王文靜，吳 彪，劉志鴻，孫秀俊，周麗青，徐萬(wàn)棟

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；3.山東省東營(yíng)市墾利區(qū)行政審批服務(wù)局，山東墾利 257500)

水生動(dòng)物性腺發(fā)育受內(nèi)因和外因共同調(diào)控，其中內(nèi)因是相關(guān)的遺傳物質(zhì)，而外因則包括溫度、鹽度、pH、光照周期等環(huán)境因子[1]。近年來(lái)，對(duì)脊椎動(dòng)物體內(nèi)性類固醇激素合成相關(guān)基因的研究報(bào)道較多，而在貝類中研究較少[2]。性類固醇激素是性別決定、分化和性腺發(fā)育的關(guān)鍵物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)水生動(dòng)物性逆轉(zhuǎn)[3，4]，也可以影響性腺發(fā)育[5]。起初，許多學(xué)者認(rèn)為性類固醇激素只存在于脊椎動(dòng)物中，然而越來(lái)越多的證據(jù)表明性類固醇激素也存在于無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)[6，7]。性類固醇激素在蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)、海灣扇貝(Argopectenirradians)、長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)和近江牡蠣(C.ariakensis)性腺中的測(cè)定均已有報(bào)道，結(jié)果表明貝類性腺中性類固醇激素的含量隨生殖周期的變化產(chǎn)生季節(jié)性變化[8-12]。性類固醇激素的合成以膽固醇作為前體，由一系列類固醇合成酶催化調(diào)控，主要包括細(xì)胞色素P450基因家族(Cytochrome P450s，CYP)和羥類固醇脫氧酶家族(Hydroxysteroid dehydrogenases，HSD)的成員，以及其他類固醇氧化還原酶[13]。在脊椎動(dòng)物中，類固醇合成酶及其通路都已經(jīng)有較為深入的研究，膽固醇在類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白StAR(steroidogenic acute regulatory protein)的作用下從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜上，然后由細(xì)胞色素側(cè)鏈裂解酶CYP11催化產(chǎn)生孕烯醇酮，孕烯醇酮回到細(xì)胞質(zhì)后，再由CYP17、CYP19、3β-HSD和17β-HSD等基因編碼的類固醇合成酶催化形成相應(yīng)的性類固醇激素[14]。已有研究表明，軟體動(dòng)物的主要種類，如頭足類、腹足類和雙殼類等，能夠利用膽固醇或孕烯醇酮等前體物質(zhì)合成性類固醇激素[15]。但在貝類中性類固醇激素合成機(jī)制的研究相對(duì)較為匱乏，其中性類固醇激素合成通路中的關(guān)鍵基因也有待進(jìn)一步研究。

17β-羥類固醇脫氫酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase，17β-HSD)是一類以NAD(P)(H)作為輔酶的氧化還原酶，是性類固醇激素合成過(guò)程中的催化酶，因其作用于類固醇的第17位碳而得名[16]。目前在哺乳動(dòng)物中，已發(fā)現(xiàn)該家族的15種亞型，并根據(jù)發(fā)現(xiàn)順序依次命名[17]。17β-HSD能夠氧化17β-羥基類固醇，或還原17-酮類固醇，從而實(shí)現(xiàn)性類固醇激素活性的調(diào)節(jié)，如催化雄烯二醇和睪酮、雌二醇和雌酮、雙氫睪酮和3α-雄烷二醇等之間的相互轉(zhuǎn)化，對(duì)于維持生物體內(nèi)性類固醇激素的合成與代謝發(fā)揮重要作用[18]。在水產(chǎn)動(dòng)物中，許多17β-HSD基因已被發(fā)現(xiàn)，在牙鲆(Paralichthysolivaceus)中篩選克隆了10個(gè)17β-HSD基因，其中3個(gè)基因(17β-HSD10、17β-HSD12a和17β-HSD12b)在卵巢中表達(dá)量較高，1個(gè)基因(17β-HSD9)在精巢中表達(dá)量較高，說(shuō)明牙鲆17β-HSD基因家族可能與性腺發(fā)育過(guò)程中雌雄激素的合成有關(guān)[19]。櫛孔扇貝中已發(fā)現(xiàn)了17β-HSD4、17β-HSD8和17β-HSD14，這3個(gè)17β-HSD基因在性腺中的表達(dá)量都具有性別二態(tài)性，可能參與了性腺的發(fā)育與成熟、雌二醇的含量調(diào)節(jié)等過(guò)程[20]。三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)中17β-HSD11基因在性腺中的表達(dá)量具有性別二態(tài)性，注射雌二醇干擾后，17β-HSD11基因在精卵巢中的表達(dá)量降低[21]。17β-HSD14基因作為17β-HSD基因家族成員，可能參與性腺發(fā)育和雌二醇含量調(diào)節(jié)，是性類固醇激素合成通路中的基因之一。

魁蚶(Scapharcabroughtonii)是我國(guó)黃渤海區(qū)重要的大型底棲貝類，也是我國(guó)北方重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖物種[22]。魁蚶性腺被斧足覆蓋，不解剖情況下肉眼不可見(jiàn)，給準(zhǔn)確判斷性腺發(fā)育狀態(tài)帶來(lái)困難，這是人工育苗工作中的一個(gè)難題。掌握魁蚶性腺發(fā)育與性類固醇激素相關(guān)基因的相關(guān)性，能夠?yàn)轫樌_(kāi)展人工親貝選擇和苗種繁育提供支撐。本研究篩選并驗(yàn)證了魁蚶17β-HSD14基因序列，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并利用原位雜交、熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了該基因在魁蚶性腺中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，為了解17β-HSD14在魁蚶性腺發(fā)育中的作用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魁蚶采自山東省青島海域野生群體，選取殼長(zhǎng)為70 mm左右的健康個(gè)體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室置于過(guò)濾海水中暫養(yǎng)1周，每天投喂小球藻2次、換水1次，每次換水量50%，水溫18 ℃左右，鹽度30，海水pH 8.0。魁蚶性腺組織取樣后，通過(guò)組織學(xué)方法將魁蚶性腺發(fā)育階段劃分為5個(gè)時(shí)期，即形成期(Ⅰ期)、增殖期(Ⅱ期)、成熟期(Ⅲ期)、排放期(Ⅳ期)和耗盡期(Ⅴ期)。同時(shí)取成熟期精巢、卵巢、鰓、斧足、外套膜、閉殼肌和肝胰腺7種組織，置于原位雜交固定液(Servicebio，中國(guó))中固定24 h，用于原位雜交實(shí)驗(yàn)。

1.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

在魁蚶性腺發(fā)育的5個(gè)時(shí)期中，各選3個(gè)精巢和卵巢樣品進(jìn)行RNA提取，RNA的提取采用Trizol法，提取的RNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性和Nanodrop 2000(Thermo Scientific，美國(guó))檢測(cè)純度和濃度，并且OD260 nm/ OD280 nm的比值范圍應(yīng)在1.8～2.2，將鑒定合格的樣品稀釋到1 000 ng/μL。使用Evo M-MLV Plus cDNA合成試劑盒(Accurate，中國(guó))將魁蚶RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 核心片段驗(yàn)證

從實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中獲得魁蚶轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中17β-HSD14基因cDNA片段，使用Primer 3.0(http：//www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行片段驗(yàn)證，引物見(jiàn)表1。采用2×Tap Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)(Vazyme，中國(guó))擴(kuò)增目的基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后，使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction(TaKaRa，中國(guó))試劑盒進(jìn)行切膠回收。使用5 min TA/Blunt-Zero Cloning試劑盒(Vazyme，中國(guó))將純化后的目的片段連接到載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(Vazyme，中國(guó))中，在含Amp的LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)后挑選陽(yáng)性菌落送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.4 基因序列及進(jìn)化分析

對(duì)測(cè)序得到的17β-HSD14基因序列進(jìn)行分析，使用ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/orffinder/)進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)區(qū)預(yù)測(cè)，SignaIP-5.0 Server(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0)預(yù)測(cè)信號(hào)肽，TMHMM 2.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域，SMART(http：//smart.emblhe idelberg.de/ smart/set_mode.cgi？NORMAL=1)預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)和功能域。利用ExPASY(https：//web.expasy.org/protparam/)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)，Swiss-model(https：//www.swissmodel.expasy.org/)網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，Cell-PLoc 2.0(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)網(wǎng)站預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位，使用BLAST進(jìn)行堿基序列同源性比對(duì)分析和相似蛋白質(zhì)序列搜索，使用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，用MEGA 11.0軟件以鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 原位雜交

利用原位雜交分析17β-HSD14基因在魁蚶精巢(Ⅲ期)、卵巢(Ⅲ期)、鰓、斧足、外套膜、閉殼肌和肝胰腺中的定位。原位雜交探針由賽維爾公司設(shè)計(jì)，探針序列見(jiàn)表1。主要步驟如下：固定的組織經(jīng)梯度酒精脫水、浸蠟、包埋、切片、撈片和烤片，依次將切片放入二甲苯15 min、二甲苯15 min、無(wú)水乙醇5 min、無(wú)水乙醇5 min，之后風(fēng)干，DEPC水浸泡。組織切片于修復(fù)液中煮沸5 min，自然冷卻。根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K于37 ℃消化15 min。先用純水沖洗，后用PBS洗3次。滴加預(yù)雜交液，37 ℃孵育1 h。倒出預(yù)雜交液，滴加含探針雜交液，濃度500 nmol/L，恒溫箱42 ℃雜交過(guò)夜。洗去雜交液后，滴加含二標(biāo)探針雜交液，稀釋比1∶400于42 ℃孵育3 h。滴加封閉血清正常兔血清，置于室溫30 min。倒去封閉液，滴加鼠抗地高辛標(biāo)記堿性磷酸酶anti-DIG-AP，37 ℃孵育50 min，后PBS洗4次。滴加NBT顯色液，用顯微鏡觀察陽(yáng)性顯色情況。后用純水沖洗，自然風(fēng)干后，中性樹(shù)膠封片，得到的原位雜交的切片置于CIC顯微鏡(XSP-C204)下，進(jìn)行圖像的采集與分析。

1.6 魁蚶性腺不同時(shí)期的表達(dá)分析

根據(jù)測(cè)序得到的編碼序列(Coding sequence，CDS)區(qū)序列設(shè)計(jì)17β-HSD14定量引物，qRT-PCR使用的引物見(jiàn)表1，以RL15基因[23]作為內(nèi)參基因。使用HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR試劑盒(Vazyme，中國(guó))將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix試劑盒(Vazyme，中國(guó))在CFX 96(Bio-rad，美國(guó))上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，RNase Free H2O 8.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算17β-HSD14基因的相對(duì)表達(dá)量，所有數(shù)據(jù)均在SPSS 22.0中采用單因素方差分析，定量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，并將其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 17β-HSD14基因序列及生物信息學(xué)分析

克隆獲得的17β-HSD14基因CDS序列長(zhǎng)度為822 bp,編碼273個(gè)氨基酸。17β-HSD14蛋白無(wú)信號(hào)肽,不存在跨膜區(qū)域,推測(cè)其為一個(gè)胞內(nèi)蛋白。17β-HSD14基因蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為29.66 kDa,理論等電點(diǎn)為6.89,分子式為C1 306H2 065N361O403S12,脂溶系數(shù)為79.30,平均親水系數(shù)(GRAVY)為-0.331,不穩(wěn)定系數(shù)為30.07<40.00,說(shuō)明17β-HSD14基因編碼產(chǎn)物為親水性穩(wěn)定蛋白。17β-HSD14在第2～262氨基酸序列中存在NADB結(jié)構(gòu)域,且存在NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)(TGXXXGXG)和催化活性位點(diǎn)(YXXXK)(圖1)。亞細(xì)胞定位顯示,17β-HSD14蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)和過(guò)氧化物酶體中。利用Swiss-model在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)了三維結(jié)構(gòu),17β-HSD14蛋白序列與同源模板的相似性為51.54%,QMEAN為0.81,GMQE為0.82,結(jié)果說(shuō)明該蛋白與模板蛋白的匹配度較高,該蛋白含有46.86% α-螺旋,14.65% β-折疊和38.45%無(wú)規(guī)則卷曲(圖2)。

圖1 17β-HSD14氨基酸的多序列比對(duì)Fig.1 Multiple comparisons of 17β-HSD14 amino acid紅色方框內(nèi)為NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)，藍(lán)色方框內(nèi)為催化活性位點(diǎn)。

圖2 17β-HSD14蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of tertiary structure of 17β-HSD14 protein

氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，魁蚶的17β-HSD14與歐洲牡蠣(Ostreaedulis)的同源性最高，為77.82%；與長(zhǎng)牡蠣、美洲牡蠣(C.virginica)、福建牡蠣(C.angulata)、加州貽貝(Mytiluscalifornianus)、厚殼貽貝(M.coruscus)、藍(lán)貽貝(M.edulis)、櫛孔扇貝、蝦夷扇貝和歐洲扇貝(Pectenmaximus)的同源性相近，都在75.85%～77.44%的范圍內(nèi)；與硬殼蛤(Mercenariamercenaria)的同源性比較低，為69.49%(表2)(圖1)。與斑馬魚(yú)(Daniorerio)等魚(yú)類和非洲爪蟾(Xenopustropicalis)等兩棲動(dòng)物的同源性較低，為57.93%～66.02%；與智人(Homosapiens)等哺乳動(dòng)物的同源性最低，為50.78%～51.94%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖3所示，魁蚶17β-HSD14先與貽貝、牡蠣、扇貝和蛤等雙殼貝類聚為一支，然后再與魚(yú)類和兩棲動(dòng)物聚在一起，進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)的是智人等哺乳動(dòng)物。

圖3 不同物種17β-HSD14氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 17β-HSD14 amino acid sequence in different species

表2 不同物種17β-HSD14氨基酸序列號(hào)與同源性Tab.2 17β-HSD14 amino acids sequences numbers and identity of different species

2.2 17β-HSD14基因mRNA在魁蚶7種組織中的細(xì)胞學(xué)定位

性腺原位雜交結(jié)果如圖4所示，在卵巢組織中，17β-HSD14基因陽(yáng)性雜交信號(hào)主要位于卵細(xì)胞和濾泡細(xì)胞壁上；在卵細(xì)胞中，陽(yáng)性雜交信號(hào)主要出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果質(zhì)一致。精巢組織中的精原細(xì)胞和精子中也都檢測(cè)到了17β-HSD14基因的陽(yáng)性雜交信號(hào)。17β-HSD14基因在其他組織的定位結(jié)果如圖5所示，魁蚶斧足、外套膜、肝胰腺、閉殼肌和鰓的細(xì)胞質(zhì)中均檢測(cè)到了該基因的陽(yáng)性雜交信號(hào)。與陰性對(duì)照組相比，斧足組織中的陽(yáng)性雜交信號(hào)主要位于外表皮、肌纖維和結(jié)締組織中(圖5 A1、A2)；外套膜上肌纖維中的陽(yáng)性雜交信號(hào)較為明顯，而上皮層和結(jié)締組織中的陽(yáng)性雜交信號(hào)則較弱(圖5 B1、B2)；在肝胰腺組織中，肝小管上的陽(yáng)性雜交信號(hào)較為強(qiáng)烈(圖5 C1、C2)；閉殼肌中的陽(yáng)性雜交信號(hào)主要位于其肌纖維中(圖5 D1、D2)；鰓組織中，在鰓絲表面上檢測(cè)到了17β-HSD14的陽(yáng)性雜交信號(hào)(圖5 E1、E2)。

圖4 17β-HSD14在魁蚶性腺中的細(xì)胞學(xué)定位Fig.4 Cytological localization of 17β-HSD14 in gonad of S.broughtoniiA：卵巢；B：精巢；1：原位雜交結(jié)果圖；2：陰性對(duì)照?qǐng)D；3：HE染色圖；MO：成熟卵子；FW：濾泡壁；SN：精原細(xì)胞；SP：精子；比例尺：100 μm。

圖5 17β-HSD14在魁蚶斧足、外套膜、肝胰腺、閉殼肌和鰓中的細(xì)胞學(xué)定位Fig.5 Cytological localization of17β-HSD14 in foot，mantle，hepatopancreas，muscle and gill of S.broughtoniiA：斧足；B：外套膜；C：肝胰腺；D：閉殼肌 E：鰓；1：原位雜交結(jié)果圖；2：陰性對(duì)照?qǐng)D；3：HE染色圖；OE：外表皮；Mf：肌纖維；Ct：結(jié)締組織；Ep：上皮層；Ht：肝小管；Gf：鰓絲；比例尺：100 μm。

2.3 17β-HSD14基因在不同發(fā)育時(shí)期的性腺中的表達(dá)分析

熒光定量檢測(cè)結(jié)果表明，17β-HSD14基因在5個(gè)發(fā)育時(shí)期的精卵巢組織中均有表達(dá)(圖6)。其中，Ⅱ期卵巢中17β-HSD14的表達(dá)量最高，顯著高于Ⅰ期，且極顯著高于其他3個(gè)時(shí)期，Ⅰ期和Ⅲ期的17β-HSD14表達(dá)量顯著高于Ⅳ期，極顯著高于Ⅴ期；Ⅱ期精巢中17β-HSD14的表達(dá)量也最高，顯著高于Ⅰ期和Ⅴ期。17β-HSD14的表達(dá)量從Ⅰ期到Ⅱ期的精卵巢發(fā)育過(guò)程中均呈上升趨勢(shì)，在Ⅱ期達(dá)到最高值，然后從Ⅱ期到Ⅴ期的發(fā)育過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，并在Ⅴ期達(dá)到最低值。比較17β-HSD14在同一發(fā)育時(shí)期精巢和卵巢的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，5個(gè)時(shí)期卵巢中17β-HSD14的表達(dá)量均高于精巢，且Ⅰ期和Ⅱ期差異達(dá)到極顯著水平，Ⅲ期顯著差異，而Ⅳ期和Ⅴ期無(wú)顯著差異。

圖6 17β-HSD14在魁蚶不同發(fā)育時(shí)期性腺中的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of 17β-HSD14 in gonad during different developmental periods of S.broughtonii*表示同一時(shí)期精巢和卵巢間表達(dá)量存在顯著差異(P< 0.05)，**表示同一時(shí)期精巢和卵巢間表達(dá)量存在極顯著差異(P< 0.01)。圖中不同的小寫(xiě)字母代表不同時(shí)期卵巢的表達(dá)量的差異，不同大寫(xiě)字母代表不同時(shí)期精巢的表達(dá)量的差異。

3 討論

17β-HSD是性類固醇激素合成過(guò)程中的關(guān)鍵催化酶，17β-HSD14是17β-HSDs中一個(gè)新成員，最早從人視網(wǎng)膜cDNA文庫(kù)中分離得到[24]，它能催化雌二醇轉(zhuǎn)化為雌酮、5α-雄烷-3α，17β-二醇轉(zhuǎn)化為雄酮[25]。本實(shí)驗(yàn)在魁蚶中克隆獲得的17β-HSD14基因CDS序列長(zhǎng)度為822 bp，編碼273個(gè)氨基酸。17β-HSD14基因所編碼的氨基酸中存在17β-HSD的SDR家族典型結(jié)構(gòu)特征NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)(TGXXXGXG)和催化活性位點(diǎn)(YXXXK)[26]?？赖?7β-HSD14基因與歐洲牡蠣的同源性最高，與貽貝、牡蠣和扇貝較近，且與魚(yú)類、兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物的同源性也較高，說(shuō)明17β-HSD14在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。

17β-HSD14基因的原位雜交發(fā)現(xiàn)在魁蚶卵巢、精巢、斧足、外套膜、肝胰腺、閉殼肌和鰓中均檢測(cè)到了17β-HSD14基因的陽(yáng)性雜交信號(hào)，表明17β-HSD14在魁蚶各個(gè)組織中均有表達(dá)，表明除參與性類固醇激素合成外17β-HSD14可能還參與機(jī)體的其他生理活動(dòng)。17β-HSDs在其他物種中也存在無(wú)組織特異性的現(xiàn)象，如17β-HSD11在三角帆蚌各組織中均有表達(dá)[21]；17β-HSD基因在福建牡蠣所有組織中表達(dá)，且在內(nèi)臟團(tuán)中表達(dá)量較高，說(shuō)明其可能參與了牡蠣的脂肪代謝過(guò)程[16]；牙鲆17β-HSD1在雌性個(gè)體的卵巢、鰓、腎、頭腎、脾、胃、腸組織和雄性個(gè)體的精巢中表達(dá)[27]；17β-HSD12在人體的肝臟和腎臟等脂質(zhì)代謝相關(guān)器官中高度表達(dá)，在腦垂體、腎上腺和睪丸等內(nèi)分泌相關(guān)器官中被檢測(cè)到，表明17β-HSD12可能參與脂質(zhì)生物合成和類固醇代謝的調(diào)節(jié)[28]；以上結(jié)果表明17β-HSDs在貝類和脊椎動(dòng)物中都具有廣泛的生物學(xué)功能。在魁蚶所有組織中，肝胰腺的肝小管上17β-HSD14的陽(yáng)性雜交信號(hào)最強(qiáng)烈，表明17β-HSD14基因除參與性類固醇激素的合成外可能也參與魁蚶的脂肪酸代謝過(guò)程。

性類固醇激素廣泛存在于貝類中，其含量隨不同的生殖階段而變化，且存在性別二態(tài)性，在性別決定和性腺發(fā)育中起著重要作用。有研究表明，性類固醇激素可以加快性腺的發(fā)育并影響貝類的性別[29]。性類固醇激素在脊椎動(dòng)物的性別分化、生長(zhǎng)發(fā)育、生殖代謝等過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理作用，類固醇合成酶及其通路都已經(jīng)有較為深入的研究，但性類固醇激素參與貝類繁殖過(guò)程的分子機(jī)制仍不清晰。本研究中，精卵巢中17β-HSD14在Ⅱ期的相對(duì)表達(dá)量均為最高，在精卵巢發(fā)育過(guò)程中均呈先上升后下降趨勢(shì)。17β-HSD14的表達(dá)量在魁蚶精卵巢由增殖期到成熟期的過(guò)程中迅速降低，說(shuō)明17β-HSD14基因可能在生殖細(xì)胞成熟和排放過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。近江牡蠣性腺中睪酮和雌二醇的含量均在增殖期最高，且性類固醇激素的變化與生殖周期相關(guān)，提示睪酮和雌二醇可能參與了性腺發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)[12]。櫛孔扇貝精卵巢中的雌二醇和睪酮含量均隨生殖過(guò)程周期性地變化，表明性類固醇激素在櫛孔扇貝性別維持、性腺分化、配子發(fā)生和排放等過(guò)程中具有潛在的重要作用[20]。以上結(jié)果表明17β-HSD14作為性類固醇激素合成酶，可能通過(guò)影響性類固醇激素的合成而影響性腺發(fā)育?？?個(gè)時(shí)期卵巢中17β-HSD14的表達(dá)量均高于精巢，且卵巢中Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期表達(dá)量顯著高于精巢，具有性別二態(tài)性。已有研究發(fā)現(xiàn)三角帆蚌中17β-HSD11基因在卵巢中的表達(dá)量極顯著高于精巢[21]，與本研究結(jié)果相似；海灣扇貝性腺發(fā)育過(guò)程中，雌二醇和孕酮的表達(dá)量在卵巢中均高于精巢，而睪酮在精巢中的表達(dá)量均高于卵巢，表現(xiàn)出性別二態(tài)性[10]。這提示17β-HSD14可能與雌二醇、孕酮的合成呈正相關(guān)關(guān)系。在近江牡蠣性腺中，雌二醇、孕酮在卵巢中含量較高，睪酮在精巢中含量較高，且17β-HSD14基因在卵巢中的表達(dá)量較高，與雌二醇、孕酮的含量正相關(guān)，可能是由于其對(duì)雌二醇轉(zhuǎn)化為雌酮的作用比睪酮到雄烯二酮的作用更為有效[12]。魁蚶5個(gè)時(shí)期卵巢中17β-HSD14的表達(dá)量均高于精巢，可能也是由于在卵巢中對(duì)雌二醇的調(diào)控比在精巢中對(duì)睪酮的調(diào)控作用更重要。

本研究鑒定了性類固醇合成相關(guān)基因17β-HSD14在魁蚶中的組織分布和性腺發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特征，表明17β-HSD14基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)性類固醇激素的合成影響性腺發(fā)育。研究結(jié)果為魁蚶性腺發(fā)育相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)資料，為科學(xué)管控魁蚶親貝育肥提供了支撐。