陳艷俏，楊翠，陳少軍

摘要目的：分析特定microRNA在血瘀型急性非ST段抬高型心肌梗死病人血漿中的分布特點(diǎn)。方法：入選北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院心血管科2018年12月—2020年12月住院的40例中醫(yī)辨證為血瘀型病人，入院后診斷為急性非ST段抬高型心肌梗死者32例為觀察組，未診斷為急性非ST段抬高型心肌梗死病人8例為對(duì)照組，收集兩組病人血清肌鈣蛋白I（cTnI）、B型鈉尿肽（BNP）及左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）等資料，并對(duì)兩組病人血漿中特定microRNA進(jìn)行檢測(cè)分析比較。結(jié)果：與對(duì)照組相比，觀察組cTnI及BNP明顯升高，LVEF 低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組病人血漿miR-133 aRNA、miR-208 RNA、miR-1 RNA表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而觀察組病人血漿miR-21RNA與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：血漿miR-133a、miR-208、miR-1在血瘀型急性非ST段抬高型心肌梗死病人中表達(dá)水平顯著升高，其可能成為預(yù)測(cè)急性非ST段抬高型心肌梗死及輔助評(píng)估心功能的潛在指標(biāo)。

關(guān)鍵詞急性非ST段抬高型心肌梗死；血瘀型；血漿microRNA；血清肌鈣蛋白I；B型鈉尿肽；左室射血分?jǐn)?shù)

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.026

隨著生活方式及人口結(jié)構(gòu)的改變，急性心肌梗死發(fā)病率逐年升高，并有向低齡化發(fā)展的趨勢(shì)，因其致死率高、預(yù)后差，成為當(dāng)今人類健康的頭號(hào)殺手。急性非ST段抬高型心肌梗死（non ST-segment elevation myocardial infarction，NSTEMI）屬于非ST段抬高型急性冠脈綜合征的一種，最新版《2020年歐洲心臟病學(xué)會(huì)非ST段抬高型急性冠狀動(dòng)脈綜合征管理指南》［1］指出，胸痛癥狀、體征、心電圖、肌鈣蛋白檢測(cè)用于NSTEMI早期診斷，血漿腦鈉肽（BNP）或者N末端B型腦鈉肽前體（NT-proBNP）用于風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)后評(píng)估。同時(shí)，越來越多研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在急性心肌梗死的病理發(fā)生發(fā)展過程中起到關(guān)鍵作用，心肌梗死發(fā)生時(shí)，特定的microRNA能以穩(wěn)定的形式釋放至循環(huán)血液中，可能成為新型的生物標(biāo)志物而具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值［2-3］。本研究以血漿 microRNA 為切入點(diǎn)，觀察中醫(yī)辨證屬血瘀型非 ST 段抬高型心肌梗死病人發(fā)病階段特異性血漿microRNA的表達(dá)特征，初步探索了血漿microRNA對(duì)血瘀型NSTEMI的診斷價(jià)值。

1資料與方法

1.1臨床資料

選擇2018年12月—2020年12月入住北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院心血管科的32例辨證屬血瘀證的NSTEMI病人為觀察組，8例中醫(yī)辨證屬血瘀證的未診斷為NSTEMI病人為對(duì)照組。觀察組，男20例，女12例，年齡37～79（63.59±10.18歲）；對(duì)照組，男5例，女3例，年齡37～74（57.63±11.99）歲。兩組病人均患有高脂血癥，觀察組與對(duì)照組年齡、性別、合并基礎(chǔ)病等基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。詳見表1。所有參與研究病人均按照相關(guān)指南獲得相應(yīng)干預(yù)及對(duì)癥治療。本研究已獲得北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與研究的病人或病人家屬均對(duì)本研究?jī)?nèi)容充分知情，并簽署了知情同意書。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1NSTEMI診斷標(biāo)準(zhǔn)

參考 2018 年第4版心肌梗死全球統(tǒng)一定義［4-5］制定。血清心肌標(biāo)志物（主要是肌鈣蛋白）升高，并至少伴有以下一項(xiàng)臨床指標(biāo)：1）缺血癥狀；2）新發(fā)生的缺血性心電圖改變（新的ST-T改變或左束支傳導(dǎo)阻滯）；3）心電圖病理性Q波形成；4）影像學(xué)證據(jù)顯示有新的心肌活性喪失或新發(fā)的局部室壁運(yùn)動(dòng)異常；5）冠狀動(dòng)脈造影或尸檢證實(shí)冠狀動(dòng)脈內(nèi)有血栓。結(jié)合心電圖ST-T改變，除外急性ST段抬高型心肌梗死。

1.2.2血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)

參考 2018 年《急性心肌梗死中西醫(yī)結(jié)合診療指南》［6］制定標(biāo)準(zhǔn)。氣虛血瘀：胸部刺痛、悶滯，活動(dòng)后加重，可伴身體乏力，氣短，出汗，心悸，查體可有四肢肌膚瘀斑或甲錯(cuò)，舌質(zhì)暗淡或有瘀點(diǎn)瘀斑，舌苔薄白，脈虛無力或弦細(xì)無力。氣滯血瘀：心胸滿悶，刺痛陣發(fā)，痛有定處，常欲嘆息，情志不遂時(shí)易誘發(fā)或加重，查體可見面色黧黑，唇甲青紫，皮膚出現(xiàn)瘀斑，舌質(zhì)紫暗，可見紫點(diǎn)或紫斑，舌底靜脈曲張，舌苔薄，脈弦澀。痰阻血瘀：劇烈胸痛，胸悶如窒，氣短，形體沉重肥胖，咳嗽痰多，納呆惡心，可伴頭昏目眩，腦脹，舌紫暗或暗紅，可有瘀斑，舌下瘀筋，舌苔厚膩，脈滑或澀。

1.3納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1納入標(biāo)準(zhǔn)

1）年齡 18～80歲；2）符合NSTEMI急性診斷標(biāo)準(zhǔn)；3）中醫(yī)辨證屬血瘀證。

1.3.2排除標(biāo)準(zhǔn)

1）嚴(yán)重感染或自身免疫性疾病者；2）嚴(yán)重心功能不全者，左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）＜35%；3）未控制的嚴(yán)重高血壓或1型糖尿病病人；4）嚴(yán)重瓣膜性心臟病者；5）合并嚴(yán)重肝、腎或造血系統(tǒng)及精神疾病、惡性腫瘤者；6）依從性差；7）妊娠期或哺乳期婦女；8）拒絕簽署知情同意書者。

1.4研究方法

1.4.1一般情況

記錄入組病人的一般情況及急性心肌梗死相關(guān)危險(xiǎn)因素情況，包括性別、年齡及合并疾病情況。觀察指標(biāo)：血清BNP、血清肌鈣蛋白I（cTnI）等指標(biāo)由我院檢驗(yàn)科檢測(cè)；LVEF數(shù)據(jù)由我院超聲科提供。

1.4.2目標(biāo)基因microRNA檢測(cè)

1）使用EDTA 血漿分離管采集符合入組標(biāo)準(zhǔn)的病人靜脈血樣，以二次離心法獲得血漿樣本后，置于－80 ℃條件保存；2）使用Trizol 法分別提取各組標(biāo)本的總 RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄后制備目標(biāo) cDNA 模板；3）設(shè)計(jì)目標(biāo)基因上游引物，選擇合適的內(nèi)參基因，應(yīng)用通用引物的 SYBR Green 染料法對(duì)備選目標(biāo)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)，檢測(cè)重復(fù)進(jìn)行3次，取3次檢測(cè)結(jié)果的平均值。4）根據(jù)qRT-PCR原始檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對(duì)于對(duì)照樣品，目的microRNA基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

血漿microRNAs表達(dá)采用2－△△Ct相對(duì)定量計(jì)算公式，其中△△Ct＝（觀察組目的基因平均Ct值—觀察組內(nèi)參基因平均Ct值）—（對(duì)照組目的基因平均Ct值—對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值）。定量資料為正態(tài)分布且方差齊時(shí)，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；定性資料兩組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。采用SPSS25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組TNI、BNP及LVEF比較

與對(duì)照組相比，觀察組cTnI及BNP明顯升高，LVEF明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.2兩組血漿目標(biāo)基因microRNA表達(dá)結(jié)果比較

對(duì)microRNA在NSTEMI病人中的表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行分析，選定4個(gè)目標(biāo)microRNA（miR-133a、miR-208、miR-21及miR-1）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定。本研究結(jié)果顯示，觀察組病人血漿miR-133a RNA、miR-208 RNA、miR-1 RNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而觀察組病人血漿miR-21 RNA與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

3討論

NSTEMI是臨床常見的心血管疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，其發(fā)病機(jī)制與冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊不穩(wěn)定、斑塊破裂、血栓形成、血液微循環(huán)障礙、心肌供氧不足及失衡等諸多因素密切相關(guān)。本病發(fā)病率及致死率高，對(duì)其早期鑒別診斷有助于及時(shí)選擇個(gè)體化的抗栓或血運(yùn)重建等干預(yù)措施，對(duì)本病的發(fā)展趨勢(shì)及預(yù)后評(píng)估有著重要的意義，快速而準(zhǔn)確的診斷一直以來都是研究的熱點(diǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到關(guān)鍵的作用，不僅在心肌組織中特異性表達(dá)，而且還能以穩(wěn)定的形式存在于循環(huán)血液中，其異常表達(dá)與組織損傷或病理變化呈現(xiàn)出明顯的動(dòng)態(tài)相關(guān)性，可能成為新一代生物標(biāo)志物［2，7-9］。

NSTEMI屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”范疇，中醫(yī)認(rèn)為，本病為本虛標(biāo)實(shí)之證，以心氣、心陽(yáng)虛衰為本，氣滯、血瘀、痰飲、寒凝為標(biāo)。心氣、心陽(yáng)虛損，無力鼓動(dòng)血脈，導(dǎo)致瘀血痹阻心脈，血瘀貫穿胸痹心痛疾病發(fā)展病理過程的始終。血瘀證是非ST段抬高型心肌梗死的最為常見的證型，是眾多心血管中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的方向。故本研究選取中醫(yī)辨證屬血瘀證的NSTEMI病人為研究對(duì)象，探討特定microRNA在血漿中的分布規(guī)律。

心血管疾病發(fā)生時(shí)，心肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，特異性microRNA可由受刺激的細(xì)胞釋放至血液循環(huán)中而被檢測(cè)到，是潛在的新型診斷標(biāo)志物［7-9］。有研究發(fā)現(xiàn)在胸痛后早期肌酸磷酸肌酶和肌鈣蛋白T還未升高時(shí)，血清miR-1 RNA和miR-133a RNA就已經(jīng)升高［10］。另有研究對(duì)急性冠脈綜合征病人血漿心肌相關(guān)性microRNAs進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)心肌梗死病人血漿miR-208b RNA和miR-499-5p RNA明顯高于非心肌梗死病人，ST段抬高型心肌梗死病人血漿miR-208b RNA和miR-499-5p RNA明顯高于NSTEMI病人［11］。Olivieri等［12］對(duì)92例NSTEMI心肌梗死病人、81例急性心力衰竭病人和99名健康對(duì)照老年人血漿miR水平進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，急性心肌梗死病人與健康對(duì)照組相比，血漿miR-1 RNA、miR-21 RNA、miR-133a RNA和miR-423-5p RNA水平上調(diào)3～10倍，而miR-499-5p RNA上調(diào)超過80倍，此外，在區(qū)分NSTEMI和急性充血性心力衰竭時(shí)，血漿miR-499-5p診斷的精確度高于心肌肌鈣蛋白T，其可能是NSTEMI敏感的生物標(biāo)志物。國(guó)內(nèi)有研究表明，循環(huán)miRNA-21是急性冠脈綜合征病人經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（PCI）術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［13］。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上，通過查閱大量文獻(xiàn)，檢索國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫(kù)，收集、分析和研究microRNA在NSTEMI病人中的表達(dá)特點(diǎn)，選定4個(gè)目標(biāo)microRNA（miR-133a、miR-208、miR-21及miR-1）進(jìn)行測(cè)定。研究結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，觀察組病人血漿miR-133a RNA、miR-208 RNA、miR-1 RNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而觀察組病人血漿miR-21 RNA與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，血漿miR-133a、miR-208、miR-1在血瘀型NSTEMI病人中表達(dá)水平顯著升高，其可能成為預(yù)測(cè)NSTEMI病人及輔助評(píng)估心功能的潛在指標(biāo)。

綜上所述，在血瘀證人群的臨床診療工作中，血漿miR-133a RNA、miR-208 RNA、miR-1 RNA檢測(cè)可對(duì)NSTEMI病人進(jìn)行早期的、更有針對(duì)性的診斷，從而進(jìn)行快速介入治療或藥物干預(yù)，降低病人心肌梗死進(jìn)一步加重的風(fēng)險(xiǎn)。血瘀證是中醫(yī)基礎(chǔ)證候之一，本研究作為一項(xiàng)探索性研究，檢測(cè)了血瘀證NSTEMI病人的microRNA表達(dá)特點(diǎn)。在下一步工作中，將擴(kuò)大研究的樣本量，檢測(cè)氣滯血瘀證、氣虛血瘀證、痰瘀互結(jié)證等以血瘀證為基礎(chǔ)的復(fù)合證候NSTEMI病人的microRNA表達(dá)特點(diǎn)，為microRNA檢測(cè)對(duì)NSTEMI病人的診斷提供更多依據(jù)。

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（收稿日期：2022-10-24）

（本文編輯王雅潔）