蘆瑞霞，林文勇，靳琪鵬，王肖龍

摘要目的：研究靈寶護(hù)心丹改善動(dòng)脈粥樣硬化的療效和潛在作用機(jī)制。方法：C57BL/6小鼠喂以正常飲食，載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠喂養(yǎng)高脂飲食誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型，12周后隨機(jī)分為模型組、靈寶護(hù)心丹低劑量組、靈寶護(hù)心丹中劑量組、靈寶護(hù)心丹高劑量組和他汀組。給予藥物8周后，檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平；通過(guò)油紅O染色、Masson染色、蘇木素-伊紅（HE）染色觀(guān)察主動(dòng)脈根部的病理變化。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析靈寶護(hù)心丹減輕動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。結(jié)果：與模型組相比，靈寶護(hù)心丹組的斑塊及TC、TG、LDL-C水平明顯降低，斑塊的膠原面積明顯增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果顯示，靈寶護(hù)心丹組和模型組相比篩選出733個(gè)差異基因，富集到的通路包括脂肪酸生物合成、膠原蛋白形成、炎癥信號(hào)通路等。結(jié)論：靈寶護(hù)心丹對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有顯著改善作用，機(jī)制可能涉及脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路。

關(guān)鍵詞動(dòng)脈粥樣硬化；靈寶護(hù)心丹；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；血脂；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.008

Transcriptomic Mechanism of Lingbao Huxin Pill for the Treatment of Atherosclerosis

LU Ruixia， LIN Wenyong， JIN Qipeng， WANG Xiaolong

Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

Corresponding AuthorWANG Xiaolong， E-mail： wxlqy0214@163.com

AbstractObjective：To study the therapeutic effect and potential mechanism of Lingbao Huxin? Pill? in improving atherosclerosis.Methods：C57BL/6 mice were fed with normal diet，and apolipoprotein E gene knockout（ApoE-/-） mice were fed with high-fat diet to induce the atherosclerosis model.After 12 weeks，the mice were randomly divided into model group，Lingbao Huxin Pill? low-dose group，Lingbao Huxin Pill medium-dose group，Lingbao Huxin? Pill? high-dose group and statin group.After 8 weeks of administration，the levels of serum total cholesterol（TC），triglyceride（TG），low density lipoprotein cholesterol（LDL-C） and high density lipoprotein cholesterol（HDL-C） were detected.The pathological changes of aortic root were detected by oil red O staining，Masson staining and hematoxylin-eosin（HE） staining.The mechanism of alleviating atherosclerosis of Lingbao Huxin Pill? was analyzed by transcriptomic sequencing.Result：Compared with model group，the levels of plaque，TC，TG and LDL-C in the Lingbao Huxin? Pill? groups significantly decreased，the collagen area of plaque was significantly cells increased，and inflammatory infiltration was decreased.Transcriptomic sequencing results showed that compared with the model group，733 differential genes were screened out in the Lingbao Huxin? Pill? groups and the pathways enriched included fatty acid biosynthesis，collagen formation，and inflammation signaling pathways.Conclusion：Lingbao Huxin Pill? could significantly improve atherosclerosis，and the mechanism might involve the key pathways of lipid metabolism and inflammatory response.

Keywordsatherosclerosis; Lingbao Huxin Pill; transcriptomics; lipids; experimental study

JAMA Cardiology雜志2019年發(fā)表了中國(guó)心血管疾病負(fù)擔(dān)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，心血管疾病導(dǎo)致的死亡人數(shù)從1990年的251萬(wàn)人增加到2016年的397萬(wàn)人，缺血性心臟疾病是心血管疾病死亡的前三大原因之一，死亡率增長(zhǎng)了184.1%［1］。根據(jù)2021年發(fā)表在Nature雜志的評(píng)論［2］，動(dòng)脈粥樣硬化現(xiàn)已成為全球性的挑戰(zhàn)，其普遍性和越發(fā)年輕化的趨勢(shì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病成為全球死亡原因的主要貢獻(xiàn)者。盡管目前的治療策略在控制低密度脂蛋白、血壓以及其他傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素方面取得了顯著成效，但動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的殘余風(fēng)險(xiǎn)仍然顯著。因此，迫切需要推動(dòng)其綜合管理策略的發(fā)展，并致力于開(kāi)發(fā)新的治療手段以減輕其對(duì)公共健康的負(fù)擔(dān)。

靈寶護(hù)心丹由人工麝香、蟾酥、人工牛黃、冰片、紅參、三七、琥珀、丹參和蘇合香共9味中藥組成，收錄在《中華人民共和國(guó)藥典》［3］，臨床研究已證實(shí)其在治療冠心病等方面療效明顯［4］。本課題組前期研究顯示，靈寶護(hù)心丹的臨床療效較顯著，具有改善血脂的功效。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎(chǔ)，但是關(guān)于靈寶護(hù)心丹減輕動(dòng)脈粥樣硬化的具體作用機(jī)制，目前的研究證據(jù)還不充足。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)在揭示中藥治療疾病的分子機(jī)制方面發(fā)揮著重要作用。通過(guò)精確測(cè)定疾病狀態(tài)下的基因表達(dá)水平，能夠定位中藥治療過(guò)程中調(diào)控發(fā)生變化的關(guān)鍵基因和生物通路，獲得深入的生物學(xué)見(jiàn)解［5］。王瑩等［6］的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，毛冬青三萜皂苷緩解脂多糖引發(fā)的小鼠腸道損傷可能與調(diào)節(jié)腸道IgA免疫及TRP通道的炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此，本研究旨在運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序技術(shù)，篩選出關(guān)鍵基因和調(diào)控途徑，深化對(duì)靈寶護(hù)心丹改善動(dòng)脈粥樣硬化分子機(jī)制的理解。

1材料與方法

1.1動(dòng)物

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)野生型C57BL/6小鼠5只，基于C57BL/6小鼠背景進(jìn)行載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）的小鼠25只，體質(zhì)量19～23 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物在上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2020-0009。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，濕度40%～60%，環(huán)境溫度20～25 ℃，自由飲食，每日12 h光照維持，晝夜循環(huán)。

1.2藥品與試劑

靈寶護(hù)心丹（國(guó)藥準(zhǔn)字Z32021181）購(gòu)自蘇州雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司；阿托伐他汀鈣片（立普妥，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130129）購(gòu)自美國(guó)輝瑞公司；無(wú)水乙醇、二甲苯、中性樹(shù)膠、異丙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；環(huán)保型脫蠟液、通用型組織固定液、蘇木素-伊紅（HE）染液套裝、Masson染液套裝、分化液、油紅染液均購(gòu)自Servicebio公司。

1.3儀器

NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）；VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep試劑盒；Pannoramic MIDI組織切片數(shù)字掃描儀（3DHISTECH）；Chemray 240全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科技有限公司）；Donatello脫水機(jī)（DIAPATH）；JB-P5包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；GFL-230烤箱（天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司）；CRYOSTAR NX50冰凍切片機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）；NIKON ECLIPSE E100正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康）。

1.4動(dòng)物分組與給藥

ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)12周后，隨機(jī)分為模型組、靈寶護(hù)心丹低劑量組［4.68 mg/（kg·d）］、靈寶護(hù)心丹中劑量組［9.36 mg/（kg·d）］、靈寶護(hù)心丹高劑量組［18.72 mg/（kg·d）］和他汀組［2.4 mg/（kg·d）］，每組5只，連續(xù)8周，給藥同時(shí)維持高脂飲食。另外，將C57BL/6小鼠5只作為空白組，普通飼料喂養(yǎng)20周。模型組和空白組給予等體積生理鹽水。

1.5血脂檢測(cè)

第20周末，小鼠眼球取血，室溫靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.6主動(dòng)脈根部病理染色

將小鼠四肢固定于操作板上，打開(kāi)胸腔和腹腔，剪右心房，灌流針插入心尖，灌流磷酸緩沖鹽溶液，直至肝臟顏色變淺、肺組織變白后結(jié)束。將小鼠心臟置于4%多聚甲醛固定24 h，最佳切割溫度化合物（optimal cutting temperature compound，OCT）冰凍包埋，固定于冰凍過(guò)切片機(jī)，以8～10 μm的厚度進(jìn)行切片，進(jìn)行油紅O染色、HE染色和Masson染色。用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察切片，并使用成像系統(tǒng)拍照，用Image J軟件對(duì)斑塊面積進(jìn)行測(cè)量。

1.7轉(zhuǎn)錄組學(xué)文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序

為了研究靈寶護(hù)心丹對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響，從空白組、模型組及靈寶護(hù)心丹最佳劑量組小鼠各隨機(jī)選取3只，收集主動(dòng)脈組織樣本，并委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行核糖核酸（RNA）提取及轉(zhuǎn)錄組學(xué)序列分析。通過(guò)QIAGEN RNeasy Lipid Tissue Mini Kit 從主動(dòng)脈組織樣本中提取總RNA，使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)鑒定RNA純度和定量，使用Agilent 2100 Bioanalyzer評(píng)估RNA完整性。依據(jù)VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep試劑盒說(shuō)明書(shū)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。采用 llumina Novaseq 6000 測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，并生成150 bp 雙端讀段（reads）。采用fastp軟件［7］對(duì) fastq格式的原始測(cè)序序列進(jìn)行處理，從3′端及5′端去除低質(zhì)量測(cè)序序列后進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。使用 HISAT2軟件［8］進(jìn)行參考基因組比對(duì)，并進(jìn)行基因表達(dá)量計(jì)算，再通過(guò)HTSeq-count［9］獲得每個(gè)基因的測(cè)序序列計(jì)數(shù)。使用每百萬(wàn)片段數(shù)每千堿基外顯子的片段數(shù)（fragments per kb per million reads，F(xiàn)PKM）法估算基因表達(dá)水平。

1.8轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

利用DESeq2［10］軟件對(duì)所有樣本基因的數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算差異倍數(shù)，并采用負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方式進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，首先對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行P值計(jì)算，再用假發(fā)現(xiàn)率錯(cuò)誤控制法對(duì)P值作多重假設(shè)檢驗(yàn)矯正得到q值，最終將q＜0.05且差異倍數(shù)大于2的基因定義為差異表達(dá)基因（DEGs）。

基于超幾何分布算法對(duì)靈寶護(hù)心丹組和模型組的DEGs進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）［11］、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）［12］、Reactome［13］和 WikiPathways［14］富集分析。其中GO富集分析包含生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function，MF）。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism（版本9.4.1）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）進(jìn)行多組間比較；采用Tukey多重比較測(cè)試作為后續(xù)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1靈寶護(hù)心丹對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊的影響

空白組小鼠的主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)分界清晰，內(nèi)皮層完整，細(xì)胞排列規(guī)整，核染色均勻，沒(méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或其他病理改變，內(nèi)皮下區(qū)域未見(jiàn)明顯的脂質(zhì)積累，膠原纖維分布正常。模型組小鼠的主動(dòng)脈竇內(nèi)皮下可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和泡沫細(xì)胞堆積，細(xì)胞排列不規(guī)整，斑塊區(qū)域內(nèi)膠原纖維增加。與模型組相比，靈寶護(hù)心丹中劑量組、靈寶護(hù)心丹高劑量組和他汀組的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)，泡沫細(xì)胞減少，斑塊區(qū)域脂質(zhì)沉積明顯減少，膠原纖維含量在斑塊區(qū)域增加。表明靈寶護(hù)心丹可以減緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，減少炎癥細(xì)胞和泡沫細(xì)胞浸潤(rùn)，有助于斑塊穩(wěn)定，改善病理狀態(tài)。詳見(jiàn)圖1。

2.2靈寶護(hù)心丹對(duì)ApoE-/-小鼠血清脂質(zhì)水平的調(diào)節(jié)作用

與空白組相比，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平均顯著升高。與模型組相比，靈寶護(hù)心丹在不同劑量下TC、TG和LDL-C水平均有效降低，但靈寶護(hù)心丹低劑量組改善程度較弱，靈寶護(hù)心丹中劑量組和高劑量組的降脂效果與他汀組相似。靈寶護(hù)心丹低劑量不能明顯提升HDL-C水平，而靈寶護(hù)心丹中劑量和高劑量能夠提高HDL-C水平。說(shuō)明靈寶護(hù)心丹在調(diào)節(jié)血脂方面具有顯著的療效。詳見(jiàn)圖2。

2.3轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)的基因表達(dá)水平

根據(jù)靈寶護(hù)心丹不同劑量組小鼠血脂水平和主動(dòng)脈竇斑塊面積的研究結(jié)果顯示，靈寶護(hù)心丹中劑量組和高劑量組在改善動(dòng)脈粥樣硬化方面的效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？紤]到從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度評(píng)估療效與成本之間的關(guān)系，選取靈寶護(hù)心丹中劑量組為最佳劑量組進(jìn)行后續(xù)的機(jī)制研究是更為合理的選擇。在不影響治療效果的前提下，避免了不必要的藥物過(guò)量。所以從空白組、模型組和靈寶護(hù)心丹中劑量組各隨機(jī)選取了3個(gè)主動(dòng)脈組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析。質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果顯示（見(jiàn)表1），各樣本的有效數(shù)據(jù)量分布在5.97～7.01 G，測(cè)序質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到或超過(guò)30（Q30）的堿基分布在92.78%～92.98%，平均鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶（GC）含量為47.53%。通過(guò)將reads比對(duì)到參考基因組上，得到各樣本的基因組比對(duì)情況，比對(duì)率為97.75%～98.69%。這反映了測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組的高度一致性，為本研究提供了可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2.4DEGs分析

與空白組相比，模型組上調(diào)基因964個(gè)、下調(diào)基因337個(gè)，共有1 301個(gè)DEGs，說(shuō)明動(dòng)脈粥樣硬化疾病條件下會(huì)發(fā)生廣泛的基因表達(dá)變化。與模型組相比，靈寶護(hù)心丹組上調(diào)基因426個(gè)、下調(diào)基因307個(gè)，共有733個(gè)DEGs（見(jiàn)圖3）。其中靈寶護(hù)心丹回調(diào)了部分小鼠動(dòng)脈粥樣硬化后主動(dòng)脈組織的DEGs，說(shuō)明靈寶護(hù)心丹在一定程度上改善了模型組中誘發(fā)的基因表達(dá)異常［15］。詳見(jiàn)圖4。

2.5GO富集分析

模型組和空白組的DEGs富集的GO通路結(jié)果提示，MF過(guò)程包括細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、膠原蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合等；CC類(lèi)別包括細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外空間、細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜等；BP包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附、先天免疫反應(yīng)等。靈寶護(hù)心丹組和模型組的DEGs進(jìn)行的GO富集結(jié)果提示，MF包括鈣離子結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、蛋白質(zhì)結(jié)合；CC類(lèi)別包括細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)、肌漿網(wǎng)、突觸、基底膜等；BP過(guò)程包括肌節(jié)組織、心肌收縮、心率調(diào)節(jié)等。詳見(jiàn)圖5。

2.6KEGG富集分析

模型組和空白組的DEGs富集的KEGG通路包括趨化因子信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、膽固醇代謝、脂肪的消化和吸收、花生四烯酸代謝等；靈寶護(hù)心丹和模型組的DEGs富集的KEGG結(jié)果包括心肌收縮、檸檬酸循環(huán)、脂肪酸生物合成、丙氨酸代謝等通路。詳見(jiàn)圖6。

2.7Reactome 富集分析

模型組和空白組的DEG富集的Reactome通路包括細(xì)胞外基質(zhì)組織、先天免疫系統(tǒng)、中性粒細(xì)胞脫顆粒、膠原蛋白形成、彈性纖維形成、整合素細(xì)胞表面相互作用、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞外基質(zhì)的降解等生物過(guò)程。靈寶護(hù)心丹組和模型組的DEGs富集的Reactome通路包括膠原蛋白形成、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、脂肪酰輔酶A生物合成、膠原纖維的交聯(lián)等生物過(guò)程。詳見(jiàn)圖7。

2.8WikiPathways 富集分析

模型組和空白組的DEGs富集的WikiPathways通路包括補(bǔ)體激活、類(lèi)二十烷酸脂質(zhì)合成、氧化損傷反應(yīng)、炎癥反應(yīng)途徑等。靈寶護(hù)心丹組和模型組的DEGs富集的WikiPathways通路包括脂肪酸生物合成、氧化應(yīng)激反應(yīng)、心肌細(xì)胞中的鈣調(diào)節(jié)、心臟發(fā)育、炎癥反應(yīng)途徑等。詳見(jiàn)圖8。

3討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種以脂質(zhì)堆積和慢性炎癥為特征的動(dòng)脈疾病。本研究結(jié)果總體揭示了靈寶護(hù)心丹對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化方面的影響。通過(guò)對(duì)主動(dòng)脈竇油紅O染色、Masson染色、HE染色和血脂水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)靈寶護(hù)心丹不僅減少了斑塊區(qū)域的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和泡沫細(xì)胞堆積，增加斑塊內(nèi)膠原纖維面積，而且能夠降低血清TC、TG和LDL-C，同時(shí)提高HDL-C。增加的纖維帽厚度有助于防止斑塊破裂，從而減少心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)［16］。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果提示靈寶護(hù)心丹可以回調(diào)差異基因的水平，如腺苷三磷酸檸檬酸裂解酶（adenosine triphosphate citrate lyase，ACLY）、白細(xì)胞介素36γ（interleukin 36 gamma，IL-36γ）、神經(jīng)調(diào)節(jié)素1（neuregulin 1，NRG1）、鈣黏蛋白（calreticulin，CALR）等。IL-36γ通過(guò)磷酸肌醇3-激酶（PI3K）途徑特異性上調(diào)巨噬細(xì)胞清除率受體的表達(dá)，加重巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞的形成和動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展［17］。NRG1可調(diào)節(jié)心臟炎癥、氧化應(yīng)激、壞死凋亡等［18］。非凋亡調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡蛋白CALR可能在動(dòng)脈粥樣硬化的沉默進(jìn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并可能具有尚未開(kāi)發(fā)的治療潛力［19-20］。ACLY是他汀類(lèi)藥物靶點(diǎn)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3 hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR）上游的關(guān)鍵酶，連接碳水化合物和脂質(zhì)代謝，通過(guò)將檸檬酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，參與脂肪酸和膽固醇的生物合成［21］。

本研究結(jié)果顯示，靈寶護(hù)心丹組與模型組的差異基因在WikiPathways富集到的PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路和炎癥反應(yīng)途徑，在Reactome富集到的膠原蛋白生物合成和修飾酶、膠原蛋白形成、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、膠原蛋白降解通路，在KEGG富集到的低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號(hào)通路、脂肪酸延伸、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、不飽和脂肪酸的生物合成通路，在模型組與空白組差異基因富集的疾病通路中也存在，說(shuō)明靈寶護(hù)心丹可以通過(guò)調(diào)節(jié)這些途徑來(lái)發(fā)揮改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用。脂肪酸合成與動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)系復(fù)雜多變，不飽和脂肪酸在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用。他們不僅作為前列腺素、白三烯等生物活性分子的前體，而且作為磷脂的組成部分，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞過(guò)程，在動(dòng)脈粥樣硬化中的巨噬細(xì)胞功能中也扮演重要角色［22］。TGF-β信號(hào)通路是動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)血管炎癥的主要驅(qū)動(dòng)因素之一，通過(guò)促進(jìn)血管壁炎癥和血管通透性加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展［23］。PI3K-蛋白激酶B（AKT）通路能夠促進(jìn)動(dòng)脈血栓形成，抑制巨噬細(xì)胞排出，促進(jìn)脂質(zhì)沉積［24-26］。靈寶護(hù)心丹通過(guò)這些通路的調(diào)節(jié)可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療具有潛在的益處。

4小結(jié)

靈寶護(hù)心丹對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠模型的動(dòng)脈粥樣硬化具有顯著改善效果，包括減少主動(dòng)脈斑塊的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、降低血脂水平，并增加斑塊內(nèi)膠原纖維含量。通過(guò)對(duì)脂肪酸代謝途徑、炎癥反應(yīng)途徑和膠原纖維形成等相關(guān)通路的調(diào)節(jié)，靈寶護(hù)心丹展現(xiàn)了其潛在的治療動(dòng)脈粥樣硬化的可能性。這些發(fā)現(xiàn)為靈寶護(hù)心丹在心血管疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2023-12-01）

（本文編輯王雅潔）