賈菲 朱藝欣 王藝臻

摘要?目的：探討單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）和血紅素加氧酶1（HO-1）在氯吡格雷（INN）抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）刺激的血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）表達(dá)中的作用及機(jī)制。方法：①內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）用INN預(yù)處理24 h或N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）預(yù)處理2 h，并用2，7-二氯熒光素二乙酸酯（H2DCFDA）處理15 min，然后再用TNF-α處理20 min，測定活性氧（ROS）水平。②將ECs與INN孵育指定的時(shí)間點(diǎn)，蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blotting）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測HO-1蛋白、mRNA表達(dá)，測量HO-1活性。 將轉(zhuǎn)染shHO-1的ECs與INN孵育24 h，再用TNF-α刺激6 h。在有或沒有INN的情況下，將ECs與TNF-β孵育8 h，進(jìn)行黏附測定。③將ECs與INN孵育不同的時(shí)間，對總蛋白進(jìn)行磷酸化-AMPK（p-AMPK）和AMPK表達(dá)Western Blotting分析。 ECs用STO-609和化合物C（一種AMPK抑制劑）處理1 h，與INN一起孵育16 h。檢測HO-1蛋白、mRNA表達(dá)，測量HO-1活性。 ECs用STO-609和化合物C處理1 h，然后與INN一起孵育24 h，檢測谷胱甘肽（GSH）含量。④ECs用化合物C處理1 h，然后與INN孵育指定的時(shí)間，檢測核因子-E2相關(guān)因子2（Nrf2）蛋白表達(dá)。用shLuc或shNrf2轉(zhuǎn)染ECs，用10 μmol/L INN處理16 h，檢測HO-1蛋白、mRNA表達(dá)。⑤用TNF-α處理ECs，使用或不使用二甲基亞砜（DMSO）（空白載體），INN，或INN＋化合物C進(jìn)行VCAM-1、p-AMPK和AMPK表達(dá)測量。在有或沒有INN的情況下，將用shLuc或shNrf2轉(zhuǎn)染的EC與TNF-α孵育8 h，檢測VCAM-1表達(dá)。結(jié)果：INN減少了TNF-α誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，并在時(shí)間上提示HO-1的表達(dá)和活性。 INN增加了細(xì)胞GSH水平。shHO-1阻斷了INN對TNF-α誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞黏附的抑制作用。鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶β（CaMKKβ）/AMPK通路和Nrf2轉(zhuǎn)錄因子與INN誘導(dǎo)HO-1有關(guān)。另外，TNF-α明顯增加了VCAM-1蛋白和mRNA的表達(dá)。INN處理顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)和HL-60細(xì)胞黏附?；衔顲和shNrf2消除了TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)和HL-60細(xì)胞黏附。結(jié)論：氯吡格雷通過CaMKKβ/AMPK/Nrf2途徑抑制TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)進(jìn)而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。

關(guān)鍵詞?氯吡格雷；鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶β/腺苷酸激活蛋白激酶/核因子E2相關(guān)因子2通路；腫瘤壞死因子-α；血管細(xì)胞黏附分子-1；內(nèi)皮細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.02.012

Effect of Clopidogrel on Endothelium by Hindering TNF-α Induced VCAM-1 Expression through CaMKKβ/AMPK/Nrf2 Pathway

JIA Fei， ZHU Yixin， WANG Yizhen

Affiliated Hospital of Yan′an University， Yan′an 716000， Shaanxi， China

Corresponding Author?WANG Yizhen， E-mail： wang23pharmacy@aliyun.com

Abstract Objective?To elucidate the role of AMP-activated protein kinase（AMPK） and heme oxygenase 1（HO-1） in the clopidogrel（INN） inhibition of tumor necrosis factor（TNF-α）-stimulated expression of vascular cell adhesion molecule 1（VCAM-1）.Methods：①ECs（endothelium cells） were pretreated with INN for 24 h or N-acetyl-L-cysteine（NAC） for 2 h，and treated with H2DCFDA for 15 min prior to being challenged with TNF-α for another 20 min.ROS levels were assayed.②ECs were incubated with INN for the indicated time points.Western blotting and reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） were used to analyze HO-1 protein and mRNA expression.HO-1 activity was measured.ECs transfected with shHO-1 were incubated with INN for 24 h prior to being stimulated with TNF-α for additional 6 h.ECs were incubated with TNF-α in the presence or absence of INN for 8 h.Adhesion assay was performed.③ECs were incubated with INN for various time periods.Total protein was subjected to Western analysis for p-AMPK and AMPK expression.ECs were treated with STO-609 and Compound C for 1 h，followed by incubation with INN for another 16 h.HO-1 protein and mRNA expression were ananlyzed.HO-1 activity was measured.ECs were treated with STO-609 and Compound C（Comp C） for 1 h，followed by incubation with 10 μmol/L INN for another 24 h.Glutathione（GSH） content was detected.④ECs were treated with Comp C for 1 h and then incubated with INN for the indicated time，nuclear factor E2 related factor 2（Nrf2） protein expression was analyzed.ECs were transfected with shLuc or shNrf2 and treated with 10 INN for 16 h，HO-1 protein and mRNA expression were ananlyzed.⑤ECs were treated with TNF-α with or without DMSO（vehicle），INN，or INN＋Comp C for VCAM-1，p-AMPK，and AMPK expression measurement.ECs transfected with shLuc or shNrf2 were incubated with TNF-αin the presence or absence of INN for 8 h for VCAM-1 expression measurement.Results：INN reduced TNF-αinduced reactive oxygen species（ROS） generation and time-dependently prompted the expression and activity of HO-1.Cellular GSH levels were augmented by INN.shHO-1 blocked the INN suppression of TNF-α induced HL-60 cell adhesion. ?The calmodulin-dependent protein kinase kinase β（CaMKKβ）/AMPK pathway and Nrf2 transcriptional factor were implicated in the induction of HO-1 by INN.Additionally，TNF-α dramatically augmented VCAM-1 expression at protein and mRNA levels.INN treatment strikingly repressed TNF-α induced expression of VCAM-1 and HL-60 cell adhesion.Compound C，an AMPK inhibitor，and shNrf2 abolished TNF-α induced expression of VCAM-1 and HL-60 cell adhesion.Conclusions：INN protects endothelium by hindering TNF-α induced VCAM-1 expression through CaMKK/AMPK/Nrf2 Pathway.

Keywords?clopidogrel; calmodulin-dependent protein kinase kinase β/AMP-activated protein kinase/nuclear factor E2 related factor 2 Pathway; tumor necrosis factor-α; vascular cell adhesion molecule-1; endothelium

作者單位?延安大學(xué)附屬醫(yī)院（陜西延安 716000）

通訊作者?王藝臻，E-mail：wang23pharmacy@aliyun.com

引用信息?賈菲，朱藝欣，王藝臻.氯吡格雷通過CaMKKβ/AMPK/Nrf2通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2023，21（2）：265-271.

炎癥在心血管疾病病人中很常見，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展中起重要作用［1］?；钚匝酰╮eactive oxygen，ROS）在炎癥中起重要作用，可導(dǎo)致內(nèi)皮氧化損傷和心血管系統(tǒng)功能障礙。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，能夠刺激ROS的釋放。血管炎癥和 ROS會(huì)啟動(dòng)血管內(nèi)皮功能障礙，這也是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的根本機(jī)制［2-3］。白細(xì)胞和內(nèi)皮之間的復(fù)雜相互作用參與炎癥反應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）表面相對光滑且不黏附。在心血管疾病中，ECs和血液成分之間的相互作用被黏附分子例如血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）改變。研究表明，促炎分子TNF-α能夠誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子如VCAM-1表達(dá)，在動(dòng)脈粥樣硬化慢性炎癥過程中具有關(guān)鍵作用［4］。血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是誘導(dǎo)型血紅素氧合酶，具有抗氧化特性［5-6］。此外，HO-1衍生的一氧化碳（CO）參與血管調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。一些信號(hào)分子例如5′單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）以及轉(zhuǎn)錄因子如核因子-E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroidderived 2-like 2，Nrf2），調(diào)節(jié)HO-1基因的表達(dá)［7-10］。氯吡格雷（clopidogrel，INN）是一種可阻止血液凝塊的口服抗血小板藥物，具有抗炎、抗氧化和抗動(dòng)脈粥樣硬化多種生物學(xué)特性。抗炎和抗氧化可作為預(yù)防或治療心血管疾病的策略。本研究旨在闡明AMPK和HO-1在INN抑制TNF-α刺激的VCAM-1表達(dá)中的作用及其潛在的機(jī)制。

1?資料與方法

1.1?試劑與細(xì)胞培養(yǎng)?培養(yǎng)基199、慶大霉素、谷氨酰胺、膠原酶、明膠、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）、青霉素和鏈霉素均購自Sigma。胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基購自HyClone。HL-60細(xì)胞、人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。人TNF-α、二甲基亞砜（DMSO）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、碳酸氫鈉、化合物C和所有其他化學(xué)品均購自Sigma。通過將INN（Plavix公司）儲(chǔ)備溶液（10 mmol/L）溶解在DMSO中來制備。 TRIzol RNA提取試劑和2，7-二氯熒光素二乙酸酯（H2DCFDA）購自Invitrogen。各抗體購自Abcam。人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在37 ℃的199培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中添加了20 mmol/L HEPES、2 mmol/L谷氨酰胺、20%FBS、100 mU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素。每48 h刷新1次培養(yǎng)基，直到融合為止。在HEPES-人血清蛋白（HSA）緩沖液（10 mmol/L HEPES、10 mmol/L葡萄糖、1.5 mmol/L CaCl2、145 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgSO4和0.25%HSA）中進(jìn)行抑制劑預(yù)孵育。將化合物C和STO-609溶解在DMSO中。

1.2?蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）?ECs在裂解緩沖液中裂解，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離等量的蛋白質(zhì)樣品，各取30 μg 蛋白上樣，恒壓進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，恒流半干轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，然后5%的封閉液室溫封閉2 h，與一抗（1∶1 000）［磷酸化-AMPK（p-AMPK）、AMPK、HO-1、Nrf2、多聚ADP核糖多聚糖（PARP）和β-actin］4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育2 h，以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像儀上獲取圖像并分析。

1.3?mRNA的提取與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測mRNA表達(dá)?根據(jù)說明書用Trizol試劑盒（天根生物化學(xué)科技有限公司）提取總RNA。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光PCR引物，β-actin正向引物：5′-ATGTTTGAGACCTTCAACAC-3′，反向引物：5′-CACGTCACACTTCATGATGG-3′；VCAM-1正向引物：5′-CGTCTTGGTCAGCCCTTCCT-3′，反向引物：5′-ACATTCATATACTCCCGCATCCTTC-3′；HO-1正向引物：5′-GGGTGATAGAAGAGGCCAAGA3′，反向引物：5′-AGCTCCTGCAACTCCTCAAA-3′。 通過PCR擴(kuò)增cDNA（1 μL）Mini OpticonTM實(shí)時(shí)PCR中的溶液（25 μL）檢測系統(tǒng)。 循環(huán)參數(shù)設(shè)置為95 ℃、15 min，95 ℃持續(xù)15 s，58 ℃、1 min和72 ℃、1 min，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)公式2－△△CT計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.4?HO-1活性測定?ECs裂解物中的HO-1活性計(jì)算為每小時(shí)每毫克總蛋白產(chǎn)生的皮摩爾膽紅素，數(shù)據(jù)表示為與對照細(xì)胞相比HO-1活性的倍數(shù)。

1.5?亞細(xì)胞分級(jí)分離?根據(jù)說明書，使用亞細(xì)胞蛋白分級(jí)分離試劑盒（Thermo Fisher Scientific Inc.）進(jìn)行亞細(xì)胞分離。 通過Western Blotting分析測量核級(jí)分中的Nrf2蛋白水平。 PARP的表達(dá)被用作核提取物純度的上樣對照。

1.6?shRNA的RNA干擾?選擇和靶向人Nrf2和HO-1 mRNA的兩個(gè)不同序列，并從Sigma（美國密蘇里州圣路易斯）獲得。shRNA序列如下：Nrf2 shRNA ＃1，5′-GCTCCTACTGTGATGTGAAAT-3′，shRNA ＃2，5′-CCGGCATTTCACTAAACACAA-3′； HO-1 shRNA ＃1，5′-GCTGAGTTCATGAGGAACTTT-3′，shRNA ＃2，5′-GCTGAGTTCATGAGGAACTTT-3′；shLuc shRNA，5′-CAAATCACAGAATCGTCGTAT-3′。shLuc用作載體對照。

1.7?ROS測量?如前所述，用細(xì)胞滲透性H2DCFDA測定細(xì)胞內(nèi)ROS狀態(tài)。 將人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）融合至50%融合度，然后在199培養(yǎng)基中補(bǔ)充0.5%（v/v）FBS的血清中饑餓24 h。將ECs置于不含酚紅的無血清培養(yǎng)基中保持15 min，然后再暴露于TNF-α。ECs與H2DCFDA（10 μmol/L）孵育10 min，并在共聚焦顯微鏡下立即觀察。

1.8?細(xì)胞谷胱甘肽（GSH）分析?將ECs用冰冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌2次。在磷酸鉀緩沖液（20 mmol/L，pH 7.0）中制備勻漿，并在10 000×g下于4 ℃離心20 min。保留上清液作為細(xì)胞裂解物。用二辛可寧酸（BCA）蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)。將細(xì)胞裂解液（100 μL）與5%TCA（150 μL）一起孵育，并在5 000×g下于4 ℃離心10 min。將細(xì)胞裂解物與0.4 mol/L Tris緩沖液和0.01 mol/L 二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）一起孵育。在室溫下孵育5 min后，用酶標(biāo)儀在412 nm（680型，Bio-Rad）上測量細(xì)胞內(nèi)GSH的含量。

1.9?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理?符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析和Fisher′s 確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)?果

2.1?INN對TNF-α誘導(dǎo)的HAECs ROS形成的影響?ECs用10 μmol/L INN預(yù)處理24 h或1 mmol/L N-乙酰半胱氨酸（NAC）預(yù)處理2 h，并用10 mmol/L H2DCFDA處理15 min，然后再用TNF-α（1 ng/mL）處理20 min。0.1%DMSO孵育24 h的細(xì)胞用作對照（CON）。NAC是有效的抗氧化劑，用作陽性對照。結(jié)果顯示，TNF-α在20 min時(shí)促進(jìn)ROS釋放，而用INN預(yù)處理可顯著抑制ROS釋放。詳見圖1。

2.2?INN增強(qiáng)HO-1表達(dá)與活性，并阻礙TNF-α刺激的HL-60黏附?將HAECs與INN孵育不同的時(shí)間，結(jié)果顯示，INN處理可以在時(shí)間上促進(jìn)HO-1在mRNA和蛋白質(zhì)水平及其活性上的表達(dá)（見圖2）。 此外，HO-1 shRNA敲低研究確定了HO-1在INN抑制HL-60黏附中的作用。 將shHO-1轉(zhuǎn)染HAECs，然后與INN一起孵育24 h，然后用TNF-α刺激HAECs再保持6 h。 通過Western Blotting證實(shí)了HO-1的敲低（見圖3A）。shHO-1減輕了INN對HL-60黏附的抑制作用，即INN可通過HO-1抑制TNF-α刺激的HL-60黏附（見圖3B）。2.3?鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶β（CaMKKβ）/AMPK通路介導(dǎo)INN誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)?將ECs與INN孵育不同的時(shí)間，AMPK被INN激活（見圖4）。但是，INN不會(huì)改變AMPK蛋白的表達(dá)。為了進(jìn)一步證實(shí)CaMKKβ/AMPK通路的作用，使用了它們的特異性抑制劑STO-609和化合物C。STO-609和化合物C減弱了INN觸發(fā)的HO-1的表達(dá)和活性（見圖5）。STO-609和化合物C抑制了INN刺激的細(xì)胞中GSH含量的升高（見圖6）。證明INN通過CaMKKβ/AMPK通路誘導(dǎo)HO-1表達(dá)并增加GSH的合成。2.4?Nrf2被INN激活并與HO-1誘導(dǎo)有關(guān)?為了闡明CaMKKβ/AMPK的下游信號(hào)通路對INN刺激HO-1的作用，研究了Nrf2核易位。將ECs與INN孵育指定的時(shí)間。Nrf2核易位最早在8 h后就增加了，并一直持續(xù)到INN處理后24 h為止（見圖7A）。此外，Nrf2核易位在用AMPK抑制劑化合物C預(yù)處理1 h的ECs中受到抑制，然后用INN刺激。結(jié)果顯示，CaMKKβ/AMPK途徑與INN刺激的Nrf2核易位有關(guān)。為了進(jìn)一步確定Nrf2在INN刺激的HO-1表達(dá)中的作用，用shNrf2和shLuc轉(zhuǎn)染ECs。Nrf2的敲除消除了INN誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)，表明Nrf2是負(fù)責(zé)INN刺激HO-1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子（見圖7B、7C）。2.5?AMPK和Nrf2參與INN抑制TNF-α刺激ECs中VCAM-1的表達(dá)和單核細(xì)胞黏附?接下來，本研究試圖確定INN是否阻礙TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)。 TNF-α顯著增加了VCAM-1表達(dá)和HL-60細(xì)胞黏附。INN處理可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1 mRNA和蛋白水平表達(dá)以及HL-60細(xì)胞的黏附。為了進(jìn)一步確定AMPK和Nrf2在TNF-α刺激的VCAM-1表達(dá)中的作用，本研究用化合物C抑制AMPK和shNrf2來敲低Nrf2表達(dá)。 化合物C和shNrf2消除了TNF-α觸發(fā)的VCAM-1表達(dá)和HL-60細(xì)胞黏附。詳見圖8。表明AMPK和Nrf2介導(dǎo)INN抑制TNF-α刺激的ECs VCAM-1表達(dá)和單核細(xì)胞黏附。

［A：將裂解液等分試樣（50 μg）進(jìn)行HO-1蛋白表達(dá)的Western Blotting分析；B：從ECs中提取總RNA，并使用HO-1和β-actin的特異性引物進(jìn)行RT-qPCR；C：如方法中所述，在每個(gè)治療組中測量HO-1 活性3次。數(shù)據(jù)表示為HO-1活性相對于對照的增加倍數(shù)；D：將轉(zhuǎn)染shHO-1的ECs與10 μmol/L INN孵育24 h，然后再用1 ng/mL TNF-α刺激6 h；E：在有或沒有INN的情況下，將ECs與1 ng/mL TNF-α孵育8 h，進(jìn)行黏附測定］

與對照相比，＊ P＜0.05；與INN相比，＃P＜0.05。

［A：對總蛋白進(jìn)行p-AMPK和AMPK表達(dá)的Western Blotting分析；B：ECs用10 μmol/L STO-609和化合物C處理1 h，然后與10 μmol/L INN一起孵育16 h。 對細(xì)胞裂解物的等分試樣進(jìn)行HO-1表達(dá)的免疫印跡分析； C：提取總RNA，并用HO-1和β-actin的特異性引物進(jìn)行RT-PCR；D：如方法中所述，在每個(gè)治療組中測量HO-1活性3次。 數(shù)據(jù)表示為HO-1活性相對于對照的增加倍數(shù)；E：ECs用10 μmol/L STO-609和化合物C處理1 h，然后與10 μmol/L INN一起孵育24 h。 如方法所述檢測GSH含量］

與對照相比，＊ P＜0.05；與INN相比，＃ P＜0.05（24 h）與INN/shLuc相比，＃ P＜0.05。

［A：ECs用10 μmol/L化合物C處理1 h，然后與10 μmol/L INN孵育指定的時(shí)間。細(xì)胞裂解物的等分試樣進(jìn)行了免疫印跡分析。B：用shLuc或shNrf2轉(zhuǎn)染ECs，然后用10 μmol/L INN處理16 h。細(xì)胞裂解物的等分試樣進(jìn)行了免疫印跡分析；C：從ECs中提取總RNA，并通過RT-PCR及其特異引物將其用于分析HO-1和β-actin mRNA］

與對照比較，＊ P＜0.05；與TNF-α比較，＃ ?P＜0.05；與TNF-α/INN 比較，△P＜0.05；（n＝3）。

［A：用1 ng/mL TNF-α處理ECs，使用或不使用DMSO（空白載體），INN，或INN＋化合物C進(jìn)行VCAM-1、p-AMPK和AMPK表達(dá)測量。D：在有或沒有INN的情況下，將用shLuc或shNrf2轉(zhuǎn)染的ECs與1 ng/mL TNF-α孵育8 h，以測量VCAM-1表達(dá)；細(xì)胞裂解物的等分試樣進(jìn)行了免疫印跡分析。B、E：提取總RNA，并用針對VCAM-1的特異性引物進(jìn)行RT-PCR。 C、F：如方法中所述進(jìn)行黏附測定］

3?討?論

INN是一種口服抗血小板藥物，用于阻止冠狀動(dòng)脈疾?。–AD）中的血塊形成［11］。研究表明，INN具有抗炎和抗氧化的作用［12］，可刺激HO-1的表達(dá)［13］，通過獨(dú)立于其抗血小板活性的機(jī)制來維持內(nèi)皮功能［14］。INN可抑制血小板的異常聚集，在糖尿病治療過程中，有降低血小板活性、促進(jìn)神經(jīng)功能早期恢復(fù)的作用［15］。INN的作用是改善2型糖尿病病人的血管功能，抵抗氧化應(yīng)激并抑制細(xì)胞凋亡，這涉及磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）和p-AMPK的表達(dá)增加。本研究揭示了INN抑制TNF-α刺激的ROS釋放、VCAM-1表達(dá)和細(xì)胞黏附，并且這種作用與通過CaMKKβ/AMPK/Nrf2途徑增加HO-1表達(dá)和GSH含量有關(guān)。

TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子［4］，由多種先天免疫細(xì)胞包括活化的巨噬細(xì)胞以及嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞分泌。在某些病理情況下，例如腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等，血漿中TNF-α的水平會(huì)升高。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以增加ROS的產(chǎn)生、VCAM-1的表達(dá)和細(xì)胞黏附，而INN消除了TNF-α的這些作用。

動(dòng)脈粥樣硬化的早期發(fā)生是內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致幾種代償反應(yīng)改變了血管的動(dòng)態(tài)平衡。諸如肥胖、高膽固醇血癥和高血糖的飲食之類的促炎刺激會(huì)引起黏附分子表達(dá)，例如VCAM-1在內(nèi)皮中的表達(dá)，這些分子有助于單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的附著。VCAM-1的過表達(dá)增強(qiáng)單核細(xì)胞向內(nèi)皮損傷部位的募集；白細(xì)胞成功釋放單核細(xì)胞趨化蛋白-1，通過募集其他白細(xì)胞，刺激培養(yǎng)基中的白細(xì)胞并啟動(dòng)平滑肌細(xì)胞的募集和增殖來放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本研究證明INN抑制VCAM-1表達(dá)，降低了HL-60細(xì)胞對TNF-α刺激的ECs的黏附。然而，AMPK抑制劑化合物C、shHO-1和shNrf2消除了這種抑制作用。這些數(shù)據(jù)證明了AMPK、Nrf2和HO-1對INN抑制HL-60細(xì)胞黏附的貢獻(xiàn)。

HO-1是一種壓力誘導(dǎo)酶［6］，可預(yù)防許多慢性疾病，例如心血管疾病、高血壓、糖尿病。Nrf2是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子［16-17］，與細(xì)胞的抗炎作用有關(guān)。Nrf2/HO-1信號(hào)通路具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用［18］。Nrf2 是保護(hù)細(xì)胞抗氧化和炎性損傷信號(hào)通路的關(guān)鍵協(xié)調(diào)者，HO-1 是受其調(diào)控的抗氧化應(yīng)激和抗炎癥反應(yīng)的重要基因［16］。本研究中，INN增強(qiáng)了Nrf2的核易位，而沉默Nrf2消除了INN誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)，表明Nrf2對于INN誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)是必不可少的。Nrf2激活受幾種激酶控制，包括c-Jun氨基端激酶（JNK）、p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt等。本研究證明了INN可以激活CaMKKβ和AMPK。通過使用CaMKKβ和AMPK的特異性抑制劑，揭示了CaMKKβ/AMPK途徑與INN觸發(fā)的HO-1誘導(dǎo)有關(guān)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)INN通過CaMKKβ/AMPK/Nrf2通路上調(diào)HO-1表達(dá)、升高GSH水平來阻礙TNF-α誘導(dǎo)的ROS形成、VCAM-1表達(dá)和HL-60細(xì)胞黏附。INN的抗氧化和抗炎特性可預(yù)防由氧化應(yīng)激引起的疾病，包括動(dòng)脈硬化。

參考文獻(xiàn)：

［1］?周振鋒，馬愛軍，潘旭東.炎癥和自噬及泛素化對動(dòng)脈粥樣硬化的作用［J］.中華老年心腦血管病雜志，2019，21（11）：1211-1213.

［2］?郭建恩，高飛，胡亞濤，等.瓜蔞薤白半夏湯對動(dòng)脈粥樣硬化小鼠炎癥因子、ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的影響［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版），2017，38（3）：234-239.

［3］?王新，孫蓓，劉芳，等.間歇低氧下小鼠血管內(nèi)皮功能障礙機(jī)制的研究［J］.天津醫(yī)藥，2017，45（2）：160-163.

［4］?JIA Z Q，NALLASAMY P，LIU D M，et al.Luteolin protects against vascular inflammation in mice and TNF-alpha-induced monocyte adhesion to endothelial cells via suppressing IκBα/NF-κB signaling pathway［J］.The Journal of Nutritional Biochemistry，2015，26（3）：293-302.

［5］?孫東，宋紅麗，沈中陽.血紅素加氧酶1修飾MSCs的相關(guān)研究進(jìn)展［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2019，33（7）：901-906.

［6］?WANG F，XIAO M，LIN X J，et al.Expression of heme oxygenase-1 and leukemia inhibitory factor in maternal plasma and placental tissue in a lipopolysaccharide-induced late pregnancy preterm birth mouse model［J］.The Journal of Reproductive Medicine，2016，61（1/2）：39-46.

［7］?葉海瓊，傅曉冬，鐘華.激活A(yù)MPK對妊娠高血壓大鼠HO-1水平、血壓和尿蛋白的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2019，48（2）：217-220.

［8］?WEI C Y，SUN H L，YANG M L，et al.Protective effect of wogonin on endotoxin-induced acute lung injury via reduction of p38 MAPK and JNK phosphorylation［J］.Environmental Toxicology，2017，32（2）：397-403.

［9］?YANG J，SUNG J，KIM Y，et al.Inhibitory effects of butein on adipogenesis through upregulation of the Nrf2/HO-1 pathway in 3T3-L1 adipocytes［J］.Preventive Nutrition and Food Science，2017，22（4）：306-311.

［10］?延光海，孫天一，咸哲民，等.朝醫(yī)麻黃定喘湯對支氣管哮喘模型小鼠p38MAPK/Nrf2/HO-1信號(hào)通路的影響［J］.中醫(yī)雜志，2019，60（10）：881-886.

［11］?HONG K S，LEE S H，KIM E G，et al.Recurrent ischemic lesions after acute atherothrombotic stroke：clopidogrel plus aspirin versus aspirin alone［J］.Stroke，2016，47（9）：2323-2330.

［12］?劉忠明，劉志陽.替格瑞洛與氯吡格雷對ST段抬高急性心肌梗死患者PCI術(shù)后炎癥因子和預(yù)后的影響［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2019，40（6）：1013-1016.

［13］?沈欽龍，孫金鑫，夏海艷.苦蝶子注射液聯(lián)合氯吡格雷治療急性腦梗死的臨床研究［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2019，34（1）：31-35.

［14］?PAN Y S，JING J，CHEN W Q，et al.Risks and benefits of clopidogrel-aspirin in minor stroke or TIA：time course analysis of CHANCE［J］.Neurology，2017，88（20）：1906-1911.

［15］?王珊珊.氯吡格雷對急性腦梗死合并糖尿病患者療效及血清血管活性因子、血小板活化參數(shù)的影響［J］.山東醫(yī)藥，2019，59（17）：51-53.

［16］?閆焱.N-乙酰半胱氨酸對術(shù)后認(rèn)知功能障礙模型小鼠認(rèn)知功能及核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1信號(hào)通路的影響［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2019，41（4）：529-535.

［17］?GASPARRINI M，AFRIN S，F(xiàn)ORBES-HERNNDEZ T Y，et al.Protective effects of Manuka honey on LPS-treated RAW 264.7 macrophages.Part 2：control of oxidative stress induced damage，increase of antioxidant enzyme activities and attenuation of inflammation［J］.Food and Chemical Toxicology，2018，120：578-587.

［18］?莫澤緯，王斐，魏偉平，等.艾塞那肽對胰島素抵抗大鼠的腎損傷和核因子相關(guān)因子2/血紅素加氧酶通路的影響［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2019，35（14）：1474-1478.

（收稿日期：2020-12-22）

（本文編輯王麗）