念家輝 韋卿 劉國滿 黃梓華 黃理政 浦澗

基金項目：廣西自然科學(xué)基金（2020GXNSFAA259019）

第一作者簡介：念家輝，男，醫(yī)學(xué)學(xué)士，在讀碩士研究生，研究方向：肝臟疾病基礎(chǔ)與臨床。E-mail：123554419@qq.com

▲通信作者：浦澗。E-mail：pujianym@163.com

［本文引用格式］念家輝，韋卿，劉國滿，等.microRNA-338-3p抑制HepG2肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲［J］.右江醫(yī)學(xué)，2024，52（3）：198-202.

【摘要】? 目的? 研究microRNA-338-3p對HepG2肝癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

方法? 取HepG2肝癌細(xì)胞，隨機(jī)分為三組：control組（未轉(zhuǎn)染）、vector組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒）、OE組（轉(zhuǎn)染microRNA-338-3p質(zhì)粒），分別取生理鹽水、空質(zhì)粒、microRNA-338-3p轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48小時。實時熒光定量PCR（qPCR）檢測microRNA-338-3p的轉(zhuǎn)染效率；劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移指數(shù)；Transwell法檢測細(xì)胞的侵襲能力；蛋白質(zhì)印跡法（Western blot實驗）檢測細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin的相對蛋白表達(dá)量。

結(jié)果? （1）microRNA-338-3p的轉(zhuǎn)染陽性率超過90%，符合實驗標(biāo)準(zhǔn)。（2）HepG2肝癌細(xì)胞的遷移指數(shù)，control組與vector組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；OE組與control組、vector組相比較，遷移指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（3）HepG2肝癌細(xì)胞的侵襲能力，control組與vector組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；OE組HepG2與control組、vector組相比較，侵襲能力顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。（4）E-cadherin相對蛋白表達(dá)量，control組與vector組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；OE組與control組、vector組相比較，E-cadherin相對蛋白表達(dá)量均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（5）N-cadherin的相對蛋白表達(dá)量，control組與vector組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；OE組與control組、vector組相比較，N-cadherin相對蛋白表達(dá)量減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

結(jié)論? （1）microRNA-338-3p可抑制HepG2肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力；（2）microRNA-338-3p通過促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)并抑制N-cadherin蛋白表達(dá)，從而抑制HepG2肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

【關(guān)鍵詞】? 微小RNA；肝細(xì)胞癌；遷移；侵襲

中圖分類號：R735.7??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.03.002

Inhibition of microRNA-338-3p on migration and invasion of HepG2 hepatoma cells

NIAN Jiahui1， WEI Qing2， LIU Guoman2， HUANG Zihua2， HUANG Lizheng2， PU Jian1▲

（1. Department of Hepatobiliary Surgery， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for

Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China; 2. Graduate School， Youjiang Medical

University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】? Objective? To investigate the effects of microRNA-338-3p on migration， invasion and epithelial mesenchymal transformation of HepG2 hepatoma cells.

Methods? HepG2 hepatoma cells were extracted. They were randomly divided into three groups： control group （non-transfected）， vector group （transfected with empty plasmid） and OE group （transfected with microRNA-338-3p plasmid）. Normal saline， empty plasmid and microRNA-338-3p were transfected， respectively， and cultured for 48 hours. Real-time fluorescence quantitative PCR （qPCR） was used to detect the transfection efficiency of microRNA-338-3p. The migration index of cells was detected by scratch test. The invasive ability of cells was detected by Transwell method. The relative protein expression levels of E-cadherin and N-cadherin were detected by Western blot assay.

Results? （1） The positive rate of microRNA-338-3p transfection in this study was over 90%， which met the experimental criteria. （2） The migration index of HepG2 liver cancer cells showed no statistically significant difference between the control group and the vector group （P>0.05）. The migration index of the OE group was significantly lower than that of the control group and the vector group， and difference was statistically significant （P<0.01）. （3） There was no statistically significant difference in the invasion ability of HepG2 hepatocellular carcinoma cells in the control group and the vector group （P>0.05）; compared with the control group and the vector group， the invasion ability of HepG2 in the OE group significantly decreased， and the difference was statistically significant （P<0.001）. （4） There was no statistically significant difference in the relative protein expression of E-cadherin between the control group and the vector group （P>0.05）; the relative protein expression of E-cadherin in the OE group was higher than that in the control group and the vector group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. （5） There was no statistically significant difference in the relative protein expression of N-cadherin between the control group and the vector group （P>0.05）; compared with the control group and the vector group， the relative protein expression of N-cadherin decreased in the OE group， and the difference was statistically significant （P<0.01）.

Conclusion? （1） microRNA-338-3p can inhibit the migration and invasion ability of HepG2 liver cancer cells; （2） microRNA-338-3p inhibits epithelial mesenchymal transition in HepG2 liver cancer cells by promoting E-cadherin protein expression and inhibiting N-cadherin protein expression.

【Keywords】? microRNA; hepatocellular carcinoma; migration; invasion

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作為最常見的原發(fā)性肝癌類型，目前已成為世界上第六大常見的癌癥種類和第三大癌癥死因［1］。盡管治療方案不斷取得進(jìn)步，但許多HCC患者的預(yù)后仍然無法令人滿意。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一種由上皮表型向間質(zhì)表型的形態(tài)轉(zhuǎn)化過程，與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，也是肝癌晚期轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。在發(fā)生EMT的癌細(xì)胞中，N-cadherin和Vimentin等間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)，E-cadherin和ZO-1等上皮標(biāo)志物的表達(dá)下調(diào)［2］。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一種長度為18～22個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，可以通過與靶mRNA的3'-UTR結(jié)合抑制基因表達(dá)，miRNAs異常表達(dá)對HCC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥的調(diào)控作用已經(jīng)廣泛受到關(guān)注，其中也包括EMT相關(guān)的癌癥轉(zhuǎn)移［3］。因此，本研究旨在通過體外干擾microRNA-338-3p表達(dá)，探究其對HepG2肝癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響。

1? 材料與方法

1.1? 材料和試劑

人肝癌細(xì)胞HepG2來自中科院干細(xì)胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司，貨號：C11995500BT）；青鏈霉素混合液（Solarbio公司，貨號：P1400-100）；結(jié)晶紫染色液（Solarbio公司，貨號：G1063-100 mL）、胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio公司，貨號：T1320-100）；胎牛血清（OriCell公司，貨號：FBSST-01033-500）；慢病毒合成（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，貨號：ZLDZ003）；miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號：B532451-0020］；實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Green Master （Roche公司，貨號：4913914001-5 mL）；TRIzol RNA提取試劑（賽默飛公司，貨號：15596026CN）；引物合成［生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號：H001］；E-cadherin抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號：20874-1-AP）；N-cadherin抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號：22018-1-AP）和內(nèi)參β-actin抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號：20536-1-AP）；Transwell小室8 μm PC膜（corning公司，貨號：3422）；RIPA裂解液（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號：PC102）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，貨號：P0010S）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，貨號：P0018S）。

1.2? 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

HepG2肝癌細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中。每天常規(guī)換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90％左右即可按1∶2或1∶3傳代處理，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行下一步實驗。

1.3? 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和驗證

取情況良好、對數(shù)生長期的HepG2肝癌細(xì)胞進(jìn)行實驗，將HepG2肝癌細(xì)胞以2×105個/well接種于六孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中過夜。次日按MOI=20稀釋病毒原液，將原細(xì)胞培養(yǎng)液移去，加入含有病毒稀釋液的DMEM完全培養(yǎng)基。24小時后移去六孔板中的舊病毒液，加入新鮮DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)72小時，使用嘌呤霉素連續(xù)篩選2周。根據(jù)轉(zhuǎn)染具體情況建立對照，分為control組（未轉(zhuǎn)染）、vector組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒）、OE組（轉(zhuǎn)染microRNA-338-3p質(zhì)粒）。使用熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光表達(dá)效率；使用TRIzol試劑從HepG2肝癌細(xì)胞中提取總RNA，通過miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR，反應(yīng)條件為95 ℃ 10分鐘，40個循環(huán)的95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s。以U6為內(nèi)參，結(jié)果用2-△△Ct測定相對表達(dá)量。microRNA-338-3p上游引物：5-AACAGTGTCCAGCATCAGTGA-3，U6上游引物及通用下游引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成。

1.4? 細(xì)胞劃痕實驗

預(yù)先對六孔板做好標(biāo)記，將各組細(xì)胞按照5×105個/well的濃度接種到六孔板上，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5％CO2恒溫箱過夜。等待細(xì)胞貼壁并均勻鋪滿單層進(jìn)行操作，使用無菌黃色槍頭垂直平滑地劃出劃痕，用PBS將飄起的細(xì)胞充分洗去，再加入含有1％血清的DMEM培養(yǎng)基2 mL繼續(xù)在37 ℃、5％CO2恒溫箱中培養(yǎng)48小時。分別記錄鏡下0小時和48小時同一劃痕區(qū)域的圖片，計算遷移指數(shù)，遷移指數(shù)=（0小時的面積-48小時后的面積）/0小時的面積×100％。

1.5? 細(xì)胞侵襲實驗

使用無血清DMEM培養(yǎng)基將各組細(xì)胞的濃度稀釋至2×105個/mL，充分重懸后每組分別取出100 μL的細(xì)胞懸液接種到預(yù)制好基質(zhì)膠的Transwell小室中，加入600 μL 10％血清DMEM完全培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5％CO2恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時。使用甲醇對培養(yǎng)結(jié)束后的細(xì)胞進(jìn)行10分鐘固定，PBS漂洗兩次后用0.1％結(jié)晶紫染色15分鐘，再用PBS漂洗去多余的染料，輕柔地擦去Transwell小室上表面的細(xì)胞，最后對穿過膜的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.6? 蛋白質(zhì)印跡法實驗

提取各組HepG2肝癌細(xì)胞的總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度。制作7.5％SDS-PAGE凝膠，在每個加樣孔中加入30 μg蛋白樣本，濃縮膠電泳80 V，分離膠電泳120 V。濕轉(zhuǎn)法設(shè)定恒流300 mA 1.5小時將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上，快速封閉液封閉15分鐘。加入一抗（E-cadherin、N-cadherin）后在4 ℃冰箱中孵育過夜，PBS漂洗三次后再加入二抗室溫孵育1小時，PBS漂洗三次，顯影后使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參計算蛋白相對表達(dá)量。

1.7? 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0版統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗；多個樣本間的比較采用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)設(shè)定為α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2? 結(jié)? 果

2.1? microRNA-338-3p mimics慢病毒過表達(dá)效率檢測

熒光倒置顯微鏡下觀察各組HepG2肝癌細(xì)胞，成功被感染的細(xì)胞能夠發(fā)出綠色熒光。vector組和OE組的熒光效率均超過90％。如圖1A所示。使用RT-qPCR檢測各組細(xì)胞的microRNA-338-3p表達(dá)量，control組與vector組相比microRNA-338-3p的表達(dá)量未見明顯差異（P＞0.05）；control組與OE組microRNA-338-3p的表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001），OE組microRNA-338-3p的表達(dá)量顯著上升；vector組與OE組microRNA-338-3p的表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001），OE組microRNA-338-3p的表達(dá)量顯著上升。如圖1B所示。

2.2? 劃痕實驗檢測microRNA-338-3p對HepG2肝癌細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，microRNA-338-3p可以抑制HepG2肝癌細(xì)胞的遷移能力，將control組細(xì)胞48小時的遷移指數(shù)與vector組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；將control組細(xì)胞48小時的遷移指數(shù)與OE組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），OE組的遷移能力顯著小于control組；將vector組細(xì)胞48小時的遷移指數(shù)與OE組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），OE組的遷移能力顯著小于vector組。如圖2A、2B所示。

2.3? Transwell侵襲實驗檢測microRNA-338-3p對HepG2肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，microRNA-338-3p可以抑制HepG2肝癌細(xì)胞的侵襲能力。將control組的穿膜細(xì)胞計數(shù)后與vector組對比，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而與OE組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），OE組的穿膜細(xì)胞計數(shù)顯著小于control組，可以認(rèn)為OE組的侵襲能力顯著小于control組；將vector組的穿膜細(xì)胞計數(shù)后與OE組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），OE組的穿膜細(xì)胞計數(shù)顯著小于vector組，可以認(rèn)為OE組的侵襲能力顯著小于vector組。如圖3A、3B所示。

2.4? 蛋白質(zhì)印跡法實驗檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)

Western bolt實驗結(jié)果顯示，microRNA-338-3p可以促進(jìn)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，抑制間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin的表達(dá)。control組和vector組的E-cadherin相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；control組和OE組的E-cadherin相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），OE組的E-cadherin表達(dá)量高于control組；而vector組和OE組的E-cadherin相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），OE組的E-cadherin表達(dá)量高于vector組。如圖4A、4C所示。control組和vector組的N-cadherin相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；control組和OE組的N-cadherin相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），OE組的N-cadherin表達(dá)量顯著低于control組；vector組和OE組的N-cadherin相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），OE組的N-cadherin表達(dá)量顯著低于vector組。如圖4B、4D所示。

3? 討? 論

肝細(xì)胞癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率都很高。近年有大量研究聚焦于肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，但是肝細(xì)胞癌進(jìn)展的分子機(jī)制尚不明確，目前仍缺乏治療晚期肝細(xì)胞癌的臨床有效途徑。目前一些研究表明microRNA-338-3p在抑制多種惡性腫瘤的特性中廣泛發(fā)揮作用［4］，然而其介導(dǎo)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未完全明確。miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用，不同miRNA的生物活性調(diào)控了HCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，有的充當(dāng)促癌基因發(fā)揮作用，有的充當(dāng)抑癌基因發(fā)揮作用，如過表達(dá)miRNA-96-5p可以促進(jìn)SMMC-7721和MHCC-97H肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［5］；過表達(dá)miRNA-299-3p可以抑制HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和抗凋亡，并限制EMT和細(xì)胞干性［6］。因此，明確特定miRNA的功能也許會為肝細(xì)胞癌的患者提供有效治療方案。E-cadherin常被認(rèn)為可以抑制肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，它不僅和基因突變、染色體不穩(wěn)定性、DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA有關(guān)［7］，還有研究發(fā)現(xiàn)在其他腫瘤中E-cadherin的表達(dá)量與淋巴結(jié)累積情況、腫瘤分化程度顯著相關(guān)［8］，E-cadherin的缺失往往被認(rèn)為是EMT的標(biāo)志之一。N-cadherin對大腦、心臟、骨骼肌、血管的發(fā)育和功能調(diào)節(jié)起著重要作用，同時N-cadherin的異常表達(dá)也與腫瘤細(xì)胞的凋亡、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9］。本研究中，實驗結(jié)果顯示在HepG2肝癌細(xì)胞中過表達(dá)microRNA-338-3p后，HepG2肝癌細(xì)胞的細(xì)胞劃痕愈合率降低，侵襲實驗中穿膜細(xì)胞數(shù)減少，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)量上升，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin蛋白表達(dá)量下降。

綜上所述，microRNA-338-3p可以抑制HepG2肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力；microRNA-338-3p通過促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)并抑制N-cadherin蛋白表達(dá)，從而抑制HepG2肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，有望為肝細(xì)胞癌的臨床治療提供新思路。

參? 考? 文? 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-03-11? 修回日期：2023-10-22）

（編輯：潘明志）