董淑慧,徐 瑾

(天津市天津醫(yī)院病理科,天津 300211)

痛風(fēng)是一組由于長期嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致的以單鈉尿酸鹽晶體沉積為特征的疾病,以痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎最為常見,其特征是血尿酸升高導(dǎo)致尿酸鹽晶體沉積在關(guān)節(jié)腔、軟骨、滑膜及周圍組織,引起局部關(guān)節(jié)突發(fā)疼痛、紅腫,反復(fù)發(fā)作可引起關(guān)節(jié)僵硬、變形,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。痛風(fēng)還可誘發(fā)痛風(fēng)石、痛風(fēng)性眼病、痛風(fēng)性心臟病。臨床資料顯示,痛風(fēng)還與腦血管疾病、代謝綜合征、糖尿病、腎臟疾病等有著密不可分的聯(lián)系,與其他合并癥一起,可以使患者的預(yù)期壽命總體下降[1-3]。近年來,由于我國經(jīng)濟(jì)水平的提高和人們飲食結(jié)構(gòu)的改變,痛風(fēng)的發(fā)病率明顯升高,患病率為0.03%～10.47%[4];高尿酸血癥的發(fā)病還有明顯年輕化的趨勢[5]。目前高尿酸血癥和痛風(fēng)在我國已成為一種常見的代謝性疾病。

目前認(rèn)為遺傳、炎癥及免疫因素參與了痛風(fēng)的發(fā)病[6],遺傳因素是主要因素。我國漢族人群的首個(gè)大樣本量全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)顯示,人類乳腺癌擴(kuò)增序列3(BCAS3)和調(diào)節(jié)因子X3(RFX3)是我國人群特有的痛風(fēng)易感基因[7]。單核巨噬細(xì)胞是參與痛風(fēng)發(fā)病的主要炎癥細(xì)胞[8],是痛風(fēng)石中數(shù)量最多的細(xì)胞。因此,本研究選擇手術(shù)切除的痛風(fēng)石標(biāo)本,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測痛風(fēng)石中巨噬細(xì)胞的BCAS3和RFX3蛋白表達(dá)情況,分析兩種蛋白參與痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制和對于痛風(fēng)的診斷價(jià)值,以期為臨床預(yù)防、診斷和治療痛風(fēng)篩選靶向藥物提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年4月至2022年12月本院痛風(fēng)石切除標(biāo)本30例為試驗(yàn)組,均為男性,年齡(45.73±17.63)歲,血尿酸(577.04±145.89)μmol/L。同期切除的關(guān)節(jié)置換術(shù)后滑膜增生伴有異物巨細(xì)胞反應(yīng)的標(biāo)本25例、脂肪壞死伴有巨噬細(xì)胞增生的標(biāo)本5例作為對照組,其中男16例,年齡(57.44±17.60)歲,血尿酸(343.92±104.93)μmol/L,女14例,年齡(60.86±15.41)歲,血尿酸(273.15±75.68)μmol/L。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)依據(jù)2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì)《高尿酸血癥和痛風(fēng)治療的專家共識》標(biāo)準(zhǔn)[9],試驗(yàn)組患者空腹血尿酸均>420 μmol/L;(2)痛風(fēng)石標(biāo)本均經(jīng)組織印片偏光顯微鏡檢確認(rèn)尿酸鹽晶體的存在,見圖1。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)具有類似表現(xiàn)的假痛風(fēng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等;(2)對照組患高尿酸血癥(男性空腹血尿酸>420 μmol/L,女性>360 μmol/L)、高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤等。

圖1 偏光顯微鏡下尿酸鹽晶體(100×)

1.2 方法

1.2.1儀器與試劑

LEICA全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī),BCAS3單克隆抗體(克隆號DF9291)、RFX3多克隆抗體(克隆號ZC-4066)濃縮液購自上海茁葉生物科技有限公司;CD68、CD163抗體工作液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色

將標(biāo)本行3 μm掛膠切片,60 ℃烤箱烘烤2 h,在LEICA全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)上進(jìn)行染色,常規(guī)脫水、透明、封片后鏡檢。CD68、CD163抗體為工作液;濃縮液按照使用說明書適度稀釋,BCAS3抗體稀釋濃度為1∶100,RFX3抗體稀釋濃度為1∶150。人腎臟組織和腦組織作為陽性對照,同時(shí)采用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3評分判斷標(biāo)準(zhǔn)

CD68、CD163定位于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),對二者定位的細(xì)胞進(jìn)行BCAS3和RFX3的染色結(jié)果判讀,陽性的標(biāo)準(zhǔn)定為棕褐色、棕黃色與黃色顆粒狀著色。根據(jù)巨噬細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分。顏色越深則分?jǐn)?shù)越高,棕褐色、棕黃色、黃色分別記為3、2、1分,沒有著色記0分;在巨噬細(xì)胞密集區(qū)隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(400×),在每個(gè)視野中計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞,一共計(jì)數(shù)500個(gè)巨噬細(xì)胞,陽性細(xì)胞所占比例≤5%、>5%～25%、>25%～50%、>50%～75%和>75%分別記為0、1、2、3和4分。兩種評分結(jié)果相加為最終得分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各個(gè)抗體的細(xì)胞定位情況

CD68、CD163均定位于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),多核巨噬細(xì)胞多表達(dá)CD68(圖2),單核巨噬細(xì)胞多表達(dá)CD163(圖3),二者相互補(bǔ)充標(biāo)示出組織中的巨噬細(xì)胞。BCAS3定位于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)(圖4),而RFX3主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖5)。

圖3 痛風(fēng)石中巨噬細(xì)胞表達(dá)CD163(200×)

圖4 痛風(fēng)石中巨噬細(xì)胞表達(dá)BCAS3(200×)

圖5 痛風(fēng)石中巨噬細(xì)胞表達(dá)RFX3(200×)

2.2 BCAS3、RFX3蛋白表達(dá)情況及相關(guān)性分析

試驗(yàn)組BCAS3、RFX3蛋白表達(dá)明顯高于對照組(t=3.036、8.617,P=0.004、0.001),對照組不同性別BCAS3、RFX3蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.158、0.882,P=0.876、0.386),見表1。

表1 兩組BCAS3、RFX3蛋白表達(dá)比較

試驗(yàn)組BCAS3蛋白表達(dá)與RFX3蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.539,P=0.002)。試驗(yàn)組血尿酸與BCAS3、RFX3蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.05),對照組血尿酸與BCAS3、RFX3蛋白表達(dá)不相關(guān)(P>0.05)。兩組年齡與BCAS3、RFX3蛋白表達(dá)不相關(guān)(P>0.05),見表2。

表2 血尿酸、年齡與BCAS3和RFX3的相關(guān)性分析

2.3 BCAS3、RFX3對痛風(fēng)的診斷效能

RFX3的曲線下面積(AUC)、靈敏度、特異度分別為0.935、96.55%、86.67%,均高于BCAS3的0.742、70.00%和80.00%,說明RFX3對于痛風(fēng)有更高的診斷價(jià)值,見表3、圖6。

表3 BCAS3和RFX3對痛風(fēng)的診斷效能

圖6 ROC曲線分析

3 討 論

BCAS3位于染色體17q23,全長600 kb,含有24個(gè)外顯子,能夠編碼913個(gè)氨基酸,是一種細(xì)胞骨架蛋白,最早在乳腺癌組織中被發(fā)現(xiàn)過表達(dá)[10]。隨著研究的深入,BCAS3被認(rèn)為和多種疾病相關(guān),如腦腫瘤、腎臟疾病和原發(fā)性開角型青光眼等。LI等[11]發(fā)現(xiàn),BCAS3的3個(gè)單核苷酸基因位點(diǎn)(rs9895661、rs9905274和rs11653176)的多態(tài)性與我國漢族男性人群的痛風(fēng)相關(guān)聯(lián)。趙會(huì)文[12]研究發(fā)現(xiàn),BCAS3單核苷酸基因多態(tài)性可能與我國沿海地區(qū)漢族男性人群的痛風(fēng)易感性相關(guān)。痛風(fēng)急性期和緩解期患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中BCAS3 mRNA表達(dá)均較健康人群明顯升高(P<0.05),推測rs9905274和rs11653176兩個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性可能會(huì)影響B(tài)CAS3的表達(dá)從而調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的功能,進(jìn)而促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-1β等炎性因子的釋放,導(dǎo)致痛風(fēng)的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組BCAS3蛋白表達(dá)明顯高于對照組,說明BCAS3蛋白表達(dá)上調(diào)能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能來參與痛風(fēng)的發(fā)病。JOSHI等[13]研究發(fā)現(xiàn),BCAS3 作為一種細(xì)胞骨架蛋白,通過偶聯(lián)微管、中間絲,能夠促進(jìn)血管發(fā)育過程中內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。據(jù)此,推測BCAS3也可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的遷移能力來參與痛風(fēng)的發(fā)病。作為一種炎癥性疾病,痛風(fēng)的發(fā)病過程涉及巨噬細(xì)胞的極化和焦亡現(xiàn)象。在痛風(fēng)的急性期巨噬細(xì)胞傾向于向M1型極化,釋放促炎因子,導(dǎo)致劇烈的炎癥反應(yīng);而在痛風(fēng)的緩解期,巨噬細(xì)胞傾向于向M2型極化,抑制炎癥的發(fā)展和促進(jìn)炎癥的消退,這可部分解釋痛風(fēng)發(fā)作的“自限性”[14]。細(xì)胞焦亡是一種細(xì)胞程序性死亡方式,通過細(xì)胞腫脹并破壞細(xì)胞膜的完整性,造成細(xì)胞穿孔,細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物和炎性因子釋放,產(chǎn)生并擴(kuò)大炎癥反應(yīng),是一種促炎程序性死亡。研究表明,抑制巨噬細(xì)胞焦亡可以減少活化的IL-1β釋放,從而緩解痛風(fēng)的炎性反應(yīng)[15]。巨噬細(xì)胞的極化和焦亡過程均涉及很多細(xì)胞因子和傳導(dǎo)通路,細(xì)胞骨架蛋白也必不可少地參與其中。作為一種細(xì)胞骨架蛋白的BCAS3是否在痛風(fēng)發(fā)生的不同階段通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化和焦亡來參與痛風(fēng)的發(fā)病還有待進(jìn)一步的研究。

RFX3是纖毛形成和功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子之一。纖毛是存在于大多數(shù)脊椎動(dòng)物細(xì)胞表面的保守細(xì)胞器,能夠感知對于細(xì)胞增殖、分化、極性調(diào)節(jié)和組織動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要的各種細(xì)胞外信號[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組RFX3蛋白表達(dá)高于對照組(P<0.05),說明巨噬細(xì)胞通過高表達(dá)RFX3參與痛風(fēng)的發(fā)病。巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用,包括感知和吞噬異物、提呈抗原、釋放促炎因子、招募炎癥細(xì)胞等[18]。這些功能的實(shí)現(xiàn)很大程度上依賴于對肌動(dòng)蛋白的調(diào)控[19]。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架是一個(gè)高度平衡的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),參與如細(xì)胞遷移和膜運(yùn)輸?shù)戎匾纳飳W(xué)過程,其基本功能是通過聚合作用來改變脂膜的結(jié)構(gòu)[20]。其中重要的一員是生長的肌動(dòng)蛋白細(xì)絲(F-actin),其有助于維持細(xì)胞形狀,建立和維持與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的膜突起,促進(jìn)囊泡的運(yùn)輸[21]。這些復(fù)雜的細(xì)胞功能的實(shí)現(xiàn)需要對F-actin的產(chǎn)生、穩(wěn)定和周轉(zhuǎn)進(jìn)行精密的時(shí)間和空間調(diào)節(jié)。有研究表明,分枝的F-actin對纖毛的形成有抑制作用[22]。

李脈超[23]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞特異性RFX3基因敲除小鼠的巨噬細(xì)胞黏著斑增大,足小體增多,F-actin熒光強(qiáng)度增加,遷移能力增強(qiáng),提示RFX3基因可能是通過促進(jìn)F-actin 的產(chǎn)生從而抑制纖毛形成,改變巨噬細(xì)胞的遷移能力。同時(shí),尿酸鹽介導(dǎo)的腹膜炎模型中條件性敲除RFX3小鼠腹腔灌洗液中IL-1β水平較對照組有明顯下降,表明敲除RFX3基因后,炎癥情況有所改善,RFX3在痛風(fēng)的發(fā)病過程中具有促炎的作用[23]。這一研究部分解釋了RFX3參與痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組BCAS3蛋白表達(dá)與RFX3蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.539,P=0.002),說明二者在痛風(fēng)的發(fā)病過程中可能具有一定的協(xié)同作用。雖然是比較弱的正相關(guān),但二者都具有明確的促炎作用,均促進(jìn)了痛風(fēng)的發(fā)病。二者具體的相互關(guān)系和作用機(jī)制,需待相關(guān)通路研究清晰后確定。同時(shí),試驗(yàn)組血尿酸與BCAS3、RFX3蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.05),且RFX3的相關(guān)系數(shù)更高。由此推測,從遺傳因素方面,對于高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)生,RFX3可能起到比BCAS3更為重要的作用。

ROC曲線分析顯示,RFX3對于痛風(fēng)具有較高的診斷價(jià)值(AUC、靈敏度和特異度分別為0.935、96.55%和86.67%),說明巨噬細(xì)胞中RFX3在痛風(fēng)發(fā)生過程中所起的作用較BCAS3更明顯。對于缺乏臨床癥狀而組織中發(fā)現(xiàn)可疑結(jié)晶沉積的患者,BCAS3和RFX3在巨噬細(xì)胞中的高表達(dá)(>5.30和>1.80)提示痛風(fēng)的可能,為臨床診斷不典型痛風(fēng)提供了新的途徑。

綜上所述,痛風(fēng)石中巨噬細(xì)胞通過高表達(dá)BCAS3和RFX3參與痛風(fēng)的發(fā)生。BCAS3可能是通過促進(jìn)IL-1β等炎性因子的表達(dá)和釋放等方面參與痛風(fēng)的發(fā)生,而RFX3可能是通過改變巨噬細(xì)胞的遷移能力并通過促炎作用參與痛風(fēng)的發(fā)病,在痛風(fēng)的發(fā)生過程中二者可能具有一定的協(xié)同促進(jìn)作用。RFX3可能起到比BCAS3更為重要的作用,并且二者在巨噬細(xì)胞中的高表達(dá)對于痛風(fēng)具有較高的診斷價(jià)值,為臨床診斷不典型的痛風(fēng)和開發(fā)治療痛風(fēng)的靶向藥物提供了理論依據(jù)。其中涉及的具體通路和相關(guān)蛋白還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。