姚娜 云嵐 艾芊 任曉敏 周成美 李博華

摘要：為了分析和挖掘更多豆科牧草耐鹽基因，選育耐鹽品種，本研究通過同源克隆PCR方法從冬箭筈豌豆（Vicia villosa Roth.）cDNA中克隆NHX1基因，并對其進行生物信息分析。結(jié)果表明：冬箭筈豌豆NHX1基因CDS序列長度為1 641 bp，編碼546個氨基酸，為堿性疏水蛋白，與豌豆同源相似度最高；蛋白結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，包含10個跨膜結(jié)構(gòu)域；相對定量分析表明NHX1在根、莖、葉組織中均有表達，鹽脅迫下葉中表達量最高并在鹽脅迫后48 h達到最大值；1300-cYFP-NHX1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草亞細胞定位顯示其定位于細胞膜，并通過蛋白印跡法驗證蛋白表達。冬箭筈豌豆NHX1基因參與鹽脅迫響應，在耐鹽性強的材料中相對高表達。本研究為豆科牧草耐鹽性改良奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：冬箭筈豌豆；NHX1；基因克??；表達分析

中圖分類號：S542??? 文獻標識碼：A???? 文章編號：1007-0435（2024）05-1401-09

Cloning and Expression Analysis of Salt-tolerant Gene NHX1 in Vicia villosa Roth.

YAO Na1， YUN Lan1，2*， AI Qian1， REN Xiao-min1， ZHOU Cheng-mei1， LI Bo-hua1

（1.College of Grassland Resource and Environment， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010010， China；

2. Key Laboratory of Grassland Resources of Education Ministry， Hohhot， Inner Mongolia 010010， China）

Abstract：In order to analyze and excavate more salt-tolerant genes of legume forage and breed salt-tolerant varieties，the NHX1 gene was cloned from the cDNA of Vicia villosa Roth. by homologous cloning PCR method，and its biological information was analyzed. The CDS sequence length of the gene NHX1 of Vicia villosa Roth. is 1 641 bp，encoding 546 amino acids，and it is an alkaline hydrophobic protein with the highest homology similarity to pea. The protein structure is dominated by alpha helix and contains 10 transmembrane domains. Relative quantitative analysis showed that NHX1 was expressed in root，stem and leaf tissues. The highest expression was found in leaves and the maximum expression was found at 48 hours after salt stress treatment. Subcellular localization of Agrobacterium 1300-cYFP-NHX1 transformed tobacco showed that it was localized to the cell membrane，and the protein expression was verified by western blot. The NHX1 gene is involved in the salt stress response and is relatively highly expressed in salt-tolerant materials. This study laid a foundation for the improvement of salt tolerance of legume forage.

Key words：Vicia villosa Roth.;NHX1;Gene cloning;Expression analysis

近年來土地資源調(diào)查顯示，中國鹽漬化土壤面積達1億hm2，是世界鹽漬土壤面積的十分之一［1］，這其中包括自然產(chǎn)生鹽漬化土壤以及人為灌溉、種植、開采致使部分地區(qū)土壤鹽堿化。土壤鹽分的增加對植物形成脅迫，限制植物生長發(fā)育，并通過離子毒害、滲透脅迫、破壞營養(yǎng)平衡等方式影響植物光合作用、蛋白質(zhì)合成等重要生理活動［2-4］。一方面，大量 Na+積累于細胞膜及細胞器膜，破壞膜結(jié)構(gòu)，使得細胞膜選擇透過性功能喪失，無法維持細胞穩(wěn)態(tài)，影響細胞正常代謝過程而造成鹽害；另一方面，大量 Na+的吸收一定程度上影響K+的吸收［5-7］。因此，解析植物通過維持離子穩(wěn)態(tài)應對鹽脅迫具有重要意義。

NHX（Na+/H+ antiporter）是一種細胞膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，它定位于質(zhì)膜和液泡膜上，通過逆濃度梯度運輸將細胞質(zhì)內(nèi)的Na+排出胞外或者區(qū)隔化到液泡中，減輕鹽脅迫對細胞的離子毒害［8-9］。植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白最早發(fā)現(xiàn)于大麥質(zhì)膜［10］。隨著研究者對非生物脅迫的關(guān)注，相繼從水稻（Oryza sativa L.）［11］、大麥（Hordeum vulgare L.）［12］、小麥（Triticum aestivum L.）［13］、玉米（Zea mays L.）［14］等植物中克隆到了NHX基因，且都證明其能夠緩解干旱及鹽堿等非生物脅迫對植物所造成的傷害，且不同物種NHX基因皆含有保守的Na+/H+交換結(jié)構(gòu)域，具有較高序列同源性。

冬箭筈豌豆（Vicia villosa Roth.）學名長柔毛野豌豆，也稱毛苕子、毛葉苕子、冬巢菜，是豆科野豌豆屬一年生草本植物。原產(chǎn)于北半球的溫帶地區(qū)例如歐洲北部，廣布于東西兩半球的溫帶，同時在中國栽培歷史悠久，廣泛種植于安徽、河南、四川、陜西、甘肅等省，是世界上栽培最早、在溫帶國家種植最廣的牧草和綠肥作物。冬箭筈豌豆在土壤pH 值6.9～8.9生長良好。莖葉柔軟，富含蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，無論鮮草或干草適口性均好，各類家畜喜采食［15］。其對改良土壤具有重要價值，也是鹽堿化土壤改良的優(yōu)選植物。但冬箭筈豌豆對于鹽脅迫的響應機制還有待探索。因此，本研究以冬箭筈豌豆為材料克隆其耐鹽相關(guān)基因，旨在探究冬箭筈豌豆在基因?qū)用娴哪望}機制，為改良豆科牧草耐鹽性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用試驗材料來自于國家草種質(zhì)資源庫和中國農(nóng)科院草原所牧草種質(zhì)中期庫。從前期12個冬箭筈豌豆種質(zhì)材料中篩選出1個耐鹽性較強的材料（12346）和敏鹽性材料（02197）。試驗材料于人工氣候室栽培。每個材料隨機選擇100粒種子，于蒸餾水中浸泡24 h，后置于帶有濾紙的培養(yǎng)皿中放入培養(yǎng)箱中萌發(fā)，培養(yǎng)條件為：16 h光照，溫度25℃，濕度40%，光照360 mol·m-2·s-2。萌發(fā)6天后，將幼苗移入水培箱中，使用1/2 hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)4周后進行200 mmol·L-1 NaCL脅迫處理，于脅迫后0 h，8 h，4 h，36 h，48 h，72 h剪取冬箭筈豌豆根、莖、葉材料，使用錫紙包裹后置于-80℃保存?zhèn)溆?。后使用備存材料總RNA，進行RT-PCR驗證，克隆產(chǎn)物通過大腸桿菌感受態(tài)DH5ɑ、農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101、利福平（Rif）和卡那霉素（Kan）連接載體p1300-cYFP，利用4周齡煙草為材料進行瞬時轉(zhuǎn)染。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 試驗使用RNAsimple Total RNA Kit 總RNA提取試劑盒（DP419，天根，北京）提取冬箭筈豌豆鹽脅迫后不同時間根、莖、葉組織總RNA，經(jīng)微量核酸蛋白分析儀（Nano Drop ONEC）檢驗RNA濃度及純度，通過一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑Fasting gDNA Dispelling RT SuperMix，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（KR118，天根，北京）。根據(jù)豌豆NHX基因CDS序列設(shè)計克隆引物擴增冬箭筈豌豆NHX1基因全長。

1.2.2 冬箭筈豌豆NHX1基因克隆 以鹽脅迫處理48 h耐鹽材料根組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中豌豆NHX基因CDS序列設(shè)計克隆引物，擴增冬箭筈豌豆NHX1基因全長。引物序列利用SnapGene 6.0.2設(shè)計（表1）?？偡磻w系25 μL，包括1 μL cDNA模板，12.5 μL 2×Phanta Max Master Mix，各1 μL上下游引物，9.5 μL ddH2O。PCR反應程序為：95℃ 3 min；95℃ 15 s，56.6℃ 15 s，72℃ 1 min共35個循環(huán)；72℃延伸5 min［16-17］。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209，天根，北京）回收目的條帶，利用pEASY-Blunt Zero Cloning Kit克隆試劑盒（CB501-01，全式金，北京）連接克隆載體及膠回收產(chǎn)物并涂抗性LB板，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆進行PCR，選擇陽性克隆轉(zhuǎn)化搖菌，使用質(zhì)粒小提試劑盒（DP103-02，天根，北京）提取質(zhì)粒并測序。

1.2.3 近緣物種NHX1基因編碼區(qū)同源性分析 將冬箭筈豌豆NHX1基因CDS序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫，用BLAST工具進行同源比對，下載大豆等9個物種NHX1基因氨基酸序列，用MEGA11對10個同源物種NHX1基因編碼區(qū)進行分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 冬箭筈豌豆NHX1基因編碼蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析 利用ExPASy預測不同物種的NHX1蛋白原子總數(shù)、氨基酸數(shù)量、等電點、分子量、親水系數(shù)及不穩(wěn)定系數(shù)。使用NCBI中的Structure分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域。用PRABI中的SOPMA進行冬箭筈豌豆NHX1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測、SWISS-MODEL預測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)、SAVESv 6.0評估蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型，并用軟件Pymol對功能位點進行三維立體結(jié)構(gòu)繪制。

1.2.5冬箭筈豌豆NHX1基因相對表達分析 根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計qPCR引物（表1），以鹽脅迫后0 h，8 h，24 h，36 h，48 h，72 h冬箭筈豌豆根、莖、葉材料cDNA為模板，使用Talent qPCR PreMix（SYBR Green）熒光定量檢測試劑盒（FP209-02），根據(jù)2-ΔΔCt法計算冬箭筈豌豆NHX1基因經(jīng)歷鹽脅迫后在不同組織中的相對表達量。

1.2.6 1300-cYFP-NHX1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草及亞細胞定位 本試驗使用SpeI酶對p1300-cYFP載體進行單酶切反應，使用Clon ExpressⅡ One Step Cloning Kit（C112-01，諾唯贊，南京）連接片段化載體與目的基因，于PCR儀中37℃控溫30 min連接，NHX1-YFP連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)，配置MES侵染液（500 μL 1 mol·L-1 MgCl2，500 μL 1 mol·L-1 MES，50 μL 200 mmol·L-1AS、48.95 超純水）注入4周齡煙草葉片背部，培養(yǎng)2 d后取直徑5 mm大小葉片于尼康共聚焦顯微鏡下觀察拍照［18］。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡 將經(jīng)過侵染的煙草葉片避開主葉脈剪下，于液氮中研磨成粉置于1.5 m離心管中，加入等量2×SDS loading buffer渦旋混勻提取蛋白，取上清液及彩色蛋白Marker各20 μL打入預制膠膠孔中，120 V電壓電泳1 h。結(jié)束后凝膠反向置于PVDF膜之下，覆蓋濾紙和海綿后于4℃100 V條件下轉(zhuǎn)膜90 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后PVDF膜置于孵育盒中加入GFP抗體封閉液及HRP標記山羊抗小鼠的封閉液孵育，中途使用1×TBST緩沖液清洗，最后滴加適量BeyoECL Moon A液和B液的ECL混合工作液于曝光儀成像板上并拍照［19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬箭筈豌豆NHX1基因克隆

以冬箭筈豌豆幼苗200 mmol·L NaCl溶液脅迫48 h根部材料cDNA為模板，克隆到全長為1 728 bp的NHX1基因，共編碼546個氨基酸（圖1）。

2.2 近緣物種同源序列分析

2.2.1 多序列對比分析 將冬箭筈豌豆與大豆等9個近緣物種的NHX1基因編碼區(qū)的氨基酸序列進行對比。結(jié)果如圖2顯示，10個近緣物種NHX1基因氨基酸序列相似度最高達91.85%，并且含有相同的保守結(jié)構(gòu)域。使用MEGA11對冬箭筈豌豆等10個同源物種NHX1基因編碼區(qū)進行分析（圖3）。所有材料NHX1基因編碼蛋白經(jīng)聚類分析分為兩類，大豆（Glycine max （L.）Merr.）、豇豆（Vigna unguiculata （L.） Walp.）、綠豆（Vigna radiata （L.） R. Wilczek）及相思豆（Abrus precatorius）為一類，剩余物種被進一步分為2個亞類，鷹嘴豆（Cicer arietinum Linn.）屬于其中一個亞類，第二亞類被分為3類，冬箭筈豌豆（Vicia villosa Roth.）與豌豆（Vicia sativa L.）、白花三葉草（Trifolium repens L.）、紫花苜蓿（Medicago sativa L.）和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula），說明冬箭筈豌豆與豌豆同源性較高，親緣關(guān)系較近。

2.2.2 冬箭筈豌豆及其近緣物種NHX1蛋白理化性質(zhì)分析 使用ExPASy對各近緣物種進行理化分析，結(jié)果見表2。冬箭筈豌豆及大豆等物種NHX1基因的CDS序列在1 626 bp～1 641 bp之間，最多編碼546個氨基酸，分子量大小在59.59～60.32 KDa。其次，冬箭筈豌豆（Vicia villosa Roth.）、紫花苜蓿（Medicago sativa L.）、白花三葉草（Trifolium repens L.）、豌豆（Pisum sativum L.）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、鷹嘴豆（Cicer arietinum Linn.）等電點分別為8.10，7.71，7.74，7.68，7.71，8.09，皆為堿性蛋白，而大豆（Glycine max （L.）Merr.）、綠豆（Vigna radiata （L.） R. Wilczek）、豇豆（Vigna unguiculata （L.） Walp.）、相思豆（Abrus precatorius） 等電點均小于7，為酸性蛋白。此外，各物種親水系數(shù)皆為正值且不穩(wěn)定系數(shù)小于40，說明他們都是疏水、穩(wěn)定蛋白。

2.3 NHX1蛋白結(jié)構(gòu)預測

冬箭筈豌豆NHX1蛋白二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果如圖4所示：該蛋白結(jié)構(gòu)中α螺旋（Helix）占比45.42%，涵蓋248個氨基酸；延伸鏈（Sheet）占比16.85%，涵蓋92個氨基酸；β轉(zhuǎn)角（Turn）占比3.66%，涵蓋20個氨基酸；無規(guī)則卷曲（Coil）占比34.07%，由186個氨基酸構(gòu)成，預測結(jié)果表明α螺旋及無規(guī)則卷曲為NHX1蛋白主要二級結(jié)構(gòu)。蛋白三級結(jié)構(gòu)預測如圖4所示。

2.4 NHX1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析

通過TMHMM在線工具對冬箭筈豌豆NHX1蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)域分析（圖5），該蛋白具有10個跨膜結(jié)構(gòu)域，且跨膜螺旋中預期氨基酸數(shù)量達224.040 6個，同時，使用SignalP-6.0預測冬箭筈豌豆NHX1蛋白不存在信號肽，因此該蛋白為非分泌性跨膜蛋白。

2.5 冬箭筈豌豆NHX1基因相對表達分析

基于克隆NHX1基因序列設(shè)計qPCR引物，并參考豌豆（Pisum sativum L.）［20］選擇Actin基因作為內(nèi)參，對冬箭筈豌豆耐鹽及敏鹽材料鹽脅迫不同時間段后NHX1基因的特異性表達進行相對定量分析。根據(jù)圖6所示，耐鹽材料NHX1基因的表達主要在葉中，且在鹽脅迫后48 h達到最大值。（耐鹽材料NHX1基因在根、莖、葉中均有表達，且莖與葉的表達先后于鹽脅迫后36 h，48 h達到最大值，但表達量均高于根部。同時，鹽脅迫后72 h，根部表達量迅速下降，而葉和莖中的表達量雖有下降，但仍遠高于根部表達量；敏鹽材料鹽脅迫后NHX1基因的表達明顯上升（但遠低于耐鹽材料）。總體而言，NHX1基因在耐鹽材料中的表達量高于敏鹽材料，說明NHX1基因參與了冬箭筈豌豆對鹽脅迫的響應。

2.6 冬箭筈豌豆NHX1亞細胞定位及蛋白印跡

將NHX1基因克隆質(zhì)粒與p1300-cYFP連接構(gòu)建過表達載體NHX1-YFP，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染煙草，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。如圖7所示，p1300-cYFP表達正常，冬箭筈豌豆NHX1基因的綠色熒光與細胞膜marker紅色熒光融合，表明冬箭筈豌豆NHX1基因定位于細胞膜。使用蛋白印跡法驗證NHX1在煙草中的表達，如圖8所示，冬箭筈豌豆NHX1蛋白大小為60.32 KDa。

3 討論

Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白作為植物響應非生物脅迫的重要離子轉(zhuǎn)運蛋白，通過Na+，K+與H+的跨膜離子交換，維持細胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)，是CPA家族重要成員之一［21］。目前已在擬南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）［22］、水稻（Oryza sativa L.）［23］、大麥（Hordeum vulgare L.）［24］等植物中鑒定并驗證了NHX基因功能。

本文通過PCR技術(shù)克隆冬箭筈豌豆NHX1基因全長，并將其與9個近緣物種進行序列比對，發(fā)現(xiàn)他們同時屬于CPA1家族并都具有Na+/H+交換保守結(jié)構(gòu)域，擬南芥［22］AtNHX1由12個跨膜結(jié)構(gòu)域及親水C末端結(jié)構(gòu)組成，跨膜區(qū)域呈螺旋狀均為疏水區(qū)，為Na+，H+交換提供場所，跨膜疏水區(qū)域有部分并未跨過液泡膜，而是存在一個能夠抑制NHX基因表達的氨氯吡嗪脒結(jié)合位點（amiloride binging-site）高度保守序列，大豆（Glycine max （L.） Merr.）［16］、紫花苜蓿（Medicago sativa L.）等物種NHX1基因氨基酸序列同樣具有上述保守結(jié)構(gòu)域和位點，且皆為疏水性蛋白；李霞等［25］從濱豇豆（Vigna marina （Burm.） Merr.）中克隆出的VmNHX基因，其結(jié)構(gòu)主要為α螺旋，覆蓋50%氨基酸。9個同源物種均具有相同結(jié)構(gòu)，說明這些同源物種與冬箭筈豌豆NHX1在基因結(jié)構(gòu)及蛋白功能上存在高度相似性，推測具有相同蛋白功能。此外，NHXs蛋白家族通常含有9～12個跨膜結(jié)構(gòu)域，包含疏水N端及親水C端，它們都具有調(diào)節(jié)蛋白活性的功能，不同之處在于，N端為高度保守區(qū)域，它的缺失會導致Na+/H+轉(zhuǎn)運功能下降，Na+/K+轉(zhuǎn)運活性增加；C末端高度分化，一旦缺失會引起Na+/H+，Na+/K+轉(zhuǎn)運活性增加［26］，并且C端的多樣性構(gòu)成是NHXs家族內(nèi)部基因存在差異的主要原因。

冬箭筈豌豆NHX1定位于細胞膜，與濱豇豆VmNHX定位結(jié)果一致［25］；對木麻黃（Casuarina equisetifolia L.）NHX基因家族進行定位預測發(fā)現(xiàn)NHX1有 12%的可能表達于質(zhì)膜［27］，藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）中的46個NHX蛋白多數(shù)定位于細胞膜及液泡［28］，大豆［16］及紫花苜蓿GmNHX1，MsNHX1定位于液泡膜，可能由于基因C端的多樣性導致物種相同基因發(fā)揮功能位點不同。

相對定量分析結(jié)果表明，冬箭筈豌豆NHX1基因在根、莖、葉組織中均有表達，但表達量體現(xiàn)出明顯差異：葉組織中表達量最高，且耐鹽型和敏鹽型冬箭筈豌豆表達量差異顯著。耐鹽材料中表達量葉大于莖大于根，敏鹽材料中根大于莖大于葉。隨著鹽脅迫時間的增加，8 h時NHX1基因表達量高于24 h，兩材料均于36 h～48 h達到峰值，之后有所下降。對大豆［16］品種‘翼豆7號進行200 mmol·L-1 NaCl處理，發(fā)現(xiàn)NHX1基因在葉中表達量明顯高于根部；紫花苜蓿［17］經(jīng)過相似鹽脅迫后該基因在葉部也呈現(xiàn)高表達；石榴NHX1基因在根部的表達呈現(xiàn)出了脅迫前期下降，后上升的趨勢［29］；處于干旱脅迫下的蠶豆NHX1基因葉組織的表達量明顯高于根，本研究與以上結(jié)果基本一致［30］。

鹽脅迫初期，植物受到滲透脅迫影響，外部鹽溶液壓高于根細胞滲透壓，導致細胞脫水，氣孔關(guān)閉，葉片生長受限［31］。隨著鹽脅迫時間增加，胞內(nèi)Na+富集，特別是對于芽造成毒害，抑制植物生長；同時，Na+的增加使得其他必須金屬陽離子例如K+，Ca2+減少，打破Na+/ K+平衡，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)及選擇透過性，進而影響植物正常代謝活動［32］。此外，滲透脅迫及離子脅迫會激發(fā)植物氧化應激反應產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS），降解植物生長發(fā)育所需蛋白質(zhì)及代謝物，破壞細胞膜、細胞器穩(wěn)定性，抑制光合作用及生物合成和營養(yǎng)物質(zhì)運輸［33］，致使脅迫后期植物體內(nèi)合成大量抗氧化酶降低ROS對植物體的生長發(fā)育影響，更好的適應鹽脅迫環(huán)境［8，34］，也有研究表明氨基酸、脯氨酸、肌醇等物質(zhì)的合成可增強植物耐鹽性［35-36］。但是以合成大分子物質(zhì)的方法適應鹽脅迫需大量消耗能量，仍然不利于植物正常生長發(fā)育，因此對于大多數(shù)植物來說以無機離子為滲透劑將其吸收、運輸、區(qū)隔化可能是應對鹽脅迫的較為經(jīng)濟的策略。植物利用鈣依賴蛋白激酶途徑，即SOS途徑進行鹽脅迫信號傳導及Na+運輸：EF-hand鈣結(jié)合蛋白SOS3感知到由鹽脅迫引起的胞質(zhì)鈣信號后，SOS3與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶互作并激活SOS2，進而激活質(zhì)膜上Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白SOS1，SOS1在根表皮細胞及木質(zhì)部薄壁細胞中表達，促進Na+外排，并將Na+通過木質(zhì)部經(jīng)過蒸騰作用長距離運輸?shù)饺~片［37］，。HKT1是另一個重要轉(zhuǎn)運蛋白，能夠?qū)a+從木質(zhì)部中排出，限制蒸騰流中Na+的含量［38］，HKT1似乎限制了SOS1基因發(fā)揮功能。從鹽脅迫嚴重程度來看，初期脅迫激活木質(zhì)部薄壁細胞SOS1，將Na+輸送到葉片中，促進NHX1基因的表達，NHX屬于單價陽離子-質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運子（CPA）亞家族，能夠跨膜轉(zhuǎn)運Na+、K+以交換H+或?qū)⑵鋮^(qū)隔入液泡中，維持細胞離子穩(wěn)態(tài)，避免離子毒害［39］；脅迫后期葉片Na+儲存能力達到上限，需HKT1將Na+重新循環(huán)至根部并由SOS1將Na+從根木質(zhì)部排除［37］。因此，植物通過相關(guān)基因表達應對鹽脅迫的復雜機制為耐鹽品種培育奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

研究通過PCR技術(shù)從冬箭筈豌豆中克隆了NHX1基因，CDS序列長度1 641 bp，編碼541個氨基酸，與所考察的9個近緣物種在序列比對、基因理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)及功能上存在較高相似性；相對定量分析表明NHX1基因參與冬箭筈豌豆鹽脅迫響應機制，在葉中表達量顯著高于莖和根，為今后豆科植物耐鹽基因研究及抗鹽品種選育提供參考。

參考文獻

［1］ 楊勁松，姚榮江，王相平，等. 中國鹽漬土研究：歷程、現(xiàn)狀與展望［J］. 土壤學報，2022，59（1）：10-27

［2］ 李偉.鹽脅迫下擬南芥與鹽芥顯微及超微結(jié)構(gòu)的比較研究［D］. 哈爾濱：東北林業(yè)大學，2014：1-2

［3］ 廖巖，彭友貴，陳桂珠. 植物耐鹽性機理研究進展［J］. 生態(tài)學報，2007（5）：2077-2089

［4］ 劉云芬，彭華，王薇薇，等. 植物耐鹽性生理與分子機制研究進展［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2019，47（12）：30-36

［5］ 楊曉慧，蔣衛(wèi)杰，魏珉，等. 植物對鹽脅迫的反應及其抗鹽機理研究進展［J］. 山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2006（2）：302-305，12308

［6］ 李彥，張英鵬，孫明，等. 鹽分脅迫對植物的影響及植物耐鹽機理研究進展［J］. 中國農(nóng)學通報，2008（1）：258-265

［7］ 王東明，賈媛，崔繼哲. 鹽脅迫對植物的影響及植物鹽適應性研究進展［J］. 中國農(nóng)學通報，2009，25（4）：124-128

［8］ MUNNS R，TESTER M. Mechanisms of salinity tolerance［J］. Annual Review of Plant Biology，2008，59：651-81

［9］ 李靜，劉明，孫晶，等. Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白NHX基因的研究進展［J］. 大豆科學，2011，30（6）：1035-1039

［10］ARIEL R，BENJAMIN J. Effect of K+，its Counter Anion，and pH on Sodium Efflux from Barley Root Tips［J］. Journal of Experimental Botany，1976，27（5）：843-852

［11］FUKUDA A，NAKAMURA A，YOSHIYUKI T. Molecular cloning and ex-pression of the Na+/H+ exchanger gene in Oryza sativa［J］. Bio-chimica et Biophysica Acta，1999，1446（1-2）：149-155

［12］FUKUDA A，CHIBA K，MAEDA M，et al. Effect of salt and osmotic stresses on the expression of genes for the vacuolar H+-pyrophosphatase，H+-ATPase subunit A，and Na+/H+ antiporter from barley［J］. Journal of Experimental Botany，2004，55（397）：585-594

［13］BRINI F，GAXIOLA R A，BERKOWITZ G A，et al. Cloning and characterization of a wheat vacuolar cation /proton antiporter and pyrophosphatase proton pump［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2005，43（4）：347-354

［14］ZORB C，NOLL A，KARL S，et al. Molecular characterization of Na+/H+antiporters（ZmNHX） of maize （Zea mays L.） and their expression under salt stress［J］. Journal of Plant Physiology，2005，162（1）：55-66

［15］王建光. 牧草飼料作物栽培學［M］. 第二版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2018：242-243

［16］范龍，孫天杰，楊郡，等. 大豆GmNHX1基因克隆及其在酵母中的耐鹽性分析［J］. 河北農(nóng)業(yè)大學學報，2015，38（6）：7-12，24

［17］安寶燕，羅琰，李加瑞，等. 紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因在擬南芥中表達提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性［J］. 作物學報，2008（4）：557-564

［18］KRISHNAMURTHY P，VIAHAL B，KHOO K，et al. Expression of AoNHX1 increases salt tolerance of rice and Arabidopsis，and bHLH transcription factors regulate AtNHX1 and AtNHX6 in Arabidopsis［J］. Plant Cell Reports，2019，38（10）：1299-1315

［19］MISHRA M，TIWARI S，GOMES A V. Protein purification and analysis：next generation Western blotting techniques［J］. Expert Review of Proteomics，2017，14（11）：1037-1053

［20］FAROOQ M，AHMAD R，SHAHZAD M，et al. Real-time expression and in silico characterization of pea genes involved in salt and water-deficit stress［J］. Molecular Biology Reports，2023，51（1）：18

［21］MURER H，HOPFER U，KINNE R. Sodium/proton antiport in brush-border-membrane vesicles isolated from rat small intestine and kidney［J］. Biochemical Journal，1976，154（3）：597-604

［22］TABATA S，KANEKO T，NAKAMURA Y，et al. Sequence and analysis of chromosome 5 of the plant Arabidopsis thaliana［J］. Nature，2000，408（6814）：823-826

［23］ATSUNORI F，ATSUKO N，YOSHIYUKI T. Molecular cloning and expression of the Na+/H+exchanger gene in Oryza sativa［J］. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Structure and Expression，1999，1446（1/2）：149-155

［24］ERSHOV P V，VASEKINA A V，VOBLIKOVA V D. et al. Identification of K+/H+ antiporter homolog in barley：Expression in cultivars with different tolerance to NaCl［J］. Russ Journal of Plant Physiol，2007，54：16-24

［25］李霞，孔丹宇，劉傳鑫，等. 濱豇豆VmNHX基因克隆與表達分析［J/OL］. 分子植物育種，2024，22（2）：402-413

［26］YAMAGUCHI T，APSE M P，SHI H，et al. Topological analysis of a plant vacuolar Na+/H+ antiporter reveais a luminal C terminus that regulates antiporter cation selectivity［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2003，100（21）：12510-12515

［27］艾迪，魏永成，孟景祥，等. 木麻黃NHX基因家族的鑒定及鹽脅迫下的表達分析［J］. 西北植物學報，2023，43（5）：750-760

［28］張業(yè)猛，朱麗麗，陳志國. 藜麥NHX基因家族鑒定及鹽脅迫下表達分析［J］. 生物技術(shù)通報，2022，38（12）：184-193

［29］ANTONELLA C，LORENZO C，ELISA P，et al. Can the transcriptional regulation of NHX1，SOS1 and HKT1 genes handle the response of two pomegranate cultivars to moderate salt stress？：Salt-tolerance of two pomegranate cultivars［J］. Scientia Horticulturae，2021，288：4238

［30］武學霞. 蠶豆鈉氫離子反向轉(zhuǎn)運體NHX1參與干旱脅迫響應的分子機制研究［D］. 西寧：青海大學，2021：12-23

［31］HORIE T，KARAHARA I，KATSUHARA M. Salinity tolerance mechanisms in glycophytes：An overview with the central focus on rice plants［J］. Rice，2012，5（1）：11

［32］DEZHI W，QIUFANG S，SHENGGUAN C，et al. Ionomic Responses and Correlations Between Elements and Metabolites Under Salt Stress in Wild and Cultivated Barley［J］. Plant and Cell Physiology，2013，54（12）：1976-1988

［33］黃小芳，石培禮，余成群，等. 非生物脅迫下牧草抗逆性研究進展［J］. 草地學報，2023，31（5）：1293-1301

［34］ZHU J K. Plant salt tolerance［J］. Trends in Plant Science，2001，6（2）：66-71

［35］WU D，CAI S，CHEN M，et al. Tissue metabolic responses to salt stress in wild and cultivated barley［J］. Public Library of Science One，2013，8（1）：e55431

［36］趙美榮，申玉華，李永春，等. 紫花苜蓿抗逆基因工程研究進展［J］. 草地學報，2014，22（2）：243-248

［37］ZHU J K. Abiotic stress signaling and responses in plants［J］. Cell，2016，167（2）：313-324

［38］HUAZHONG S，F(xiàn)RANCICO J，JOSE M，et al. The putative plasma membrane Na+/H+ antiporter SOS1 controls long-Distance Na+ transport in plants［J］. The Plant Cell，2002，14（2）：465-477

［39］PU L，LIN R，ZOU T，et al. Genome-Wide Identification，Primary Functional Characterization of the NHX Gene Family in Canavalia rosea，and Their Possible Roles for Adaptation to Tropical Coral Reefs［J］. Genes-Basel， 2021，13（1）：33

（責任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2024-03-04；修回日期：2024-03-28

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金重點項目（2023ZD07）；內(nèi)蒙古自治區(qū)種業(yè)創(chuàng)新重大示范工程項目（2022 JBGS00400303）資助

作者簡介：

姚娜（1998-），女，漢族，內(nèi)蒙古烏海人，碩士研究生，主要從事草種質(zhì)資源與育種研究，E-mail：m18847319047_1@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：yunlan@imau.edu.cn