張政 劉美君 王婕 趙堯堯 安長奇 王跳霞

摘要：低溫是影響植物正常生長發(fā)育的重要環(huán)境因素。本研究以‘新牧4號(hào)紫花苜蓿（Medicago sativa L.‘Xinmu No.4）和‘甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿（Medicago sativa L.‘Gannong No.5）為試驗(yàn)材料，探究低溫下紫花苜蓿葉片光破壞防御作用的變化。結(jié)果表明，低溫下紫花苜蓿葉片的光合速率、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）及核心蛋白下降；低溫下非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）降低，環(huán)式電子傳遞（CEF）上調(diào)，使用NPQ抑制劑后Fv/Fm顯著下降；低溫下交替氧化酶（AOX）呼吸速率以及蛋白含量降低，但AOX呼吸的占比升高，AOX抑制劑和光呼吸抑制劑的施用均加重Fv/Fm的下降；低溫下超氧陰離子、過氧化氫和丙二醛含量上升，抗壞血酸酶（APX）活性上升。低溫下NPQ被抑制，CEF的上調(diào)彌補(bǔ)了NPQ作用的下降從而保護(hù)葉片減少光破壞；AOX增加電子分流從而維持光呼吸正常運(yùn)作；低溫下活性氧的清除主要依靠APX，但仍有大量活性氧產(chǎn)生使光系統(tǒng)受到損傷，引起光抑制。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；光破壞防御作用；低溫；光抑制

中圖分類號(hào)：S963.22+3.3??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A???? 文章編號(hào)：1007-0435（2024）05-1429-11

The Photoprotection Mechanism of Alfalfa Leaves under Low Temperature

ZHANG Zheng1， LIU Mei-jun1*， WANG Jie1， ZHAO Yao-yao1， AN Chang-qi1， WANG Tiao-xia1

（1. Pratacultural College of Xinjiang Agricultural University; key Laboratory of Grassland Resources and Ecology of Ministry of

Education in Western Arid Areas; Xinjiang Key Laboratory of Grassland Resources and Ecology， Urumqi， Xinjiang 830052， China）

Abstract：Low temperature is an important environmental factor affecting the normal growth and development of plants. In order to adapt to the low temperature environment，plants have developed a series of photoprotection mechanisms to protect photosynthetic apparatus from damage. In this study，alfalfa （Medicago sativa L.） ‘Xinmu No.4 and ‘Gannong No.5 were used as experimental materials to explore the changes of non photochemical quenching （NPQ），alternative oxidase （AOX） respiration rate，cyclic electron flow （CEF） and antioxidant system in alfalfa leaves under low temperature. The results showed that under low temperature，the photosynthetic rate of alfalfa leaves was decreased significantly，the maximum photochemical efficiency of photosystem II （Fv/Fm） was also decreased，and the core protein of PSII was degraded. At low temperature，NPQ decreased，CEF were increased，and the use of NPQ inhibitors caused a significant decrease in Fv/Fm. The AOX respiration rate and protein content were decreased at low temperature，but the proportion of AOX to total respiration was increased. The application of AOX inhibitors and photorespiration inhibitors aggravated the decrease of Fv/Fm. At low temperature，the contents of superoxide anion，hydrogen peroxide and malondialdehyde increased，and the activity of ascorbate peroxidase （APX） were increased. Therefore，at low temperature，the NPQ decreased，and the up-regulation of CEF makes up for the decrease of NPQ effect and protects leaves from light damage. AOX increases electron shunt to maintain the normal operation of photorespiration. The removal of reactive oxygen species at low temperature mainly depends on APX. However，there is still a large amount of reactive oxygen species was produced，which damages the photosystem and leads to photoinhibition.

Key words：Alfalfa;Photoprotection;Low temperature;Photoinhibition

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）有“牧草之王”的美稱，既有優(yōu)良的營養(yǎng)及品質(zhì)，又有較高的產(chǎn)量［1］。紫花苜蓿在全國廣泛種植，其中大部分種植于我國北方地區(qū)［2］。然而北方冬季寒冷和春季倒春寒頻繁，容易導(dǎo)致紫花苜蓿返青期發(fā)生低溫脅迫［3］。低溫脅迫是影響植物正常生長的重要因素，低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致植物光合速率下降，引起光能過剩，甚至導(dǎo)致光抑制的發(fā)生及光合機(jī)構(gòu)被破壞［4］，因此研究紫花苜蓿葉片光破壞防御作用具有重要意義。

光是植物進(jìn)行光合作用以及正常生長的必要條件，然而當(dāng)光照超過植物所能利用的最大限度時(shí)，植物葉片光系統(tǒng)II（PSII）對(duì)光能的利用率下降，發(fā)生光抑制，逆境脅迫會(huì)加劇植物的光抑制［5］。因此，植物在長期進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的光破壞防御機(jī)制以減輕光抑制的傷害［6］。根據(jù)其作用部位的不同，可分為葉綠體內(nèi)和葉綠體外的光保護(hù)途徑。其中葉綠體內(nèi)的光保護(hù)途徑主要有：熱耗散、環(huán)式電子傳遞、水-水循環(huán)等；葉綠體外主要包括光呼吸、活性氧清除系統(tǒng)及交替氧氧化酶途徑等［7］。當(dāng)植物的光化學(xué)反應(yīng)受到逆境脅迫的抑制時(shí)，植物通常會(huì)增加NPQ以消散過量的激發(fā)能，從而保護(hù)PSII［8］。在逆境條件下，光系統(tǒng)I（PSI）比PSII更加穩(wěn)定，因?yàn)槌嵬猓琍SI周圍的環(huán)式電子傳遞（CEF）和水水循環(huán)也是重要的防御機(jī)制，它們可以分流電子緩解PSI周圍電子的泄露以及活性氧的產(chǎn)生［9，10］。光呼吸偶聯(lián)光合作用的運(yùn)行，光呼吸的正常周轉(zhuǎn)不僅可以消耗過剩的NAPD+以防治光合電子傳遞鏈的過還原，還可以及時(shí)的代謝掉對(duì)光合電子傳遞鏈有毒害的乙醇酸，減輕其對(duì)光合機(jī)構(gòu)的傷害［11，12］，從而起到重要的光破壞防御作用。此外，線粒體交替氧化酶（AOX）呼吸途徑不僅通過消耗蘋果酸穿梭途徑運(yùn)輸?shù)娜~綠體中產(chǎn)生的過量還原力，來減少葉綠體的過度還原［13-14］，還可以通過維持光呼吸的周轉(zhuǎn)，從而維持光呼吸的光破壞防御作用［15，16］。

在植物的生長過程中，各種光保護(hù)途徑在逆境脅迫下發(fā)揮了重要作用，但在低溫脅迫下紫花苜蓿的光破壞防御機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究通過探討低溫下熱耗散、環(huán)式電子傳遞、光呼吸、水水循環(huán)等光破壞防御途徑對(duì)于紫花苜蓿PSII活性的影響，以期豐富紫花苜?？购畽C(jī)理，為紫花苜蓿抗寒品種的選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以‘新牧4號(hào)紫花苜蓿和‘甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿為試驗(yàn)材料，‘新牧4號(hào)由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院2022年收獲并提供，‘甘農(nóng)5號(hào)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院2022年收獲并提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

兩品種紫花苜蓿各選取50粒顆粒飽滿，大小均勻的種子，將其均勻的點(diǎn)播在裝滿蛭石的塑膠花盆（7 cm×7 cm×7.8 cm）中，種子均勻的種入花盆后，將其置于溫室培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)（光照培養(yǎng)12 h，暗培養(yǎng)12 h，光照強(qiáng)度為70 μmol·m-2·s-1，恒定溫度為25℃，培養(yǎng)環(huán)境濕度為70%～80%），種子出苗前用自來水澆水，植物出苗后采用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)。待紫花苜蓿生長14 d后，挑選生長狀況好、長勢均勻的10株幼苗移栽到裝滿蛭石的塑料花盆（8 cm×11 cm×8 cm）中，每個(gè)品種每個(gè)溫度下各種6盆，共計(jì)24盆，采用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，待其適應(yīng)11 d后調(diào)整人工氣候培養(yǎng)箱溫度（光照培養(yǎng)12 h，暗培養(yǎng)12 h，光照強(qiáng)度為300 μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)環(huán)境濕度為70%～80%），分別進(jìn)行為期72 h的室溫（25℃）和低溫（10℃）處理，取樣測定葉片相關(guān)生理指標(biāo)。

另取處理前對(duì)照組離體葉片，并使用打孔器進(jìn)行打孔（直徑0.5 cm），葉圓片正面朝上，漂浮在25℃恒溫水浴上待用。在人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，將葉片放置于培養(yǎng)皿中，葉圓片正面朝上，分別在不同溫度及不同光保護(hù)抑制劑下進(jìn)行處理，溫度選取室溫（25℃）和低溫（10℃）；抑制劑選用熱耗散專一性抑制劑二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）10 mmol·L-1、AOX專一性抑制劑水楊基異羥肟酸（Salicylhydroxamic acid，SHAM）1 mmol·L-1、水水循環(huán)抑制劑碘乙酰胺（Iodoacetamide，IAM）2 mmol·L-1和光呼吸抑制劑氨基乙腈（Aminoacetonitrile，ANN）1 mmol·L-1處理［17-19］。處理時(shí)間為6 h，分別在處理0，0.5，2，4，6 h進(jìn)行測量，光照強(qiáng)度為800 μmol·m-2·s-1，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取12個(gè)葉圓片進(jìn)行測定，用以研究低溫下紫花苜蓿葉片各光破壞防御作用的變化。

1.3 光合速率的測定

光合速率的測定采用CIRAS-3便攜式光合儀測定紫花苜蓿葉片的凈光合速率（Pn），使用外接光源提供光照，二氧化碳?xì)馄刻峁┒趸?，光照?qiáng)設(shè)定為300 μmol·m-2·s-1，二氧化碳設(shè)定為400 μmol·mol-1，分別在低溫（10℃）和室溫（25℃）進(jìn)行測量凈光合速率Pn。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)和熒光光響應(yīng)曲線的測定

將待測葉片暗適應(yīng)30分鐘，使用植物效率儀（M-PEA）測量葉片的快速熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（OJIP）［20］。計(jì)算PSII最大光化學(xué)效率：Fv/Fm=TRo/ABS=1－（Fo/Fm）［21］。熒光光響應(yīng)曲線采用調(diào)制脈沖式熒光儀DUAL-PAM-100測定低溫脅迫下PSI和PSII對(duì)不同光強(qiáng)的響應(yīng)。測量前將待測葉片暗適應(yīng)30分鐘，按62.5，114.6，203.6，412.4，644.1，795.5，989.5，1 229.4，1 530.6 μmol·m-2·s-1的順序作熒光光響應(yīng)曲線，前3個(gè)點(diǎn)間隔150 s記錄對(duì)應(yīng)的熒光參數(shù)，剩下的點(diǎn)每隔100 s記錄對(duì)應(yīng)的熒光參數(shù)。具體計(jì)算方法如下［22-25］：

PSII最大光化學(xué)效率：Fv/Fm=TRo/ABS=1-（Fo/Fm）

PSI電子轉(zhuǎn)移速率：ETR（I）=Y（I）×PAR×0.5×0.84

電子轉(zhuǎn)移速率：ETR（II）=Y（II）×PAR×0.5×0.84

非光化學(xué)淬滅系數(shù)：NPQ=Fm/Fm′-1

環(huán)式電子傳遞：CEF=ETR （I）/ETR（II）

其中，F(xiàn)o，初始熒光；Fm，暗適應(yīng)最大熒光；Fm′，光適應(yīng)下最大熒光；TRo/RC，單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量；ABS/RC，單位反應(yīng)中心吸收的光能。

1.5 抗氧化酶活性測定

取紫花苜蓿葉片0.5 g置于提前預(yù)冷的研缽中，加入5 mL Pbs磷酸緩沖液（PH 7.8）到預(yù)冷的研缽中，在冰上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，在4℃、12 000 r·min-1離心20 min，取上清4℃冰箱中待測定，上清液即為粗酶提取液。

分別使用氮藍(lán)四唑（NBT）法測定紫花苜蓿葉片中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性［26］，依次加入1.5 mL的0.05 mol·L-1磷酸緩沖液、0.3 mL的0.065 mol·L-1的Met溶液、0.3 mL的500 μmol·L-1 NBT溶液、0.3 mL的100 μmol·L-1 EDTA-Naz、0.3 mL的200 μmol·L-1核黃素、0.1 mL的粗酶提取液和0.5 mL的蒸餾水，混勻后將一支對(duì)照管置暗處作空白對(duì)照，其余各管于4 000 lx光下反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對(duì)照管為空白，測定樣品在560 nm處的吸光度。不同品種不同處理重復(fù)三次。以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)SOD活性單位。

紫外吸收法測定過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性［27］，加入1 mL的Tris-HCl緩沖液（pH7.0）、0.1 mL的粗酶提取液和1.7 mL的蒸餾水，將試管于25℃水浴中預(yù)熱3 min后，逐管加入0.2 mL的200 mmol·L-1 H2O2溶液，每加一管立即在紫外分光光度計(jì)上測定240 nm處的吸光度，每隔30 s讀數(shù)一次，共測3 min。不同品種不同處理重復(fù)三次。以吸光度和反應(yīng)時(shí)間作圖，計(jì)算隨時(shí)間減少的吸光度值，以H2O2的消耗程度反應(yīng)酶活性。

抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate perxidase，APX）的活性測定參照Nakano和Asada的方法［28］。取0.05 mL的粗蛋白提取液，加入1 mL酶反應(yīng)液（50 mmol·L-1 N2HPO4、NaH2PO4緩沖溶液，pH 7.0，含1 mmol·L-1抗壞血酸和2.5 mmol·L-1H2O2），充分混勻紫外可見分光光度計(jì)上讀取290 nm處吸光光度值在3 min內(nèi)每15 s中的變化。不同品種不同處理重復(fù)3次。計(jì)算每分鐘內(nèi)每毫克蛋白轉(zhuǎn)化的抗壞血酸量，用以表示酶活性的大小。

1.6 活性氧含量的測量

超氧陰離子的測定采用NBT法測定［29］，取上述0.5 mL酶提取液加入0.5 mL的50 mmol·L-1 Pbs （pH7.8） 和1 mL的1 mmol·L-1鹽酸羥胺搖勻，25℃保溫1 h；加入1 mL的17 mmol·L-1對(duì)氨基苯磺酸和1 mL的7 mmol·L-1α-蔡胺均勻混合，25℃保溫20 min；比色測定OD530，據(jù)樣品與羥胺反應(yīng)時(shí)間和樣品中蛋白質(zhì)含量，求得產(chǎn)生速率。不同品種不同處理重復(fù)3次。

H2O2含量測定參考王浩［30］的方法取新鮮紫花苜蓿葉片0.1 g，加入4 mL 0.1%的三氯乙酸冰浴研磨。在4℃、12 000 r·min-1離心20 min，取1 mL上清液依次向管中加入0.5 mL 10 mol·L-1磷酸緩沖液和1 mol·L-1的KI溶液1 mL。不同品種不同處理重復(fù)3次。使用紫外可見分光光度計(jì)在波長390 nm處檢測吸光值，通過與H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線比較計(jì)算H2O2的濃度。

1.7 丙二醛含量的測量

采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法［31］，取0.1 g葉片，加入5 mL 5%三氯乙酸，研磨勻漿后在3 000 r·min-1離心10 min；取2 mL上清液，加0.67%的TBA溶液4 mL，后進(jìn)行沸水浴15 min，待溶液快速冷卻后進(jìn)行離心，最后取上清液。分別在600，532，450 nm下測定其吸光度，并按下式求濃度：C（umol·g-1）=5×［6.45×（A532-A600）-0.56×A450］/M。不同品種不同處理重復(fù)三次。其中C為丙二醛（MDA）的含量（mol·L-1）；M為樣品質(zhì)量（g）。

1.8 Western blot蛋白表達(dá)分析

用蛋白質(zhì)印跡法檢測處理過的葉片類囊體膜中的蛋白質(zhì)。對(duì)于類囊體膜的制備，將葉片段在冰冷的分離緩沖液（100 mM蔗糖、50 mM Hepes、pH 7.8，20 mM NaCl、2 mM EDTA和2 mM MgCl2）中均化，然后通過三層紗布過濾。將濾液以12 000 r·min-1離心10分鐘。用分離緩沖液洗滌沉積物，重新離心，然后最終懸浮在分離緩沖液中。類囊體膜蛋白然后變性并使用12%聚丙烯酰胺梯度凝膠分離。然后將凝膠中的變性蛋白質(zhì)復(fù)合物電印跡到PVDF膜上，用PSII核心蛋白（D1）或AOX抗體探測，然后通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法觀察。

1.9 AOX呼吸速率的測定

將葉片從植株上摘下，用打孔器取直徑約0.5 cm的葉圓片并立即置于測量杯中。利用Clark氧電極（Hansatech，英國）對(duì)葉片的總呼總呼吸速率（Rtotal，μmol·m-2·s-1），當(dāng)加入工作濃度為20 mmoL·L-1的SHAM溶液后，測得葉片COX呼吸的耗氧速率（RCox，μmol·m-2·s-1），AOX途徑呼吸速率為：RAox=RTotal-RCox。根據(jù)上述方法分別測定不同溫度條件下紫花苜蓿葉片不同呼吸途徑的呼吸速率［32］。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2017軟件整理數(shù)據(jù)，SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差（ANOVA）統(tǒng)計(jì)分析，Duncan法多重比較，差異顯著性定義為P<0.05，采用軟件Origin 2022進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿凈光合速率和PSII的影響

在低溫脅迫后，紫花苜蓿的凈光合速率出現(xiàn)顯著降低，與25℃處理72 h相比，10℃處理后的紫花苜蓿葉片光合速率均顯著降低，兩品種Pn分別出現(xiàn)了44.06%和47.49%的下降，表明低溫脅迫會(huì)顯著影響紫花苜蓿的光合能力（圖1A）。與25℃對(duì)照相比，24 h后兩種溫度處理的紫花苜蓿葉片的Fv/Fm均呈下降趨勢，隨著處理時(shí)間的延長，25℃處理紫花苜蓿的Fv/Fm出現(xiàn)回升，而10℃處理的紫花苜蓿葉片F(xiàn)v/Fm低于處理前，兩種品種的變化趨勢基本一致（圖1B）。

2.2 低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿非光化學(xué)淬滅的影響

隨著光照強(qiáng)度的不斷上升，兩種處理的紫花苜蓿的NPQ光響應(yīng)曲線均出現(xiàn)上升（圖2）。相對(duì)于25℃，10℃低溫處理下的NPQ光相應(yīng)曲線出現(xiàn)顯著降低，并且隨著光照強(qiáng)度的增加，下降程度逐漸增加（圖2A），通過使用NPQ專一性抑制劑（DTT）處理，隨著處理時(shí)間的延長，抑制NPQ會(huì)導(dǎo)致紫花苜蓿葉片的Fv/Fm顯著下降，且低溫處理?xiàng)l件下Fv/Fm下降程度更快（圖2B，2C）。結(jié)果表明在過剩光下，NPQ能有效耗散過剩能量，低溫光脅迫下會(huì)導(dǎo)致紫花苜蓿的熱耗散降低，導(dǎo)致NPQ在低溫下的光破壞防御作用降低。

2.3 低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿線性電子傳遞和環(huán)式電子傳遞的影響

ETR（I）和ETR（II）分別表示PSI和PS II線性電子傳遞的能力，低溫處理72 h后，ETR（I）和ETR（II）的光響應(yīng)曲線隨著光強(qiáng)的增加而增加，但與室溫相比，低溫處理后的ETR（I）和ETR（II）增長幅度緩慢，并且ETR（I）呈逐漸上升趨勢，而ETR（II）呈先上升后下降趨勢，結(jié)果表明與室溫下ETR（I）和ETR（II）相比，10℃低溫脅迫嚴(yán)重抑制了紫花苜蓿葉片中PSI和PS II的光合電子流（圖3A，3B）。CEF表示PSI環(huán)式電子傳遞的循環(huán)電子流，依據(jù)ETR（I）和ETR（II）可以估算出CEF的通量。與室溫相比，低溫能夠顯著促進(jìn)兩個(gè)紫花苜蓿品種的CEF，‘甘農(nóng)5號(hào)增加程度更大（圖3C）。

2.4 低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿過氧化物含量的影響

低溫脅迫下，紫花苜蓿葉片中H2O2含量顯著增加，其中‘新牧4號(hào)紫花苜蓿增加了31.58%，‘甘農(nóng)5號(hào)增加了45.14%（圖4B）。與室溫相比，10℃低溫脅迫下‘新牧4號(hào)和‘甘農(nóng)5號(hào)的葉片中O·-2含量分別顯著增加了67.89%和55.12%（圖4A）。因此，低溫脅迫會(huì)使紫花苜蓿葉片內(nèi)的過氧化物含量增加，導(dǎo)致紫花苜蓿葉片遭受的氧化傷害。

2.5 低溫脅迫對(duì)紫花苜?？寡趸负康挠绊?/p>

與室溫相比，在低溫下，紫花苜蓿葉片中的CAT和SOD的活性無顯著變化，APX活性顯著升高，CAT活性出現(xiàn)降低（圖5）。丙二醛（MDA）是植物膜質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，能反應(yīng)植物膜脂過氧化的情況。與室溫相比，10℃低溫脅迫使丙二醛的含量顯著上升，表明低溫脅迫使植物的膜質(zhì)出現(xiàn)氧化損傷（圖5D）。

2.6 低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿AOX的影響

與室溫相比，紫花苜蓿的總呼吸速率和AOX呼吸速率在低溫下顯著降低，其中低溫下‘新牧4號(hào)紫花苜蓿AOX在總呼吸中的占比顯著升高，而低溫下‘甘農(nóng)5號(hào)的AOX在總呼吸中的占比相對(duì)于室溫?zé)o顯著差異（圖6）。

2.7 低溫脅迫下對(duì)紫花苜蓿PSII核心蛋白和AOX蛋白的影響

對(duì)兩品種紫花苜蓿葉片的D1蛋白和AOX蛋白進(jìn)行Westem Blot檢測后發(fā)現(xiàn)（圖8），與室溫下相比，在10℃低溫脅迫下兩品種紫花苜蓿葉片中的D1蛋白和AOX蛋白表達(dá)量均減少，表明低溫抑制了D1蛋白和AOX蛋白的合成。

此外，通過AOX專一性抑制劑SHAM抑制AOX呼吸途徑后，加重了低溫下紫花苜蓿葉片F(xiàn)v/Fm的下降程度（圖7）。這表明，低溫抑制了AOX途徑的活性，但在低溫下AOX對(duì)于紫花苜蓿葉片PSII仍起到了重要的光破壞防御作用。

2.8 低溫脅迫下不同光保護(hù)途徑對(duì)光呼吸和水水循環(huán)的影響

通過光呼吸專一性抑制劑ANN處理紫花苜蓿葉片，由圖可知（圖9A，9B），隨著時(shí)間變化低溫處理下兩品種紫花苜蓿Fv/Fm持續(xù)降低，且低溫處理明顯低于室溫處理；通過水水循環(huán)專一性抑制劑IAM處理紫花苜蓿葉片，由圖可知（圖9C，9D），相對(duì)于單獨(dú)低溫帶來的影響，室溫下抑制水水循環(huán)會(huì)導(dǎo)致Fv/Fm下降明顯，低溫處理下的下降程度更大。

3 討論

低溫下紫花苜蓿葉片F(xiàn)v/Fm下降以及PSII復(fù)合體中核心蛋白D1蛋白降解，這表明低溫下PSII發(fā)生光抑制［33］，從而影響紫花苜蓿葉片的光合作用，限制了紫花苜蓿的生長發(fā)育。低溫影響了兩品種紫花苜蓿的光破壞防御途徑，導(dǎo)致葉片發(fā)生不可逆的光抑制。

熱耗散依賴于葉黃素循環(huán)，通過耗散過剩光能，從而起到重要的光破壞防御作用，保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免光抑制的發(fā)生［34］，通常熱耗散的強(qiáng)弱可以通過葉綠素?zé)晒鈪?shù)非光化學(xué)淬滅NPQ來衡量［35］。紫花苜蓿葉片NPQ隨著光照強(qiáng)度的增加而增加，但低溫下NPQ隨光強(qiáng)增加程度顯著低于室溫，這表明低溫降低了紫花苜蓿葉片熱耗散，從而加重紫花苜蓿葉片過剩光能的產(chǎn)生；當(dāng)抑制NPQ后，紫花苜蓿葉片PSII光抑制程度加重，且在低溫下，光抑制程度更大，這說明熱耗散的光破壞防御作用在低溫下降低，但對(duì)于PSII仍起到重要的保護(hù)作用。前人研究表明，低溫導(dǎo)致植物光抑制主要表現(xiàn)在PSII和PSI的電子轉(zhuǎn)移受阻［36］，本研究中，低溫下兩品種紫花苜蓿葉片ETR（II）和ETR（I）在低溫下的顯著降低，表明低溫導(dǎo)致PSII和PSI的電子傳遞受阻。然而光合作用電子傳遞鏈中的PSII和PSI串聯(lián)起作用，兩者相互影響，PSI電子傳遞受阻不僅會(huì)加重PSII電子傳遞受阻，而且會(huì)抑制NPQ［37］，從而加重PSII的光抑制。

許多研究已經(jīng)證實(shí)植物可以通過增加CEF的速率來消耗過多的電子，從而保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受光破壞［38，39］。本研究中，紫花苜蓿的CEF隨著光照強(qiáng)度的增加逐漸升高，與室溫相比，低溫下的CEF顯著高于室溫，這表明在低溫脅迫下，紫花苜蓿過剩的激發(fā)能需要通過增強(qiáng)CEF來消耗，用來減少PSII的氧化損傷。水水循環(huán)作為電子庫能夠耗散多余的電子，也能促使跨膜質(zhì)子梯度的產(chǎn)生［40］。通常認(rèn)為水水循環(huán)在保護(hù)中只發(fā)揮了微不足道的作用，但仍起到了消耗過剩電子的作用［41］。我們通過抑制水水循環(huán)，導(dǎo)致紫花苜蓿PSII受到嚴(yán)重影響，表明水水循環(huán)對(duì)于PSII活性起到了保護(hù)作用。因此我們認(rèn)為，雖然NPQ是植物消耗過量光能的主要機(jī)制，但在低溫脅迫時(shí)其消耗過剩光能的能力有限，此時(shí)CEF的上調(diào)部分緩解了過剩激發(fā)能對(duì)紫花苜蓿葉片PSII的傷害。

植物葉片的光抑制的發(fā)生往往與活性氧的產(chǎn)生密切相關(guān)［42］?；钚匝醯姆e累會(huì)導(dǎo)致植物膜系統(tǒng)的氧化損傷，形成丙二醛等有害產(chǎn)物［43］，嚴(yán)重影響植物的正常生長。本實(shí)驗(yàn)中，低溫脅迫導(dǎo)致紫花苜蓿葉片中活性氧的大量產(chǎn)生，對(duì)其膜系統(tǒng)造成氧化損傷，尤其是加重了PSII核心蛋白D1蛋白的氧化降解。在植物體內(nèi)，自身存在降低活性氧，避免光合機(jī)構(gòu)氧化損傷的一系列抗氧化防御系統(tǒng)，包括CAT、SOD、APX等抗氧化酶，作為植物體內(nèi)主要的抗氧化防御酶，對(duì)植物光系統(tǒng)起到了保護(hù)作用［44］。盡管紫花苜蓿葉片遭受低溫脅迫時(shí)，主要通過上調(diào)APX的活性清除活性氧，但不足以全部緩解紫花苜蓿葉片內(nèi)的活性氧的傷害。

低溫脅迫會(huì)抑制光合作用中暗反應(yīng)的相關(guān)酶活性，進(jìn)而導(dǎo)致光合作用光反應(yīng)產(chǎn)生大量的ATP和NADPH積累，使電子傳遞鏈過度還原［45］。光呼吸可以轉(zhuǎn)移多余ATP和NADPH，從而避免光抑制的產(chǎn)生［46］。有研究表明，AOX可以維持光呼吸的運(yùn)轉(zhuǎn)從而維持其PSII光破壞防御作用［47］。但在本試驗(yàn)中，低溫抑制了紫花苜蓿葉片AOX蛋白的表達(dá)以及活性，也顯著抑制了植物的光呼吸作用［48］，低溫下光呼吸以及AOX對(duì)紫花苜蓿葉片PSII起到光破壞防御作用，但其作用效果受到低溫的限制。有研究表明，低溫脅迫抑制AOX途徑，可促使線粒體信號(hào)傳導(dǎo)的啟動(dòng)，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞活性氧的清除能力［49］，因此，在低溫脅迫下，紫花苜?？偤粑俾式档?，呼吸電子傳遞受阻，上調(diào)的AOX呼吸速率在總呼吸中的占比，可分流電子，從而減輕電子脅迫導(dǎo)致的活性氧的產(chǎn)生，減少活性氧對(duì)紫花苜蓿葉片的氧化傷害。

4 結(jié)論

低溫脅迫下紫花苜蓿NPQ降低，上調(diào)CEF緩解了NPQ下降導(dǎo)致的過剩激發(fā)能對(duì)PSII的傷害；低溫脅迫下紫花苜蓿葉片通過上調(diào)APX活性和AOX在總呼吸中的占比，從而減少活性氧的積累，AOX通過維持光呼吸的周轉(zhuǎn)從而減輕了過剩還原力對(duì)光合電子傳遞鏈的過還原。低溫環(huán)境下，紫花苜蓿葉片的光破壞防御途徑受到限制，APX和AOX的活性氧清除能力不足以完全緩解活性氧的大量積累，導(dǎo)致D1蛋白降解，引發(fā)不可逆的光抑制。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）

收稿日期：2023-12-11；修回日期：2024-01-29

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022D01A185）；國家自然科學(xué)基金（32360346）；國家自然科學(xué)基金（31860683）資助

作者簡介：

張政（1997-），男，漢族，河北邢臺(tái)人，碩士研究生，主要從事植物逆境生理研究，E-mail：237887354@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：Lebaby7@163.com