古威芹 李晨曦 陳小紅 蘇麗萍 鄭亞杰

【摘要】目的探求O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）啟動子甲基化對新發(fā)野生型膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）患者術(shù)后預(yù)后質(zhì)量的影響。方法回顧性分析2019年1月—2022年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科新診斷的41例異檸檬酸脫氫酶（IDH）野生型GBM患者的臨床資料，通過焦磷酸測序評估GBM患者的MGMT啟動子甲基化狀態(tài)，同時分析與患者預(yù)后質(zhì)量的相關(guān)性。結(jié)果所有患者的MGMT啟動子甲基化發(fā)生率為43%。MGMT啟動子甲基化的患者中位生存期明顯長于未甲基化患者（P<0.05），甲基化患者的總生存期也明顯長于未甲基化患者（P<0.05）。結(jié)論MGMT啟動子甲基化可延長IDH野生型GBM患者術(shù)后放化療后生存期，但未見線性關(guān)系，提示MGMT啟動子甲基化對預(yù)后的影響程度可能不同。

【關(guān)鍵詞】膠質(zhì)母細胞瘤；MGMT；甲基化；烷化治療；焦磷酸測序

【中圖分類號】R739.41【文獻標(biāo)志碼】A【文章編號】16727770（2024）02018205

Prognostic role of MGMT promoter methylation in emerging wildtype glioblastoma patients undergoing chemoradiotherapy GU Weiqin， LI Chenxi， CHEN Xiaohong， et al. Second Department of Neurosurgery， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China

Corresponding author： LI Chenxi

Abstract： ObjectiveTo explore the O6methylguanine DNA methyltransferase（MGMT） promoter methylation on the quality of postoperative prognosis in patients with new wildtype glioblastoma（GBM）. MethodsThe clinical data of 41 patients with wildtype GBM isocitrate dehydrogenase（IDH） newly diagnosed in Department of Neurosurgery， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from 2019 to 2022 were analyzed retrospectively. MGMT promoter methylation status was assessed in GBM patients by pyrosequencing， while simultaneously analyzed for correlation with patient outcome quality. ResultsThe incidence of MGMT promoter methylation in all patients was 43%. Patients with MGMT methylated promoters had significantly higher median survival than unmethylated patients（P<0.05）， and overall survival was significantly longer than unmethylated patients（P<0.05）. ConclusionMGMT promoter methylation can prolong the survival after postoperative chemoradiotherapy in patients with IDH wildtype GBM， but no linear relationship is observed， which suggesting that the effect of MGMT promoter methylation on prognosis may be different.

Key words： glioblastoma; MGMT; methylation; alkylation therapy; pyrosequencing

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（82360256）

作者單位：830054 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外二科（古威芹，陳小紅），病理科（蘇麗萍）；新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（附屬口腔醫(yī)院）口腔頜面腫瘤外科，新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所（李晨曦）；華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，口腔頜面發(fā)育與再生湖北省重點實驗室（李晨曦）；漢堡埃彭多夫大學(xué)醫(yī)學(xué)中心腫瘤遺傳學(xué)和再生醫(yī)學(xué)實驗室神經(jīng)內(nèi)科（鄭亞杰）

通信作者：李晨曦

膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤類型［1］，患者一般以頭痛、癲癇為首發(fā)癥狀，隨后可出現(xiàn)運動和/或感覺神經(jīng)功能障礙等表現(xiàn)?，F(xiàn)階段，最大程度安全手術(shù)切除以及隨后同步放療和替莫唑胺（temozolomide，TMZ）維持化療（STUPP方案）是新診斷GBM患者標(biāo)準(zhǔn)治療方案［2］，然而臨床數(shù)據(jù)顯示，此類患者經(jīng)治療后中位總生存期僅為15～18個月［34］，5年生存率不到7%［5］。O6甲基鳥嘌呤DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶［O6methylguanine（O6MeG）DNA methyltransferase，MGMT］是一種DNA修復(fù)蛋白，可催化甲基從O6位的鳥嘌呤DNA核苷酸轉(zhuǎn)移到其自身145位的半胱氨酸殘基，并發(fā)揮修復(fù)作用，在維持基因組的完整性以及修復(fù)DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中的差異和錯誤方面發(fā)揮著重要作用［6］，同時這種修復(fù)機制防止了由于烷化劑導(dǎo)致的細胞死亡、基因突變和腫瘤轉(zhuǎn)化。CpG島主要位于基因的啟動子和外顯子區(qū)域，正常細胞的CpG島處于非甲基化狀態(tài)。MGMT啟動子的甲基化導(dǎo)致基因沉默，降低MGMT蛋白表達和其DNA修復(fù)活性，增加腫瘤對烷化劑（如TMZ）的敏感性［78］。Hegi等［9］研究證明，MGMT啟動子甲基化可以預(yù)測TMZ的療效。研究發(fā)現(xiàn)，CpG 8487和89對MGMT蛋白表達的影響最大，與之相反，CpG 7381的分析與MGMT蛋白表達的相關(guān)性最好［10］。然而，CpG 7489區(qū)域的平均甲基化與GBM患者的中位生存時間顯著相關(guān)［1113］。本研究回顧性分析了2019年1月—2022年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科新診斷的41例異檸檬酸脫氫酶isocitrate dehydrogenase，IDH）野生型GBM患者的臨床資料，旨在評估MGMT啟動子甲基化在接受放化療的新診斷野生型GBM患者的預(yù)后意義及其與臨床變量的關(guān)聯(lián)。現(xiàn)報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料共納入41例通過焦磷酸測序（pyrosequencing，PSQ）評估MGMT啟動子甲基化狀態(tài)的連續(xù)IDH野生型GBM患者，其中男32例，女9例；年齡49～81歲，平均年齡（53.06±12.92）歲。PSQ方法檢測了75～84個CpG位點的MGMT基因啟動子。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)組織病理學(xué)證實的GBM診斷（根據(jù)WHO 2007年和2016年）；（2）美國東部腫瘤協(xié)作組（eastern cooperative oncology group，ECOG）的體力狀況評分（performance status，PS）≤2后開始腫瘤治療；（3）以TMZ作為一線治療的放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）植入卡莫司汀晶片（Gliadel）的患者；（2）患有IDH 12突變腫瘤的患者，以避免干擾對該特定患者群體的結(jié)果評估。所有患者均為新診斷GBM患者，根據(jù)STUPP方案，所有患者均接受術(shù)后同步放療和TMZ治療，同時根據(jù)有否MGMT啟動子甲基化分為甲基化組（18例）和未甲基化組（23例）。本研究已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)（審批號：K2022022585）。

1.2組織樣本提取每個組織樣本提供10 μm的石蠟包埋腫瘤組織切片并進行處理以分離DNA。為了避免壞死組織的污染，通過顯微解剖，選擇至少有60%的腫瘤細胞組織樣本。

1.3DNA甲基化水平檢測采用PSQ方法測定GBM組織DNA樣本中MGMT基因啟動子甲基化的程度，其中DNA樣本按照試劑說明書使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen， Hilden， Germany） 提取，測序選用PyroMark Q24型（QIAGEN Lmt.Co.，Germany）焦磷酸測序儀進行分析，基本流程：組織DNA樣本提取→亞硫酸氫鹽處理→DNA樣本純化→聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增→凝膠電泳→焦磷酸測序。使用Nanodrop機器（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）通過分光光度法評估DNA質(zhì)量和濃度。根據(jù)試劑說明書，將250 ng的基因組DNA置于MGMT Plus亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒（Diatech，Iesi，Italy）中。用亞硫酸氫鹽處理DNA，以確定10個CpG位點（CpG 7584）的甲基化狀態(tài)。PSQ的模板通過Rotorgene 6000用針對模板鏈（MGMT Plus Kit，Diatech，Iesi，Italy）生物素化的引物進行擴增。然后將20 μL生物素化PCR產(chǎn)物固定在鏈霉親和素包被的瓊脂糖珠（GE Healthcare，Uppsala，Sweden）上，并使用PyroMark Q96系統(tǒng)（Diatech，Iesi，Italy）分析單鏈DNA模板。使用PyroMark Q96 配套軟件對分析的10個CpG甲基化密度進行量化，并通過計算所有10個甲基化位點的平均值，獲得每個樣品的甲基化百分比。樣品一式兩份運行。

1.4PCR擴增模板選擇為經(jīng)甲基化處理的DNA，選用特異甲基化引物MF/MR和未甲基化引物UF/UR進行PCR擴增，見表1。擴增條件：首先95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃處理30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃擴增30 s，以上條件進行35個循環(huán)，隨后在72 ℃條件下延伸5 min。將擴增產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，采用紫外凝膠成像進行結(jié)果觀察。分離條帶中非甲基化條帶出現(xiàn)擴增而甲基化條帶未擴增提示甲基化陰性，反之則為甲基化陽性。

1.5手術(shù)后輔助治療方案及隨訪調(diào)查新診斷GBM患者標(biāo)準(zhǔn)治療方案即STUPP方案，包括最大程度安全手術(shù)切除及術(shù)后整個放射治療期間使用75 mg/m2的TMZ進行化療，每28天單獨使用150～200 mg/m2的TMZ持續(xù)化療5 d。手術(shù)后每半年進行1次隨訪，記錄患者的生存狀態(tài)，總生存期（overall survival，OS）是指從手術(shù)日期到死亡或最后一次隨訪的日期。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），中位數(shù)［四分位數(shù)間距（interquartile range，IQR）］分別用于描述正態(tài)分布和非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)。使用KaplanMeier法繪制生存曲線，并應(yīng)用分段分析的Logrank檢驗來評估生存差異。計數(shù)資料采用例數(shù)（率）進行描述，組間比較采用χ2檢驗，統(tǒng)計效應(yīng)值可信度使用95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）表示，以P<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組患者的一般資料比較甲基化組與未甲基化組患者的年齡、性別、腫瘤體積、手術(shù)切除范圍（全切、次全切）、術(shù)前卡氏評分（Karnofsky performance status，KPS）、美國麻醉師協(xié)會（American society of anesthesiologists，ASA）評分和累及部位（額葉、顳葉、頂葉、枕葉、多部位）等基本資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.2MGMT甲基化組與未甲基化組患者的OS比較MGMT甲基化組患者的中位OS為504 d，未甲基化組患者的中位OS為329 d，MGMT甲基化組明顯長于未甲基化組（P<0.05），見圖1。

2.3GBM患者生存時間與MGMT啟動子甲基化和腫瘤切除范圍的相關(guān)性在接受全切術(shù)的26例患者中，11例（42.3%）發(fā)生MGMT啟動子甲基化。全切術(shù)后，甲基化患者的中位OS為551 d，而未發(fā)生甲基化患者的中位OS為321 d。在接受次全切除術(shù)的患者中，有7例患者具有甲基化的MGMT啟動子，中位OS為376.5 d，而8例具有未甲基化MGMT啟動子的患者，中位OS為260 d，MGMT甲基化組明顯長于未甲基化組（P<0.05），見圖2。

2.4GBM患者生存時間與MGMT甲基化和腫瘤大小相關(guān)性腫瘤體積≤32 mm3的21例患者中，10例（47.6%）發(fā)生MGMT甲基化，11例沒有甲基化。MGMT甲基化的患者具有明顯更長的中位OS（560.5 d vs 329 d，P<0.05）。在腫瘤體積>32 mm3的患者中，MGMT甲基化和非甲基化患者的存活率并沒有顯著差異（P>0.05），見圖3。

3討論

TMZ是一種新型的口服烷化劑化療藥物，具有抗癌活性廣和血腦屏障穿透力強等優(yōu)勢，是GBM的重要化療藥物，但臨床數(shù)據(jù)顯示，約有半數(shù)GBM患者對TMZ耐藥，其中相關(guān)靶基因啟動子甲基化修飾引起基因沉默或激活起著重要作用，同時也是提高GBM化療療效的新方向［1415］。MGMT基因定位于人10號染色體長臂，其功能是將鳥嘌呤O6位點的甲基轉(zhuǎn)移至半胱氨酸殘基來修復(fù)受損的鳥嘌呤核苷酸，實現(xiàn)DNA修復(fù)目的，降低烷基化劑所致基因突變、細胞死亡以及腫瘤發(fā)生風(fēng)險，因此常被視作為化療抗性因子。研究表明，MGMT基因表達調(diào)控主要以表觀遺傳修飾為主，表現(xiàn)為MGMT啟動子的CpG島甲基化修飾，而發(fā)生基因突變、缺失及重排的概率較低，啟動子的甲基化可導(dǎo)致MGMT轉(zhuǎn)錄和蛋白表達沉默，影響細胞DNA修復(fù)活性從而增強烷化劑（如TMZ）敏感性。MGMT基因啟動子包含98個位于轉(zhuǎn)錄起始位點附近的CpG位點，由2個不同的甲基化區(qū)域組成，即CpG 2550和7390［16］。CpG甲基化的情況下，基因的轉(zhuǎn)錄受阻導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的酶活性喪失。

正確選擇分析MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)的方法對于不同CpG位點的甲基化異質(zhì)性至關(guān)重要。雖然CpG 8487和89對MGMT蛋白表達的影響最大，但CpG 7381的分析與MGMT蛋白表達的相關(guān)性最好［17］。然而，也有研究表明，CpG 7489區(qū)域的甲基化與GBM患者的中位OS顯著相關(guān)。而本研究中，通過分析75～84個MGMT CpG位點，結(jié)果符合之前報道的CpG最佳區(qū)域［18］。與生存相關(guān)的MGMT啟動子甲基化缺失的確定一直被認為是最復(fù)雜和最有爭議的方面之一?；蛱卣鲗εR床預(yù)后和選擇合適的治療方案具有重要作用。在評估GBM患者的OS時，本研究考慮了MGMT啟動子基因甲基化的存在、腫瘤切除的程度、患者的年齡和腫瘤的位置。本研究結(jié)果表明，具有MGMT基因啟動子甲基化的GBM患者對輔助治療的反應(yīng)更有利，因此生存時間更長。具有MGMT甲基化的基線腫瘤體積≤32 mm3的患者生存時間顯著延長（560.5 d vs 329 d，P< 0.05）。這可以歸因于與體積較大的腫瘤相比，較小腫瘤的更易徹底切除。本研究結(jié)果還顯示，具有MGMT基因啟動子甲基化的GBM患者對輔助治療的反應(yīng)更有利，因此生存時間更長。大量研究表明，MGMT甲基化可預(yù)測患者較長的生存時間［1921］。Binabaj等［22］對29項報告了MGMT啟動子甲基化對OS影響的研究進行了薈萃分析，在15項研究的單變量分析中，合并風(fēng)險比為0.67（95%CI：0.58～0.78），在14項研究的多變量分析中，合并風(fēng)險比為0.49（95%CI：0.38～0.64）［22］。另有幾項試驗也發(fā)現(xiàn)，在接受TMZ治療的具有甲基化MGMT啟動子的個體中，患者無進展生存期得到延長［23］。本研究結(jié)果與目前文獻報道基本一致，提示MGMT甲基化有助于增強GBM患者化療敏感性，延長手術(shù)后生存期。

本研究中，MGMT啟動子甲基化是一個有利的預(yù)后因素，診斷時小腫瘤（≤32 mm3）和接受全切術(shù)的患者總生存期最長。由MGMT啟動子甲基化導(dǎo)致的DNA修復(fù)基因的表觀遺傳沉默與接受烷化劑治療的GBM患者的存活時間更長有關(guān)。但仍需要更多中心研究評估MGMT啟動子甲基化與MGMT表達，或MGMT基因甲基化的關(guān)系，以充分了解其預(yù)后潛力。

本研究存在一些局限性。首先，本研究是針對在單一機構(gòu)接受治療的相對較小樣本量的患者群體進行的，結(jié)局指標(biāo)不包括無進展生存期。其次，由于本研究隨訪期間沒有評估IDH中的突變效應(yīng)，可能夸大了MGMT啟動子甲基化的預(yù)后意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

［參 考 ?文 ?獻］

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