索欣 牛啟塵 郭鋮 蓋云鵬 陳玲 尹淑霞

摘要：為明確北京市順義區(qū)苜蓿（Medicago sativa L.）鐮刀菌根腐病的病原菌種類，本研究采用常規(guī)組織分離法對發(fā)病苜蓿樣品進行病原菌分離純化；利用形態(tài)學特征觀察結(jié)合多基因序列分析（rDNA-ITS，EF-1α和RPB2）的系統(tǒng)發(fā)育樹對病原菌進行鑒定，并按照柯赫法則測定菌株致病性；采用菌絲生長速率法，測定強致病鐮刀菌的生物學特性及殺菌劑的抑制作用。結(jié)果表明，本研究共分離獲得26株菌株，7株鑒定為鐮刀菌，分別屬于Fusarium incarnatum-equiseti species complex（FIESC）中的F. ipomoeae，F(xiàn). compactum和F. flagelliforme以及銳頂鐮刀菌F. acuminatum和腐皮鐮刀菌F. solani，其中MsF1（F. ipomoeae）的致病力最強，接種苜蓿幼苗發(fā)病的病情指數(shù)為64.33。生物學特性測定表明，MsF1在溫度30℃、pH值為6～10、低氮條件下最適合生長，可耐受150 g·L-1的NaCl脅迫；異菌脲對其抑制效果不明顯，供試濃度下抑制率低于10%，而咯菌腈對其半數(shù)效應濃度（Median effect concentration，EC50）為0.142 μg·mL-1。本研究首次報道FIESC可侵染紫花苜蓿引起鐮刀菌根腐病，為苜蓿根腐病的多樣性研究和田間有效防治提供科學依據(jù)和理論支撐。

關鍵詞：苜蓿；鐮刀菌根腐?。环蛛x鑒定；致病性；FIESC

中圖分類號：S963.22+3.3??? 文獻標識碼：A???? 文章編號：1007-0435（2024）05-1327-12

Isolation of a Novel Alfalfa Fusarium Root Rot Pathogen

FIESC and Characterization of Strain Biology

SUO Xin， NIU Qi-Chen， GUO Cheng， GAI Yun-peng， CHEN Ling， YIN Shu-xia*

（Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

Abstract：In order to identify the pathogen causing alfalfa Fusarium root rot in Shunyi District of Beijing，the pathogen was isolated and purified from diseased samples using conventional tissue separation method. Combined with morphological characteristics，pathogen was identified by phylogenetic tree constructed by multi-gene sequence analysis（rDNA-ITS，EF-1α and RPB2）. According to Kochs Postulates，the pathogenicity of different pathogens was analyzed. Moreover，the mycelial growth rate method was further used to determine the biological characteristics of strongly pathogenic Fusarium and the inhibitory effect of fungicides. The results showed that the total of 26 strains were obtained from afalfa samples. 7 of them were identified as potential pathogens of afalfa Fusarium root rot，and all are Fusarium species，respectively belonging to F. ipomoeae，F(xiàn). compactum and F. flagelliforme in the Fusarium incarnatum-equiseti species complex （FIESC），as well as to F. acuminatum and F. solani. Among them，MsF1（F. ipomoeae）had the highest pathogenicity，and the disease index of inoculated alfalfa seedlings was 64.33. The biological determination showed that MsF1 was most suitable for growth under the conditions of temperature 30℃，pH 6～10 and low nitrogen. MsF1 could tolerate the stress of NaCl at 150 g·L-1，and the inhibitory effect of iprodione was not significant，with less than 10 percent inhibition at the concentrations tested，while the EC50 value of fludioxonil was 0.142 μg·mL-1. In this study，it was reported for the first time that FIESC could infect alfalfa and cause Fusarium root rot，which provided scientific basis and theory support for the diversity study and effective field control of alfalfa root rot.

Key words：Alfalfa;Fusarium root rot;Isolation and identification;Pathogenicity;FIESC

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的多年生豆科植物，因其適應性強、營養(yǎng)價值高、產(chǎn)量高且品質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點，享有“牧草之王”的美譽［1-2］。苜蓿在我國具有悠久的栽培歷史，隨著“糧改飼”和“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動”的實施，苜蓿產(chǎn)業(yè)得到極大的重視，2012年起“中央一號文件”多次提出加快苜蓿等優(yōu)質(zhì)飼草發(fā)展，2021年我國苜蓿種植面積超過200萬hm2，苜蓿產(chǎn)量超140萬t［3］。然而，隨著苜蓿種植產(chǎn)業(yè)的不斷壯大，病害問題日益突出，成為制約苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素［4-5］，且苜蓿作為多年生植物，生長年限的增長更容易導致病原菌的積累及病害的發(fā)生［6］。

苜蓿根腐病是一種世界性的苜蓿根部病害，在全球范圍內(nèi)每年造成的苜蓿產(chǎn)量損失在20%～40%之間［7］，幾乎遍及所有苜蓿栽培地區(qū)，且對苜蓿各個生長時期均可造成危害。因此，苜蓿根腐病的研究對于苜蓿病害防治以及苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展有著重要意義。苜蓿根腐病是典型的土傳病害，病原種類繁多，主要為真菌性病原［8］。鐮刀菌（Fusarium spp.）［9-10］、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）［11］、腐霉（Pythium spp.）［12］、疫霉（Phytophthora spp.）［13-14］這4大類真菌為苜蓿根腐病最廣泛報道的病原菌［7，15］，其中由鐮刀菌引起的鐮刀菌根腐?。‵usarium root rot）是苜蓿田間最普遍發(fā)生且危害嚴重的病害［16-17］。

鐮刀菌種類豐富、寄主廣泛，20種鐮刀菌均可侵染苜蓿導致根腐病［18］，近幾年在我國報道的主要種類為尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）［17，19-23］、腐皮鐮刀菌（F. solani）［19-24］、層出鐮刀菌（F. proliferatum）［16，22-24］、三線鐮刀菌（F. tricinctum）［20，22-24］、銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）［17，19-20］和木賊鐮刀菌（F. equisti）［17，19］。鐮刀菌的復雜性和變異性使其成為最難識別的真菌屬，僅通過形態(tài)觀察無法將鐮刀菌區(qū)分到種，分子生物學的發(fā)展彌補了形態(tài)學鑒定的不足，已經(jīng)成為鐮刀菌鑒定常用方法。任勝林等［25］通過內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）鑒定出百合枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌，陳祥祥等［26］通過基于翻譯延伸因子（EF-1α）分析發(fā)現(xiàn)江蘇省水稻赤霉病病原菌主要為亞洲鐮刀菌（F. asiaticum）和禾谷鐮刀菌（F. graminearum）。不同基因有效信息位點不一致，在鑒定過程中可用多對基因聯(lián)合的方法對病原菌進行更加準確鑒定［27］，目前對苜蓿根腐病病原菌鑒定多局限于rDNA-ITS和EF-1α基因單獨鑒定的方法［17，24，28］，并未利用多基因聯(lián)合建樹的優(yōu)勢對病原菌的詳細分類信息和生物學特性進行系統(tǒng)鑒定分析。且目前有關于苜蓿根腐病鐮刀菌生物學特性的研究不多，常局限于尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌等常見菌株。目前對鐮刀菌的分類還沒有一個統(tǒng)一分類方法描述鐮刀菌屬的內(nèi)部變異［29］，同時僅使用單基因鑒定如rDNA-ITS序列曾導致真菌被錯誤分類［30］，使用多基因聯(lián)合建樹的方法可有效提高真菌鑒定的準確性。因此，本試驗在綜合利用形態(tài)學觀察和分子生物學方法鑒定病原菌的基礎上，使用多基因序列分析的系統(tǒng)發(fā)育樹的優(yōu)勢提升對病原菌鑒定的高效性和準確性。

本研究通過采集北京順義栽培苜蓿田間的發(fā)病苜蓿植株，用常規(guī)組織分離法分離病原菌，利用土壤接種法對分離物致病性進行測定，并結(jié)合形態(tài)學觀察和多基因聯(lián)合分子生物學鑒定結(jié)果確定病原菌的種類組成，明確苜蓿鐮刀菌根腐病的病原菌組成及主要致病種；并研究了溫度、pH值、NaCl濃度、氮源對強致病菌菌落生長的影響，探究了常用殺菌劑對菌落生長的抑制效果，描述了相關苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌的生物學特性，為明晰苜蓿根腐病病原菌組成提供助力，為苜蓿根腐病綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品及苜蓿品種：2023年5月從北京順義紫花苜蓿種植區(qū)采集具有鐮刀菌根腐病典型癥狀的發(fā)病植株，將樣品編碼標記后帶回實驗室備用。致病性測定選用中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所提供的‘中苜1號紫花苜蓿。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基成分為20 g葡萄糖、6 g馬鈴薯浸粉、15 g瓊脂粉加去離子水定容到1 L；基本培養(yǎng)基（Minimal medium，MM）成分為10 g葡萄糖、1.5 g磷酸氫二鉀、2 g磷酸二氫鉀、1 g硫酸銨、0.5 g七水合硫酸鎂、2 g酵母提取物、15 g瓊脂粉加去離子水定容到1 L；馬鈴薯葡萄糖液體（Potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基成分為20 g葡萄糖、6 g馬鈴薯浸粉加去離子水定容到1 L。

1.2 苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化

采用常規(guī)組織分離法對發(fā)病植株進行病原菌分離純化。將發(fā)病苜蓿根部清洗后，在病健交接處切取約5 mm×5 mm方塊，用75%酒精處理30 s，3%次氯酸鈉處理2 min，無菌水沖洗3～5次，置于含50 μg·mL-1氯霉素和硫酸鏈霉素PDA培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d后，挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對菌落純化以獲得純培養(yǎng)菌株，將其轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 形態(tài)學鑒定

將分離純化的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，5 d后觀察菌落形態(tài)和色澤，測量菌落直徑；7 d后于顯微鏡下觀察菌絲和分生孢子形態(tài)，拍照并記錄。根據(jù)菌落直徑、菌落特征以及分生孢子形態(tài)，參照Booth［31］方法對其種屬進行初步鑒定。

1.4 分子鑒定及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

為了保證鑒定的準確性，挑取1.3形態(tài)學鑒定獲得的7株鐮刀菌菌株，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，用無菌解剖刀將菌絲刮至2 mL離心管中，使用Fungal DNA Kit試劑盒提取供試菌株的基因組DNA，利用rDNA-ITS序列引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ ITS4（5′-TCCTCC-GCTTATTGATATGC-3′）、EF-1α序列引物EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）/EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTAC-C-3′）和RPB2序列引物5F2（5′-GGGGWGAYCAGAAGAAGGC-3′）/7CR（5′-CCCATRGCTTG-YTTRCCCAT-3′）進行PCR擴增，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

25 μL PCR反應體系為12.5 μL 2×GoldStar Best MasterMix，正、反向引物各1 μL，2 μL樣品DNA和8.5 μL無菌水。PCR反應程序為：94℃初變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s和72℃延伸1 min，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。

將測序結(jié)果與GenBank中相關物種序列進行BLAST同源性比對，并下載相似性高且同時含有rDNA-ITS，EF-1α和RPB2基因的參考菌株序列。按照rDNA-ITS，EF-1α和RPB2的順序依次拼接，并以Macroconia leptosphaeriae（CBS 100001） 為外群，使用MEGA 11.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，bootstrap檢驗次數(shù)設為1 000次［32-33］。

1.5 致病性測定及柯赫法則驗證

為明確病原菌的致病性特征，于2023年5月進行室內(nèi)致病性測定，試驗采用剪根蘸根法接種（參考陳超超等［34］的方法，在此基礎上略有改動）?！熊僖惶栜俎Ｆ贩N經(jīng)75%乙醇消毒、無菌水沖洗干凈后，置于營養(yǎng)土∶蛭石體積比2∶1的土壤中，人工氣候箱中培養(yǎng)（25℃光照/20℃黑暗，相對濕度65%）。將分離菌株活化后，在菌落邊緣打取9 mm菌餅，取5枚菌餅置于裝有100 mL無菌馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液的200 mL錐形瓶中，于25℃，180 r·min-1搖床上培養(yǎng)5 d，血細胞計數(shù)板計數(shù)后用無菌水稀釋，分別制備成濃度為 1×107個·mL-1的孢子懸浮液。待苜蓿生長28 d后，使用剪刀將植株地上部分修剪至20 cm，將植株根系從土壤中取出沖洗干凈后剪去根尖5 cm，并在孢子懸浮液中浸泡1 h，對照組剪根后浸泡在無菌水中，接種后植株移栽到新的滅菌土壤中。每個處理接種5株苜蓿苗，共6個重復。接種14 d后觀察苜蓿發(fā)病情況，待植株根系發(fā)病后，用1.2中方法進行病原菌再次分離，觀察分離菌的菌落形態(tài)與原菌株是否一致。根據(jù)苜蓿根系發(fā)病面積進行病情分級，分級標準為［17，35］：0級，根系發(fā)育良好，無變色腐爛；1級，根系變色、腐爛面積小于25%；2級，根系變色、腐爛面積為25%～50%；3級，根系變色、腐爛面積為51%～75%，葉片開始萎蔫；4級，根系變色、腐爛面積大于75%，葉片萎蔫或死亡；5級，根系全部爛，整株死亡。計算病情指數(shù)，病情指數(shù)=Σ（各級病株×相應病級）/（調(diào)查總株數(shù)×5）×100。

1.6 強致病菌株生物學特性研究

以PDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別測定不同溫度、pH值、NaCl濃度對強致病菌株生長的影響。溫度設置5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃共9個處理；pH值設置4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，13.0共10個處理；NaCl濃度設置0，50，100，150，200，250 g·L-1共6個處理。以MM培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，測定不同氮源對強致病菌株生長的影響，以MM培養(yǎng)基中1 g·L-1硫酸銨（NH+4）為基礎，增加0.5，2 g·L-1 NH+4 梯度處理，用1 g·L-1硝酸鉀（NO-3）代替MM培養(yǎng)基中的硫酸銨，并增加0.5，2 g·L-1 NO-3 梯度處理。采用菌絲生長速率法測定菌株生長情況，在強致病菌株邊緣打取9 mm菌餅，菌絲面朝下接種于供試培養(yǎng)基中央，培養(yǎng)5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復6次。

1.7 殺菌劑對強致病菌株抑制效率

采用菌絲生長速率測定法測定殺菌劑異菌脲（iprodione）和咯菌腈（fludioxonil）（原藥由湖北薪和化工有限公司生產(chǎn)）對強致病菌株MsF1的半數(shù)效應濃度（Median effect concentration，EC50）。以PDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，異菌脲濃度設置0，0.5，1，2.5，5，7.5和 10 μg·mL-1共7個處理；咯菌腈濃度設置0，0.05，0.1，0.25，0.5，0.75，1和1.25 μg·mL-1共8個處理［36］。在供試菌株邊緣打9 mm菌餅，分別接種于含藥PDA培養(yǎng)基中央，置于30℃黑暗條件下培養(yǎng)，以不含殺菌劑的PDA培養(yǎng)基為對照，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復6次。分別計算異菌脲和咯菌腈對菌絲生長的抑制率，求出毒力回歸方程和半數(shù)效應濃度（EC50）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析，用Duncan氏新復極差法進行組間差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離獲得及其形態(tài)學特征

通過對田間獲得的發(fā)病苜蓿樣本分離、純化，共得到26株菌株，根據(jù)菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征進行觀察，初步鑒定出7株鐮刀菌，分別將其編號為MsG1，MsY4，MsG4，MsY2，MsM4，MsM5和MsF1。

MsG1菌株在PDA培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)5 d，菌落直徑達5.7～6.1 cm，氣生菌絲稀松呈白色，菌落圓形邊緣整齊，隨著培養(yǎng)時間的增長，出現(xiàn)菌絲減弱狀況，菌落背面呈均勻的黃綠色（圖1-A1）。分生孢子呈卵圓形、腎形，壁厚，頂端細胞鈍圓形，具有0～2個分隔，大小為（23.3～47.3） μm×（3.3～6.8） μm（圖1-A2）。

MsY4菌株在PDA培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)5 d，菌落直徑達6.8～7.6 cm，菌落扁平，氣生菌絲稀少呈淡黃色，菌落邊緣為波浪形且呈白色，隨著培養(yǎng)時間的增長，菌落中心變黃逐漸成棕色，菌落背面透明無色素變化（圖1-B1）。產(chǎn)孢量少，分生孢子呈月牙型，頂端細胞較細，具有2～3個分隔，大小為（30.2～40.4） μm×（5.4～6.9） μm（圖1-B2）。

MsG4和MsY2菌株在PDA培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)5 d，菌落直徑達3.6～4.4 cm，氣生菌絲發(fā)達且呈淡紫色，產(chǎn)生玫紅色色素，生長速率較慢，培養(yǎng)7～10 d后，菌落正面氣生菌絲中心變黃逐漸呈酒紅色，菌落背面呈現(xiàn)濃重的酒紅色（圖1-C1和D1）。分生孢子呈現(xiàn)彎曲的鐮刀狀，具有3～5個分隔，大小為（16.4～44.1） μm×（3.1～4.9） μm（圖1-C2和D2）。

MsM4和MsM5菌株在PDA培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)5 d，菌落直徑達6.6～7.5 cm，氣生菌絲發(fā)達致密，生長速率快，5～6 d可鋪滿培養(yǎng)皿（90 mm），隨著培養(yǎng)時間的增長，菌落背面呈均勻的乳白色或淺橙色（圖1-E1和F1）。分生孢子整體較直，頂端細胞細長呈現(xiàn)近乎針狀的外觀，大小差異較大，具有3～5個分隔，大小為（17.1～63.8） μm×（2.8～7.3） μm（圖1-E2和F2）。

MsF1菌株在PDA培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)5 d，菌落直徑達7.5～8.0 cm，氣生菌絲菌絲為白色、致密的絲絨狀，隨著培養(yǎng)時間的增長，中心出現(xiàn)棉絮狀菌絲團，菌落背面呈無色或淡黃色（圖1-G1）。分生孢子呈鐮刀狀彎曲，頂端細胞鉤狀，大多具有4～5個分隔，大小為（38.5～60.2） μm×（2.5～6.8） μm（圖1-G2）。厚垣孢子球形，單個頂升（圖1-G3）。

2.2 病原菌分子生物學鑒定和系統(tǒng)發(fā)育進化樹

本研究采用的3個引物的擴增成功率均為100%，基于rDNA-ITS序列、EF-1α序列和RPB2序列的順序?qū)y序結(jié)果進行連接，最終7個分離菌株連接的比對序列大小為1 603 bp，其中ITS序列488 bp，EF-1α序列304 bp，RPB2序列811 bp。通過多基因聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)供試菌株被劃分為5個類群（圖2），MsF1菌株與F. ipomoeae 聚在同一分支，遺傳相似性高，與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致，將其鑒定為F. ipomoeae；MsM4和MsM5菌株與F. compactum聚在同一支，遺傳距離近，與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致，將其鑒定為F. compactum；MsY4菌株與F. flagelliforme聚在同一支，自展支持率為100，與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致，將其鑒定為F. flagelliforme；MsG4和MsY2菌株與銳頂鐮刀菌聚在同一分支，自展支持率大于90，與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致，將其鑒定為銳頂鐮刀菌F. acuminatum；MsG1菌株與腐皮鐮刀菌聚在同一分支，自展支持率大于90，與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致，將其鑒定為腐皮鐮刀菌F. solani。Fusarium incarnatum-equiseti species complex（FIESC）包括30余種系統(tǒng)發(fā)育物種，在世界各地廣泛分布，本研究所獲得的菌株其中MsF1，MsM4，MsM5和MsY4屬于FIESC。

2.3 鐮刀菌致病性檢測及柯赫法則驗證

接種2周后的致病性試驗顯示，健康苜蓿接種鐮刀菌后出現(xiàn)葉片發(fā)黃萎蔫、生長速率變慢等情況，將整株植物從土壤中挖出后，發(fā)病苜蓿根部莖基部位呈現(xiàn)黃褐色，嚴重時呈現(xiàn)根系腐爛的癥狀（圖3）。同時，從發(fā)病苜蓿根部再次分離得到的鐮刀菌與接種菌株相同，符合柯赫法則，表明分離得到的7株鐮刀菌均是苜蓿鐮刀菌根腐病的致病菌。菌株致病力測定結(jié)果顯示，7種致病菌對苜蓿的致病性差異明顯，其中MsF1菌株的致病力最強，病情指數(shù)為64.33（圖4），顯著高于其余鐮刀菌（P<0.05），且這株致病菌的致病程度最為嚴重，每個處理花盆中都出現(xiàn)苜蓿根系全部腐爛、整株死亡的根腐病嚴重發(fā)病病癥；其余MsY4，MsY2，MsM5，MsM4和MsG4的病情指數(shù)無顯著差異，分別為49.33，49.17，48.00，42.67和33.56，致病程度輕；MsG1的病情指數(shù)最低，為27.33，說明MsF1（F. ipomoea）菌株是引起北京順義苜蓿種植區(qū)鐮刀菌根腐病的重要病原菌。

2.4 強致病菌株生物學特性

通過致病性測定確定MsF1是分離菌株中的強致病菌株，進一步對其生物學特性進行研究，以此為實際生產(chǎn)中的苜蓿根腐病防控提供理論支撐。

2.4.1 不同溫度對菌落生長的影響 由圖5可知，MsF1菌株在5～35℃條件下均可生長。當培養(yǎng)溫度≥40℃時菌落直徑為菌餅直徑0.9 cm，菌落停止生長；35℃時菌落直徑為1.98 cm，菌落生長也受到了明顯抑制；低溫條件下菌落生長速度較慢，高溫對菌株生長的影響明顯強于低溫條件。該菌落適宜生長溫度為25～30℃，30℃時菌落直徑為8.0 cm，顯著高于其他溫度（P<0.05），因此該菌株最適生長溫度為30℃。

2.4.2 不同pH值對菌落生長的影響 由圖6和表1可知，MsF1菌株在pH值為4～13條件下均可生長。在pH值為6～10的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，菌株均可長滿培養(yǎng)皿，顯著高于其他處理（P<0.05）；偏酸性條件（pH值為4或5）對菌株生長有一定的抑制作用；當pH值高于11時對菌株生長抑制作用明顯，當pH值為13時抑制作用極為顯著（P<0.05）。因此該菌株對培養(yǎng)基的pH值耐受范圍很廣，中性以及偏堿性均適宜該菌株生長。

2.4.3 不同NaCl濃度對菌落生長的影響 由圖7可知，MsF1菌株在NaCl濃度為0～150 g·L-1的條件下均可生長。在沒有鹽脅迫的條件下菌株正常生長，NaCl濃度為50 g·L-1時菌落生長受到輕微抑制，NaCl濃度為100 g·L-1時菌落生長抑制率為48.25%，NaCl濃度為150 g·L-1時菌落生長抑制率為81.58%，NaCl濃度超過200 g·L-1時菌落停止生長。

2.4.4 不同氮源濃度對菌落生長的影響 由圖8可知，MsF1菌株在不同氮源濃度的條件下均可生長。硝態(tài)氮條件下菌落直徑大于銨態(tài)氮條件下的菌落，但不同氮源間沒有顯著差異。相同氮源下，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮條件下菌落直徑均隨氮源濃度的增加而減小，在0.5 g·L-1的條件下菌落直徑顯著高于另外2個處理組（P<0.05）。因此，該菌落對氮源硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的利用無明顯差異，在低氮條件下更適宜該菌落的生長。

2.5 殺菌劑對菌落抑制率

由圖9可知，異菌脲和咯菌腈對MsF1菌株菌絲生長均有一定的抑制作用，但2種藥劑的抑制作用差異明顯。不同濃度的異菌脲對菌落生長的抑制作用均低于10%，抑制率隨異菌脲濃度的增大呈現(xiàn)先增加后減小的“n”型，在異菌脲濃度為5 μg·mL-1時對菌株的抑制作用最明顯，抑制率為9.01%，10 μg·mL-1時抑制率只有1.31%。咯菌腈對菌落生長的抑制作用更明顯，隨著咯菌腈濃度的增加抑制率逐漸增大，在咯菌腈濃度為1.25 μg·mL-1時對菌株的抑制率為95.77%，通過擬合毒力回歸方程計算咯菌腈的EC50值為0.142 μg·mL-1（表2）。

3 討論

3.1 多基因聯(lián)合序列分析在鐮刀菌種間鑒定的應用

鐮刀菌屬在真菌分類系統(tǒng)中有著重要的地位，可侵染大多數(shù)植物導致多種植物病害的發(fā)生［37］。但由于其復雜性給形態(tài)學鑒定帶來了很大的困難，所以在形態(tài)學基礎上結(jié)合DNA序列特征建立系統(tǒng)發(fā)育樹的分子生物學方法，為鐮刀菌的鑒定提供快速方法［38］。rDNA-ITS基因序列由于具有高拷貝數(shù)、序列長短適中、易擴增等優(yōu)點，是廣泛運用在真菌種屬分類系統(tǒng)學中的標記序列。但rDNA-ITS序列也存在一定的局限性［39］，在真菌近緣種或集合種中間隔區(qū)差異性較小，不能準確識別和分類鑒定，更適用于不同屬間的區(qū)分。本研究中基于rDNA-ITS序列單獨構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹不能區(qū)分FIESC兩個主要分支（equiseti和incarnatum）。隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，翻譯延伸因子α亞基基因EF-1α、RNA聚合酶基因RPB1，RPB2和β-微管蛋白基因Tub等基因被不斷應用于鐮刀菌的分類鑒定，同時采用多基因聯(lián)合序列分析已成為植物病原菌分類鑒定可信度較高的技術(shù)手段［40］。丁新華等［41］基于rDNA-ITS，EF1-α聯(lián)合序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析方法對新疆綠洲灌溉玉米產(chǎn)區(qū)玉米莖腐病病原菌進行分類鑒定；Choi等［42］基于rDNA-ITS，EF-1α，RPB2基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析方法對韓國發(fā)病大豆分離病原菌進行分類鑒定，首次報道F. ipomoea導致大豆病害的發(fā)生；Wang等［43］通過多基因位點（ITS，TEF-1α，CAM，RPB1和RPB2）的系統(tǒng)發(fā)育分析，將中國采集的77株致病性和內(nèi)生鐮刀菌鑒定為Fusarium incarnatum-equiseti species complex（FIESC），并詳細闡明FIESC內(nèi)物種的遺傳學關系。綜合鐮刀菌鑒定的準確性和便捷性，本研究采用rDNA-ITS，EF-1α和RPB2基因序列對苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌進行多基因序列分析，提高了鐮刀菌種間鑒定的準確性，為鐮刀菌菌種鑒定提供了新思路。

3.2 首次研究報道FIESC侵染紫花苜蓿引起鐮刀菌根腐病

本研究結(jié)果表明分離得到的7株鐮刀菌對紫花苜蓿均具有致病性，但不同菌株之間致病力差異明顯，其中MsF1（F. ipomoea）菌株致病力最強，是引起北京順義紫花苜蓿鐮刀菌根腐病的重要致病菌。前人研究表明，引起我國苜蓿鐮刀菌根腐病的病原菌優(yōu)勢種主要為尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、銳頂鐮刀菌、木賊鐮刀菌、變紅鐮刀菌等［17-19，44］。國內(nèi)外研究者經(jīng)常從農(nóng)作物和水果中分離得到FIESC菌株，如Xu等［45］首次報道FIESC是引起中國黑龍江省玉米葉枯病的主要病原菌；Zelechowski等［46］首次發(fā)現(xiàn)FIESC在波蘭大豆中流行；Zhou等［47］首次從中國栽培區(qū)的櫻桃中分離得到對離體葉片產(chǎn)生致病性的FIESC菌株；Nuangmek等［48］鑒定出FIESC中的F. compactum和F. paranaense是導致西瓜果實腐爛的新型病原菌。本研究通過試驗驗證確定F. ipomoea是引起苜蓿鐮刀菌根腐病的重要病原菌，這是國內(nèi)外關于FIESC侵染紫花苜蓿引起鐮刀菌根腐病的首次研究報道。

3.3 MsF1菌株的環(huán)境適應性

對病原菌生物學特性的研究可以為病害的防治提供理論基礎。前人研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌生長適宜溫度集中于25～30℃，環(huán)境pH值耐受范圍較寬，中性以及偏堿性均適宜生長［49-50］。本研究對MsF1菌株的生物學特性測定結(jié)果與其一致，MsF1菌株具有很強的環(huán)境適應性，在5～35℃、pH值為4～13的條件下均可生長，30℃、pH值為6～10為其最適生長環(huán)境?？灯贾サ龋?1］研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌黃瓜?；驮跓o氮源和硝態(tài)氮條件下菌落生長速率顯著高于銨態(tài)氮；但潘虹等［52］研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌亞麻?；驮阡@態(tài)氮條件下菌落生長速率顯著高于硝態(tài)氮和無氮源；而孔瓊等［49］研究發(fā)現(xiàn)添加單一銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的培養(yǎng)基上尖孢鐮刀菌的菌絲生長速率均顯著高于硝酸銨復合添加。以上說明氮源對于不同鐮刀菌的影響并不一致，本研究發(fā)現(xiàn)MsF1菌株在銨態(tài)氮條件下菌落生長更快但與硝態(tài)氮條件下無顯著差異，在低氮條件下更適宜該菌落的生長，需后續(xù)進行更深入的探究氮源對該鐮刀菌的影響。

3.4 不同殺菌劑對MsF1菌株的影響

本研究發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫下對于MsF1菌株抑制作用明顯，推斷MsF1菌株對于滲透壓敏感性較高，因此在尋找具有潛在防治效果的殺菌劑時選擇了與滲透壓相關、作用于蛋白激酶的異菌脲［53］和咯菌腈［54］2類殺菌劑。本研究發(fā)現(xiàn)異菌脲對MsF1菌株的抑制作用低，不適用于田間防治。嚴蕾艷等［55］和王濤等［56］研究也發(fā)現(xiàn)異菌脲對于鐮刀菌的EC50值均大于5 μg·mL-1，防治效果不明顯，這可能與實際生產(chǎn)應用中異菌脲的長期不規(guī)范使用有關，近些年也出現(xiàn)越來越多關于不同植物病原菌對異菌脲產(chǎn)生抗藥性的報道［57-60］。本研究發(fā)現(xiàn)咯菌腈對MsF1菌株的EC50為0.142 μg·mL-1，僅少量使用便可對該菌株進行有效防治，馬桂花等［61］研究發(fā)現(xiàn)咯菌腈對鐮刀菌抑制作用較強，EC50在0.153～0.390 mg·L-1之間，與本文研究結(jié)果一致，且周鋒等［62］研究發(fā)現(xiàn)抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體致病性顯著降低、對環(huán)境的敏感度增加，因此在實際生產(chǎn)中鐮刀菌對咯菌腈產(chǎn)生抗藥性的風險較低［63-64］。

本研究對北京市順義區(qū)苜蓿種植區(qū)的苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌進行了分離鑒定與致病性測定，首次報道了FIESC中的F. ipomoea菌株對苜蓿具有強致病性。在對強致病鐮刀菌MsF1（F. ipomoea）菌株生物學特性研究時發(fā)現(xiàn)其有很強的環(huán)境適應性，為病害防治帶來一定困難，25～30℃時菌株生長速率快，夏季為鐮刀菌侵染高發(fā)期，因此建議春天在苜蓿種植區(qū)提早施用合適劑量的殺菌劑預防相關病害的發(fā)生。本研究通過含藥培養(yǎng)基測定了咯菌腈對該菌株的EC50為0.142 μg·mL-1，可作為苜蓿鐮刀菌根腐病的有效殺菌劑，但對于咯菌腈的田間防效還尚不清楚，因此后續(xù)還需通過田間試驗進行藥劑測試及病害發(fā)生規(guī)律等方面的深入研究。

4 結(jié)論

本研究通過組織分離法共得到26 株菌株，經(jīng)形態(tài)學鑒定和多基因序列分析確定7株鐮刀菌為苜蓿鐮刀菌根腐病的潛在病原菌，F(xiàn)IESC可侵染紫花苜蓿引起鐮刀菌根腐病為國內(nèi)外首次報道。其中MsF1（F. ipomoea）菌株的致病力最強且同時具備較強的環(huán)境適應能力，該菌株在溫度30℃、pH值為6～10、低氮條件下最適合生長，可耐受150 g·L-1的NaCl脅迫，篩選到咯菌腈對該菌株的抑制作用顯著，EC50值為0.142 μg·mL-1。本研究為苜蓿根腐病的多樣性研究和田間有效防治提供科學依據(jù)和理論支撐。

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（責任編輯 閔芝智）

收稿日期：2023-10-31；修回日期：2023-12-05

基金項目：國家自然科學基金項目（32102151）資助

作者簡介：

索欣（1999-），女，滿族，北京人，碩士研究生，主要從事紫花苜蓿草地保護研究，E-mail：suoxin0101@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：yinsx369@163.com