RT-PCR引物(表1),用于檢測(cè)血漿樣品的REV核酸陽性率。參照病毒RNA提取試劑盒說明書提取分離血漿樣品的病毒核酸進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。RT-PCR首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)程序:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,置于4 ℃;然后進(jìn)入PCR循環(huán),反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,置于4 ℃。

表1 用于檢測(cè)REV的RT-PCR引物

1.8 RT-qPCR檢測(cè)REV核酸陽性率和病毒載量 根據(jù)GenBank上發(fā)表的REV全基因組序列,使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)pol基因的RT-qPCR引物(表2),用于檢測(cè)血漿樣品的REV核酸陽性率和病毒載量。參照病毒RNA提取試劑盒說明書提取分離血漿樣品的病毒核酸進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。RT-qPCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火34 s,共40個(gè)循環(huán)。

表2 用于檢測(cè)REV的RT-qPCR引物

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行方差分析,P<0.05 認(rèn)為差異顯著,P>0.05認(rèn)為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同感染方式對(duì)SPF雞體重的影響 體重增長(zhǎng)曲線如圖2所示,與空白對(duì)照組相比,腹腔感染組和卵黃囊感染組的SPF雞在感染后第21～70天體重增長(zhǎng)均受到顯著抑制(P<0.05),自感染后第28天起與空白對(duì)照組的體重差距呈現(xiàn)逐漸增大趨勢(shì);2種感染方式的同居感染組自感染后第56天起與空白對(duì)照組的體重差距呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì),但差異均不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明,SPF雞感染REV可引起增重下降,卵黃囊感染組和腹腔感染組下降更為明顯。

圖1 各組SPF雞的體重增長(zhǎng)曲線

圖2 各組SPF雞血漿中REV病毒載量檢測(cè)

2.2 不同感染方式對(duì)SPF雞死亡率的影響 死亡率如表3所示,空白對(duì)照組SPF雞未出現(xiàn)死亡,卵黃囊感染組SPF雞在感染后第7天出現(xiàn)死亡,腹腔感染組SPF雞在感染后第14天才開始出現(xiàn)死亡;與空白對(duì)照組相比,卵黃囊感染組SPF雞的死亡率在感染后第49和63天顯著升高(P<0.05),腹腔感染組SPF雞的死亡率在感染后第42天顯著升高,而2種感染方式的同居組SPF雞死亡率與空白對(duì)照組相比均差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明,垂直傳播感染REV更容易引起低日齡SPF雞死亡。

表3 各組SPF雞的死亡率

2.3 不同感染方式對(duì)SPF雞REV排毒情況的影響 IFA檢測(cè)結(jié)果如表4所示,腹腔感染組SPF雞在感染后第7天即可檢測(cè)到病毒血癥陽性,陽性率為15.0%(3/20),在感染后第14天時(shí)病毒血癥陽性率高達(dá)100%;卵黃囊感染組SPF雞病毒血癥陽性率自感染后第1天開始即維持在89.5%～100%;而卵黃囊感染同居組的10只SPF雞在同居的第7天,有2只SPF雞呈病毒血癥陽性;腹腔感染同居組的SPF雞在同居的第21天才開始有病毒血癥陽性出現(xiàn),僅有1只SPF雞呈病毒血癥陽性。結(jié)果表明,通過垂直傳播感染帶毒的雞更容易導(dǎo)致REV早期水平傳播。

表4 各組SPF雞的病毒血癥陽性率

2.4 不同感染方式對(duì)SPF雞血漿中REV陽性率的影響 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如表5所示,卵黃囊感染組SPF雞自出殼即能檢測(cè)到血漿呈REV陽性,陽性率為36.0%;卵黃囊感染同居組SPF雞在同居后第14天時(shí)可檢測(cè)到血漿中REV核酸陽性,陽性率為12.5%;腹腔感染組SPF雞在感染后第7天可檢測(cè)到血漿中REV核酸陽性,陽性率為30.0%;腹腔感染同居組SPF雞在同居后第42天可檢測(cè)到血漿中REV核酸陽性,陽性率為11.1%。結(jié)果表明,早期感染REV的雞,病毒會(huì)在體內(nèi)不斷增殖,形成持續(xù)的帶毒和排毒狀態(tài)。

表5 各組SPF雞血漿中REV陽性率

2.5 不同感染方式對(duì)SPF雞血漿中REV陽性率和病毒載量的影響 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果如表6和圖2所示,卵黃囊感染組SPF雞自出殼即為REV全部陽性,血漿中病毒載量在感染后第21天達(dá)到第1次高峰,隨后逐漸下降;卵黃囊感染組SPF雞血漿中REV病毒載量在感染后第21天顯著高于腹腔感染組SPF雞(P<0.05);卵黃囊感染同居組SPF雞在同居后第7天可檢測(cè)到血液中REV核酸陽性,陽性率為20.0%;腹腔感染組SPF雞在感染后第7天可檢測(cè)到血漿中REV核酸陽性,陽性率為80.0%,且血漿中病毒載量在感染后第42天達(dá)到高峰;腹腔感染同居組SPF雞在同居后第21天可檢測(cè)到血液中REV核酸陽性,陽性率為10.0%。

表6 各組SPF雞血液中REV陽性率

3 討論

RE作為禽類病毒性腫瘤病之一,其廣泛流行給家禽業(yè)帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[9-10]。雞群感染本病后呈現(xiàn)食欲減退、精神倦怠等非特征性臨床癥狀,常與禽白血病難以區(qū)分。研究表明,REV易感染低日齡禽類,引起禽類免疫功能紊亂[6]。該病目前尚無有效治療措施,只能根據(jù)本病的感染方式和傳播特點(diǎn),定期對(duì)雞群進(jìn)行檢測(cè)淘汰,從種源控制上降低本病的傳播才能最大限度的發(fā)揮種禽生產(chǎn)性能。因此,系統(tǒng)了解不同途徑感染REV后雞群的病毒復(fù)制和排毒動(dòng)態(tài),對(duì)種禽企業(yè)科學(xué)制定REV凈化方案有一定參考價(jià)值。

迄今為止,對(duì)雞群通過垂直傳播、自然感染和同居感染REV后的排毒規(guī)律仍缺乏系統(tǒng)的數(shù)據(jù)資料。本試驗(yàn)選擇6胚齡SPF雞胚和1日齡雛雞感染2種方式分別建立了模擬REV垂直傳播和水平傳播感染的模型,同時(shí)還分別設(shè)置了2種感染方式的同居感染組,綜合運(yùn)用RT-PCR、RT-qPCR和IFA 三種檢測(cè)技術(shù),在系統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn)中對(duì)REV開展動(dòng)態(tài)檢測(cè)和比較分析。REV感染的危害具有明顯的日齡相關(guān)性,越是低日齡的雞感染發(fā)病越嚴(yán)重[11-12],而經(jīng)垂直傳播感染造成的危害是其中最嚴(yán)重的。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,腹腔感染組和卵黃囊感染組SPF雞體重增長(zhǎng)在感染后第21～70天均受到顯著抑制(P<0.05);卵黃囊感染組SPF雞的死亡率在感染后第49和63天顯著升高(P<0.05),腹腔感染組SPF雞的死亡率在感染后第42天顯著升高(P<0.05);而卵黃囊感染同居組和腹腔感染同居組SPF雞體重增長(zhǎng)和死亡率均無顯著性差異。結(jié)果表明,與水平傳播感染相比,REV更容易經(jīng)垂直傳播和早期腹腔感染而引起SPF雞增重緩慢和死亡。

在對(duì)RE實(shí)施凈化過程中,育雛過程中進(jìn)行病毒分離是檢測(cè)和淘汰REV陽性雞的重要步驟之一[13]。本試驗(yàn)通過病毒分離觀察了以不同方式感染REV后雞群病毒血癥情況,卵黃囊感染組SPF雞自出殼就可檢測(cè)到REV病毒血癥陽性,陽性率維持在89.5%～100%,并自感染后第21天后一直維持100%陽性,這進(jìn)一步證實(shí)了REV經(jīng)雞胚垂直傳播容易形成持續(xù)性病毒血癥。本試驗(yàn)腹腔感染組SPF雞在感染后第7天時(shí)即可檢測(cè)到REV病毒血癥陽性,在感染后第14天時(shí)病毒血癥陽性率可高達(dá)100%(18/18),且后續(xù)表現(xiàn)為持續(xù)性的病毒血癥,這與崔帥[14]采用PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交對(duì)腹腔接種REV的SPF雞進(jìn)行排毒情況的檢測(cè)結(jié)果一致?？梢钥闯?早期腹腔感染與垂直感染雞的排毒規(guī)律類似,均顯示持續(xù)性的病毒血癥。本試驗(yàn)卵黃囊感染同居組的10只SPF雞在感染后第7天時(shí),有2只呈病毒血癥陽性,但此后陽性率一直較低;腹腔感染同居組SPF雞在感染后第21天時(shí)檢出病毒血癥陽性,與卵黃囊感染同居組一樣維持較低陽性率。在連續(xù)10周的觀察期內(nèi),卵黃囊感染同居組和腹腔感染同居組SPF雞少部分出現(xiàn)一過性的病毒血癥陽性,另一部分并未檢測(cè)到REV。

與禽白血病病毒凈化檢測(cè)中存在內(nèi)源性病毒核酸干擾的現(xiàn)象不同[15],通過核酸檢測(cè)可以有效檢出REV,目前已有應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)REV的相關(guān)報(bào)道[16-17],這為通過核酸檢測(cè)REV進(jìn)而實(shí)施凈化工作提出了可能。本試驗(yàn)結(jié)合RT-qPCR、RT-PCR和IFA 三種檢測(cè)方法對(duì)血液中的REV進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,RT-qPCR與IFA的檢測(cè)結(jié)果高度吻合,而RT-PCR的檢出率顯著低于另二者,表明雞群感染REV后,可考慮聯(lián)合應(yīng)用RT-qPCR和IFA檢測(cè)REV以提高凈化淘汰效率。

綜上所述,本試驗(yàn)通過多種檢測(cè)技術(shù)分析經(jīng)不同途徑感染REV后雞群血液中的帶毒情況,發(fā)現(xiàn)早期腹腔感染與垂直感染雞的排毒規(guī)律類似,均顯示持續(xù)性的病毒血癥,聯(lián)合應(yīng)用RT-qPCR和IFA檢測(cè)REV適用性強(qiáng),為將來制定REV凈化方案提供了數(shù)據(jù)參考。