吳 慶，楊小萍，辛世華，方海田*

（1.寧夏工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院 旅游管理學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

老面，又稱為老面酵頭、酵子、面肥、起子、老酵面、傳統(tǒng)酸面團等，是我國發(fā)酵面食中用到的一種傳統(tǒng)發(fā)酵劑[1-2]。老面發(fā)酵技術(shù)是將上次制作面食制品留下的一塊面團作為發(fā)酵劑用于下次面團的發(fā)酵，這樣的過程稱為傳代發(fā)酵處理[3-4]。相比較于市售的單一酵母純種發(fā)酵，老面發(fā)酵面團的優(yōu)勢在于其主要是以酵母菌、乳酸菌為主的多菌發(fā)酵體系，混合協(xié)同發(fā)酵不僅能夠產(chǎn)生更加豐富的風(fēng)味和口感，同時乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸還能夠抑制病原微生物生長，延長發(fā)酵面食的保質(zhì)期[5-6]。

老面發(fā)酵技術(shù)作為一種自然、有效的食品加工技術(shù)在改善面食制品品質(zhì)方面的應(yīng)用得到了越來越多的關(guān)注[7-9]。老面中的微生物菌群會被多種因素影響，如不同原料、地域環(huán)境和發(fā)酵工藝等[10-12]。MICHEL E等[13]通過高通量測序技術(shù)和實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chainreaction，PCR）法檢測16個法國發(fā)酵面團樣品中乳酸菌的相對豐度結(jié)果表明，舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）是主要的優(yōu)勢菌種；高靜等[14]采用高通量技術(shù)分析老面中的菌群組成發(fā)現(xiàn)，河北、山西、山東樣品中以片球菌屬（Pediococcus claussen）為主，而云南樣品中以乳桿菌屬（Lactobacillus）為主；李曉敏等[15]對山西、河北、青海、甘肅和河南5個地區(qū)酸面團樣品中的細菌菌群結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬、乳球菌屬（Lactococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）；閆博文[16]采用傳統(tǒng)分離手段結(jié)合高通量測序技術(shù)對山東和河南2個地區(qū)的15個老面酵頭樣品的菌群多樣性進行分析發(fā)現(xiàn)，山東老面酵頭中主要是舊金山乳桿菌、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria），而河南酵頭主要由食竇魏斯氏菌、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）構(gòu)成。目前對我國不同區(qū)域老面樣品及發(fā)酵不同時期的菌群結(jié)構(gòu)差異的研究報道較多，對于老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中的菌群結(jié)構(gòu)變化的研究報道較少。老面中的微生物菌群結(jié)構(gòu)是保障發(fā)酵面食產(chǎn)品質(zhì)量和風(fēng)味的前提與基礎(chǔ)[17]。老面發(fā)酵因其菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前主要局限于家庭自用和小作坊生產(chǎn)。探究老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程的細菌多樣性和菌群結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律，對于老面的工業(yè)化生產(chǎn)尤為重要。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)考察了傳代發(fā)酵過程（1代、2代和4代）中老面樣品中細菌菌群結(jié)構(gòu)，對高通量測序結(jié)果進行α多樣性及β多樣性分析，并對其細菌菌群進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，以期揭示老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，為傳統(tǒng)老面發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用老面（sourdough，SD）（即每次面團發(fā)酵完成后留取的部分面團，循環(huán)使用）：來自于實驗室保存；小麥粉（塞北雪）：市售。Power Soil 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：上海天根生化科技有限公司，2×TaqPlus Master Mix：美國KAPA公司；甲醇、乙腈、氨水、醋酸銨、2-氯苯丙氨酸（均為色譜純）：麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高通量二代測序儀：美國Illumina公司；Agilent 2100生物分析儀：德國Agilent公司；Labchip GX生物大分子分析儀：美國PerkinElmer公司；ABI 9700 PCR儀：美國ABI公司；Nanodrop2000 超微量分光光度計：美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 傳代發(fā)酵面團的制備

以老面50 g、小麥粉200 g、蒸餾水105 mL于UKOEO全自動揉面機智能模式下揉面15 min，取出覆保鮮膜在室溫條件下（25～28 ℃）自然發(fā)酵至16 h，命名為第一代，取出50 g老面面團繼續(xù)上述步驟，連續(xù)傳代4代，取第1代、第2代、第4代老面發(fā)酵面團的樣品分別命名為SD1、SD2和SD3[3]。每代發(fā)酵時期平行取3個發(fā)酵面團樣本，編號分別為1、2和3。

1.3.2 Illumina MiSeq測序和數(shù)據(jù)分析[18]

根據(jù)Power Soil DNA試劑盒說明書，以老面發(fā)酵面團微生物總DNA為模板，采用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）為上下游引物擴增細菌16S rRNA的V3-V4區(qū)域。25 μL PCR擴增體系：DNA樣品3 μL，2×TaqPlus Master Mix 12.5 μL，5 μmol/L 338F和806R各1 μL，雙蒸水（ddH2O）7.5 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，28個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增完成后，以3 μL PCR產(chǎn)物點樣1.0%瓊脂糖凝膠電泳確認PCR產(chǎn)物質(zhì)量，以500 bp左右處出現(xiàn)清晰的條帶為準。最后將PCR產(chǎn)物送至北京奧維森基因科技有限公司Illumina MiSeq平臺測序，使用軟件UPARSE進行質(zhì)量控制，以97%相似性劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），并提交到奧維森云分析平臺進行多樣性分析（http：//cloud.allwegene.com）。

1.3.3 功能預(yù)測分析[19]

使用PICRUSt軟件進行微生物群落的代謝功能預(yù)測，參照京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫進行功能注釋。采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理和相關(guān)圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果和Alpha多樣性分析

通過Illumina MiSeq高通量測序，9份老面樣本共獲得538 981條優(yōu)化序列，平均長度為429 bp，各樣本抽平OTU數(shù)和Alpha多樣性指數(shù)見表1。由表1可知，所有序列均按97%相似度歸為OTU，9個樣品共聚合了495個OTU。經(jīng)OTU分析，這些序列歸屬于6個門、14個綱、20個目、28個科、39個屬、15個種。隨著傳代次數(shù)的增加，總OTUs、Phylum（門）、Class（綱）、Order（目）、Family（科）、Genus（屬）、Species（種）的OTU數(shù)量，呈先減少后增加趨勢。老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中，四代（SD3）的總OTU數(shù)、屬水平的OTU數(shù)量高于一代（SD1）和二代（SD2）。

表1 老面樣品微生物菌群的操作分類單元數(shù)和Alpha多樣性指數(shù)分析Table 1 Operational taxonomic units number and alpha diversity index analysis of microbial community in sourdough samples

Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)是基于97%相似度水平下的OTU信息以評估樣品微生物多樣性和豐富度。Coverage指數(shù)表示測序深度，本研究中樣品的Coverage指數(shù)均為1.00，表明測序深度良好，能夠真實反映樣品的微生物信息。Shannon指數(shù)和Coverage指數(shù)反映群落的多樣性，Chao 1指數(shù)反映群落的豐富度。Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高，Chao 1指數(shù)逐漸降低，說明微生物的豐富度逐漸降低[20]。由表1可知，Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)變化趨勢相同，均呈先降低后增加趨勢，SD2樣品的Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)均明顯低于SD1和SD3樣品，說明老面?zhèn)鞔l(fā)酵至第二代時，物種豐富度和群落多樣性最低。

2.2 老面微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 基于門水平細菌群落多樣性分析

基于門水平不同老面樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)見圖1。由圖1可知，在門分類水平上，主要優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes），平均相對豐度呈先增加后減少趨勢，SD1、SD2和SD3的平均相對豐度依次為93.62%、95.58%和92.38%，其次為藍藻菌門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria），變化趨勢與厚壁菌門相反，呈先減少后增加趨勢，平均相對豐度分別為SD3（4.43%）＞SD1（3.48%）＞SD2（1.98%）、SD3（3.17%）＞SD1（2.90%）＞SD2（2.43%），擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度極低（0.04%）。研究表明，厚壁菌門廣泛存在于發(fā)酵食品中[21]；高靜等[14]采集河北、山西、山東、云南、青海、甘肅和河南酸面團地區(qū)的傳統(tǒng)酸面團樣品的高通量測序結(jié)果表明，厚壁菌門在所有樣品中都占有絕對優(yōu)勢。因此，在門水平上，各地老面酵頭的優(yōu)勢菌群有高度的一致性，厚壁菌門是最普遍、最豐富的存在。

圖1 基于門水平不同老面樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 1 Bacterial community structure of sourdough samples based on the phylum level

2.2.2 基于屬水平、種水平細菌群落多樣性分析

基于屬、種水平不同老面樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 基于屬（a）、種（b）水平不同老面樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 2 Bacterial community structure of sourdough samples based on the genus (a) and species (b) level

由圖2a可知，老面?zhèn)鞔鷺悠钒l(fā)酵過程中，主要菌屬（平均相對豐度＞4%）為乳桿菌屬（Lactobacillus），其屬于厚壁菌門（Firmicutes）。乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度呈先增加后減少趨勢，其在SD1、SD2和SD3樣品中的平均相對豐度依次為93.59%、95.54%和92.33%。

由圖2b可知，除了未能鑒定的種屬外，老面?zhèn)鞔l(fā)酵中的優(yōu)勢種（平均相對豐度＞4%）為舊金山乳桿菌（L.sanfranciscensis）、干酪乳桿菌（L.sakei）、短乳桿菌（L.brevis）和加氏乳桿菌（L.gasseri），它們均屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）。其中舊金山乳桿菌（L.sanfranciscensis）和干酪乳桿菌（L.sakei）的平均相對豐度變化為先減少后增加，平均相對豐度分別為SD1（20.02%）＞SD3（19.73%）＞SD2（19.68%）和SD3（7.27%）＞SD1（7.00%）＞SD2（6.93%）。短乳桿菌（L.brevis）的平均相對豐度變化為一直減少，即SD1（6.35%）＞SD2（6.33%）＞SD3（6.11%），加氏乳桿菌（L.gasseri）的平均相對豐度無變化，均為4.01%。

研究表明，老面面團在連續(xù)發(fā)酵過程中，在發(fā)酵初期的優(yōu)勢菌主要是腸球菌屬、乳球菌屬和明串珠菌屬；經(jīng)過一段時間發(fā)酵后，面團中的乳酸桿菌屬、片球菌屬和魏氏菌屬逐漸增多[22]；發(fā)酵完成后，老面面團中以適應(yīng)性專性異型發(fā)酵乳酸菌為主導(dǎo)，如舊金山乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌等乳酸桿菌屬，而腸桿菌科、假單胞菌和霉菌等會在發(fā)酵過程中逐漸減少至無法檢測[23-24]。產(chǎn)生這種變化的原因就在于老面面團中的乳酸菌能夠發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸和乙酸，進而使面團的pH值不斷降低，而乳酸菌對面團中的酸性環(huán)境適應(yīng)性較強，逐漸成為其中的優(yōu)勢菌群，同時較低的pH抑制了腸桿菌科的生長[25]。同時老面發(fā)酵屬于傳統(tǒng)的自然發(fā)酵，以連續(xù)傳代、連續(xù)發(fā)酵的方式生產(chǎn)，不需要額外添加菌種，發(fā)酵溫度低（30 ℃以下），所以發(fā)酵完成后主要以短乳桿菌、植物乳桿菌、舊金山乳桿菌等適應(yīng)低溫發(fā)酵的乳酸桿菌為主導(dǎo)[1]。

本研究老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中，主要是以厚壁菌門的乳桿菌屬為主，在連續(xù)傳代過程中，老面?zhèn)鞔l(fā)酵中的優(yōu)勢種為乳桿菌屬（Lactobacillus）的舊金山乳桿菌（L.sanfranciscensis）、干酪乳桿菌（L.sakei）、短乳桿菌（L.brevis）和加氏乳桿菌（L.gasseri）。在傳代過程中，微生物多樣性雖有變化，但相對含量變化不顯著（P＞0.05）。這也再次驗證了前人的研究結(jié)論，說明老面發(fā)酵最終會形成一個趨于穩(wěn)定、成熟的微生物區(qū)系，能夠適應(yīng)外界環(huán)境的變化[16，25]。

2.3 β多樣性分析

2.3.1 聚類分析

為研究老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中不同發(fā)酵階段群落結(jié)構(gòu)的相似性或差異關(guān)系，基于unifrac樣本距離對3個發(fā)酵階段樣品細菌菌群的β多樣性指數(shù)進行聚類分析，結(jié)果見圖3。

圖3 基于屬水平老面樣品細菌菌群的β多樣性指數(shù)聚類分析熱圖Fig. 3 Heat map for β-diversity index cluster analysis of sourdough samples based on the genus level

由圖3可知，3個發(fā)酵階段可聚為3類，SD1-3、SD1-2、SD3-1聚為一類，SD2-1、SD2-2、SD2-3聚為一類，SD1-1、SD3-2、SD3-3聚為一類。由屬水平細菌群落結(jié)構(gòu)（圖2a）可知，其中一代（SD1）、二代（SD2）、四代（SD3）的優(yōu)勢菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus），平均相對豐度依次為93.59%、95.54%、92.33%?？傮w而言，老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中在細菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，豐度變化不顯著（P＞0.05），這與細菌群落在屬水平上相對豐度分析結(jié)果一致。

2.3.2 主坐標分析

主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），是通過分析不同樣本OTU（97%相似性）組成可以反映樣本間的差異和距離來研究多個樣品間數(shù)據(jù)的多樣性、差異性或相似性的一種方法，通過PCoA圖可以分析老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中樣品細菌群落的差異。

由圖4可知，PC1的方差貢獻率為94.59%，PC2的方差貢獻率為4.36%，累計方差貢獻率為98.95%，能很好地區(qū)分樣品的細菌群落分布差異情況。在PCA中，各個點之間的距離越大，表明它們之間的菌群差異越大[26]。反之，樣本點越接近，表明兩樣本物種組成則越相似[27]。在三個平行樣本中，SD1相較于SD2和SD3其樣本之間距離較遠，表明1代老面樣品組內(nèi)的差異較大，可能是老面剛接入新鮮面粉中發(fā)酵，菌屬分布不均勻所致。從整體來看，SD1-1、SD2-2、SD2-3、SD3-2分布于第一象限，SD1-2、SD3-1、SD3-3分布于第二象限，分布于同一象限的兩兩之間距離最近且聚集度較高，說明其細菌群落結(jié)構(gòu)較為相似。而SD1、SD2和SD3在一、二象限均有分布且距離較近，因此，SD1、SD2和SD3在微生物群落組成和結(jié)構(gòu)上也存在相似之處，這與樣本聚類分析結(jié)果相同。

圖4 老面樣品在屬水平上細菌菌群的主坐標分析Fig. 4 Principal coordinates analysis of sourdough samples at the genus level

2.4 老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中細菌菌群的代謝功能預(yù)測分析

老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中細菌菌群KEGG代謝功能預(yù)測結(jié)果見圖5。由圖5可知，KEGG在一級水平上細菌群落功能包括有機系統(tǒng)、細胞進程、人類疾病、基因處理和代謝進程。二級水平上共14種代謝通路，關(guān)于代謝途徑序列的相對豐度解釋了90.44%。細菌群落功能大多集中在碳水化合物代謝（41.95%～43.57%）、維生素及輔酶因子代謝（15.25%～15.87%）、分子排序、結(jié)構(gòu)折疊與降解（14.12%～14.67%）、氨基酸代謝（10.91%～11.19%）等功能分類中。碳水化合物代謝、維生素及輔酶因子代謝、能量代謝、萜類及聚酮化合物代謝等能為細菌的生長繁殖提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)；面團發(fā)酵過程中，碳水化合物的代謝主要是通過糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)進行。葡萄糖經(jīng)糖酵解和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的α-酮酸，例如丙酮酸、乙酰輔酶A、α-酮戊二酸等，是參與氨基酸代謝及合成多種風(fēng)味物質(zhì)的重要前提物[16，28]。分子排序、結(jié)構(gòu)折疊與降解、翻譯是微生物自身合成遺傳物質(zhì)的主要代謝通路；氨基酸代謝在微生物演替中的作用主要包括兩個方面，一方面是氨基酸的合成代謝，用于合成自身獨特的蛋白質(zhì)、多肽和其他含氮物質(zhì)，以產(chǎn)生相應(yīng)的氮源為微生物利用；另一方面是氨基酸的分解代謝，通過脫氨基、轉(zhuǎn)氨基、聯(lián)合脫氨基的方式分解為α-酮酸、胺類和二氧化碳，顯著影響發(fā)酵食品風(fēng)味的形成[29]。

圖5 老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中細菌菌群KEGG代謝功能預(yù)測結(jié)果Fig. 5 Prediction results of KEGG metabolic function of bacterial community in sourdough during generation fermentation

一代至四代老面樣品碳水化合物的相對豐度先增加后減少；氨基酸代謝、維生素及輔酶因子代謝、萜類及聚酮化合物代謝、能量代謝、分子排序、結(jié)構(gòu)折疊與降解的相對豐度先減少后增加。但老面酵頭傳代發(fā)酵過程中，細菌群落的代謝通路變化不顯著（P＞0.05），最主要代謝通路即碳水化合物代謝等功能成分的變化與乳桿菌屬物種豐度指數(shù)變化趨勢基本一致，即從一代到四代過程中，基因數(shù)量先減少，然后逐漸恢復(fù)，這說明群落結(jié)構(gòu)的變化是其整體代謝功能發(fā)生變化的重要原因。

相對豐度排名前20的老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中細菌菌群3級KEGG同源功能預(yù)測結(jié)果見圖6。由圖6可知，3級KEGG同源功能預(yù)測結(jié)果顯示，在排名前20的代謝途徑中，磷酸戊糖途徑的相對豐度遠遠高于其他代謝途徑。磷酸戊糖途徑是異型乳酸菌發(fā)酵的主要代謝途徑，在老面酵頭傳代發(fā)酵過程中具有重要作用。磷酸戊糖途徑屬于二級代謝途徑中碳水化合物代謝途徑，這再次驗證了碳水化合物代謝途徑在老面酵頭發(fā)酵過程中有重要作用。發(fā)酵面制食品重要風(fēng)味物質(zhì)主要受乳酸菌影響，大約40%的風(fēng)味物質(zhì)如醇類、酯類、酮類、酸類、醛類等都和乳酸菌發(fā)酵相關(guān)[19]。舊金山乳桿菌的生長代謝的適宜溫度和pH值與酸面團發(fā)酵過程中溫度和pH值的變化相匹配，因此更利于它們的生長代謝[30]；同時乳酸菌具有多種應(yīng)激反應(yīng)機制來克服酸性環(huán)境、高溫或低溫環(huán)境、高滲透壓或脫水環(huán)境以及缺乏可利用底物環(huán)境等劣勢條件[31]。

圖6 老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中細菌菌群3級KEGG同源功能預(yù)測結(jié)果Fig. 6 Prediction results of 3rd grade KEGG homology function of sourdough bacterial community during generation fermentation

3 結(jié)論

利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對老面?zhèn)鞔l(fā)酵過程中的細菌菌群多樣性進行解析，并對其細菌菌群進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。結(jié)果表明，從一代（SD1）到四代（SD3）老面樣品中的優(yōu)勢菌門、屬和種的相對豐度無顯著變化（P＞0.05），優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、藍藻菌門（Cyanobacteria）和變形菌門；優(yōu)勢菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus）；優(yōu)勢菌種為舊金山乳桿菌（L.sanfranciscensis），其次為干酪乳桿菌（L.sakei）、短乳桿菌（L.brevis）和加氏乳桿菌（L.gasseri），其相對豐度變化同群落豐度變化相同，不同傳代間的老面樣品樣品的平均相對豐度變化不顯著（P＞0.05）。從SD1到SD3代老面樣品中細菌菌群主要功能為碳水化合物代謝、其次為維生素及輔酶因子代謝、分子排序、結(jié)構(gòu)折疊與降解、氨基酸代謝；磷酸戊糖途徑是最主要的三級代謝功能。老面在發(fā)酵過程中，會形成復(fù)雜而穩(wěn)定的微生物生態(tài)環(huán)境，傳代處理對其群組成和動態(tài)變化影響較低，這不僅反映出對面團特定生境的適應(yīng)潛力，也展示出乳酸菌的種內(nèi)異質(zhì)性。本研究可為推動老面發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。