王文祎 趙衛(wèi)濤 孫希 楊金申 楊瑤珺

【摘 要】

目的：比較藥典標(biāo)準(zhǔn)凝血酶滴定法和白瓷板法對(duì)中藥水蛭抗凝活性檢測(cè)結(jié)果的影響。方法：分別采用《中國(guó)藥典》中凝血酶滴定法和云南省《菲牛蛭凍干粉中藥飲片炮制規(guī)范征求意見(jiàn)稿》中白瓷板法對(duì)水蛭抗凝活性進(jìn)行多次平行滴定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：抗凝活性成分含量較高的菲牛蛭其藥典法滴定結(jié)果重復(fù)性更穩(wěn)定，白瓷板滴定法結(jié)果的重復(fù)性會(huì)隨著單次進(jìn)樣量減少而趨于穩(wěn)定；寬體金線蛭的抗凝活性結(jié)果在兩種方法的對(duì)比檢測(cè)下均較為穩(wěn)定。結(jié)論：對(duì)于吸血水蛭品種抗凝活性的測(cè)量，建議保留原凝血酶滴定法；對(duì)于抗凝活性較低，實(shí)驗(yàn)中凝血酶溶液濃度較小的水蛭品種，兩種滴定法均適用，也可同時(shí)應(yīng)用互相驗(yàn)證。另在滴定操作中，將反應(yīng)試管改換成玻璃液相進(jìn)樣瓶，且在滴定動(dòng)作后將反應(yīng)容器呈一定角度傾斜放置，有助于對(duì)反應(yīng)終點(diǎn)進(jìn)行判斷，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

【關(guān)鍵詞】

水蛭；菲牛蛭；白瓷板滴定法；抗凝活性

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2024）07-0023-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.07.zgmzmjyyzz202407006

Comparison of Two Titration Methods for Detecting the Anticoagulant Activity of Hirudo

WANG Wenyi1，2 ZHAO Weitao2 SUN Xi1 YANG Jinshen2 YANG Yaojun1*

1.School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China；

2. Hollzhipharm （Yunnan） Co.， Ltd， Kunming 650199 China

Abstract：

Objective To compare the effect of pharmacopeia standard thrombin titration and white porcelain plate method on the anticoagulant activity of leech. Methods The thrombin titration method in the Chinese Pharmacopoeia and the white porcelain plate method in the Opinions Draft of Processing Specifications for Poecilobdella Manillensis Lesson. Freeze-dried Powder of Traditional Chinese Medicine in Yunnan Province were used to conduct several parallel titration experiments on the anticoagulant activity of leech. Results The repeatability of the pharmacopeia titration results of Poecilobdella Manillensis with higher content of anticoagulant active ingredients was more stable. The repeatability of the titration results of the white porcelain plate titration was regional stable with the decrease of the single injection volume. The results of anticoagulant activity of the Whitmania pigra Whitman. are stable under the comparison of the two methods. Conclusion For the measurement of anticoagulant activity of blood-sucking leech varieties， it is recommended to retain the thrombin titration method in the Chinese Pharmacopoeia. For leech species with low anticoagulant activity and small thrombin solution concentration in the experiment， both titration methods are applicable， and mutual verification can also be applied at the same time. In addition， in the titration operation， the reaction test tube was changed into a glass liquid injection bottle， and the reaction container was placed at a certain Angle after the titration operation， which was helpful to judge the reaction end point and improve the accuracy and stability of the experimental results.

Keywords：

Hirudo; Poecilobdella Manillensis Lesson.; White Porcelain Plate Titration Method; Anticoagulant Activity

中藥水蛭為水蛭科動(dòng)物螞蟥（寬體金線蛭，Whitmania pigra Whitman.）、水蛭（日本醫(yī)蛭，Hirudo nipponica Whitman.）或柳葉螞蟥（尖細(xì)金線蛭，Whitmania acranulata Whitman.）的干燥全體［1-2］；菲牛蛭為醫(yī)蛭科動(dòng)物菲牛蛭（馬尼擬醫(yī)蛭，Poecilobdella Manillensis Lesson.）的干燥全體［2-3］，被《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（云YNZYC-0357-2013）和《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》［4］（DYB45-GXYYC0106-2021）收錄，其凍干粉炮制品又被《云南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)》（云YBPZ-0199-2013）［5］收錄。以上4種水蛭均有破血痛經(jīng)、逐瘀消癥等功效，是我國(guó)目前使用較為普遍的活血化瘀中藥品種。

為評(píng)價(jià)水蛭活血化瘀能力，中國(guó)藥典和地方標(biāo)準(zhǔn)均以抗凝血酶活性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其含量測(cè)定方法均參照1970年Markwardt報(bào)道的凝血酶測(cè)定法［6］制定，其原理是根據(jù)1個(gè)單位水蛭素抗凝血酶活力中和1個(gè)單位凝血酶測(cè)得樣品中所含水蛭素量。該方法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、反應(yīng)迅速、終點(diǎn)敏銳。但對(duì)于終點(diǎn)判斷的主觀性較強(qiáng)，導(dǎo)致其準(zhǔn)確度和重復(fù)性不夠理想。萬(wàn)明等［7］提出以白瓷板作為滴定載體，其終點(diǎn)結(jié)果更易觀察；劉義梅等［8］通過(guò)兩種方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為白瓷板滴定法結(jié)果更為準(zhǔn)確，且樣品濃度、凝血酶濃度、滴定間隔時(shí)間等因素對(duì)于檢測(cè)結(jié)果均有影響。張利等［9-10］考察了待測(cè)樣品提取方式、提取溫度、供試液pH值等因素對(duì)結(jié)果的影響，且通過(guò)限定反應(yīng)時(shí)間。滴定后攪動(dòng)次數(shù)更精細(xì)化了滴定操作過(guò)程細(xì)節(jié)以提升實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性。而云南省食品藥品監(jiān)督管理局在2022年10月發(fā)布的《菲牛蛭凍干粉中藥飲片炮制規(guī)范征求意見(jiàn)稿》中，關(guān)于菲牛蛭凍干粉抗凝活性物質(zhì)的滴定載體也由藥典的試管修改為白瓷板。以上一系列的研究與改進(jìn)均說(shuō)明藥典標(biāo)準(zhǔn)滴定方法，影響其結(jié)果的因素較多，改進(jìn)的空間較大。

本實(shí)驗(yàn)以寬體金線蛭藥材和菲牛蛭凍干粉為樣品，參照《中國(guó)藥典》和云南地標(biāo)的滴定法，以及云南2022年發(fā)布的“征求意見(jiàn)稿”改進(jìn)后的白瓷板法，對(duì)兩種滴定方法進(jìn)行考察，并對(duì)其反應(yīng)現(xiàn)象進(jìn)行分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，上海力辰邦西儀器科技有限公司）；電子天平（FA2004 d=0.0001 g，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）；pH值測(cè)量?jī)x（PH-100，浙江力辰儀器科技有限公司）；超聲儀（DK-80 上海致高精密儀器有限公司）；移液器（100～1000μL，0.5～10μL，艾本德公司）。

1.2 材料 菲牛蛭凍干粉［樣品1，華治醫(yī)藥（元江）有限公司提供；樣品2，云南玉藥生物制藥有限公司提供］；螞蟥（寬體金線蛭）藥材（樣品3，安國(guó)藥材市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，北京中醫(yī)藥大學(xué)楊瑤珺教授鑒定）；纖維蛋白原（批號(hào)：140626-202012，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；凝血酶（批號(hào)：140625-202013，每瓶含凝血酶1070 U，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；鹽酸（西隴化工股份有限公司）；三羥甲基甲烷（上海韶遠(yuǎn)試劑有限公司）；氯化鈉（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；純化水。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備 取供試品粉末（過(guò)三號(hào)篩），寬體金線蛭取樣約1g（本實(shí)驗(yàn)實(shí)際取樣量為1.0000g），菲牛蛭凍干粉取樣約0.25g（本實(shí)驗(yàn)實(shí)際取樣量為樣品1取樣0.2496g，樣品2取樣0.2495g），精密稱(chēng)定，精密加入0.9%氯化鈉溶液，寬體金線蛭加入5mL，菲牛蛭加入15mL，超聲提取30 min，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 測(cè)定法

2.2.1 藥典標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法 精密量取續(xù)濾液100μL，置試管中，加入含0.5%纖維蛋白原（以凝固物計(jì)）的三羥甲基氨基鹽酸緩沖液［注1］（臨用配制）200μL，搖勻，置水浴中（37±0.5）℃溫浸5min，滴加凝血酶溶液［注2］（臨用配制，寬體金線蛭滴加濃度為每1mL中含10單位的凝血酶溶液，每4min滴加2μL；菲牛蛭滴加濃度為每1mL中含40單位的凝血酶溶液，每1min固定滴加2～5μL），邊滴加邊輕輕搖勻至凝固（或有凝固物出現(xiàn)），記錄消耗凝血酶溶液的體積，按公式［注3］計(jì)算。

2.2.2 白瓷板滴定法 將白瓷點(diǎn)滴板浸于37℃水浴中，精密加入供試品溶液100μL與含0.5%纖維蛋白原（以凝固物計(jì)）的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液［注1］（臨用配制）200μL，用攪拌針輕輕攪動(dòng)搖勻，滴加每凝血酶溶液［注2］（臨用配制，寬體金線蛭滴加濃度為每1mL中含10單位的凝血酶溶液，每4min滴加2μL；菲牛蛭滴加濃度為每1mL中含40單位的凝血酶溶液，每1min固定滴加2～5μL），并用攪拌針輕輕攪動(dòng)搖勻，以最后加入凝血酶溶液混勻反應(yīng)1 min后，用攪拌針能挑到絲狀或塊狀凝固物為滴定終點(diǎn)（凝血酶溶液滴定體積控制在10～30μL內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間控制在10 min以?xún)?nèi)，如不在此范圍內(nèi)應(yīng)重新稀釋樣品或換管重滴），記錄消耗凝血酶溶液的體積。按公式［注3］計(jì)算。

［注1］三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液的配制：取0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液25mL，與0.1mol/L鹽酸溶液約40mL，加水至100mL，調(diào)節(jié)pH值至7.4。

［注2］凝血酶溶液的配制：取凝血酶試劑適量，加生理鹽水配制成每1mL含凝血酶10個(gè)（滴定寬體金線蛭）或40個(gè)（滴定菲牛蛭）單位的溶液。

［注3］水蛭抗凝活性計(jì)算公式如下：

U=C1V1/C2V2

U為每1g樣品含抗凝血酶活性單位，U/g；

C1為凝血酶溶液的濃度，μ/mL；

C2為供試品溶液的濃度，g/mL；

V1為消耗凝血酶溶液的體積，μL；

V2為供試品溶液的加入量，μL；

中和1個(gè)單位的凝血酶的量，為1個(gè)抗凝血酶活性單位（U）。

3 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)菲牛蛭樣品在滴定過(guò)程中均進(jìn)行了進(jìn)樣量分別為5μL、4μL、3μL、2μL的嘗試，兩種滴定法對(duì)水蛭抗凝活性檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)下表1。

3.1 菲牛蛭標(biāo)準(zhǔn)滴定法實(shí)驗(yàn)分析 從兩個(gè)菲牛蛭凍干粉樣品的滴定結(jié)果來(lái)看，在同一人的操作前提下，藥典標(biāo)準(zhǔn)滴定法的結(jié)果重復(fù)性較好。本實(shí)驗(yàn)除樣品2單次進(jìn)樣量為5μL只做了2次平行外，2個(gè)凍干粉樣品其余單次進(jìn)樣量均做了6次平行，且每種進(jìn)樣量的平行結(jié)果相同，說(shuō)明同一人操作時(shí)，每次實(shí)驗(yàn)其對(duì)于反應(yīng)終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)基本趨同。且本實(shí)驗(yàn)法待測(cè)樣品反應(yīng)時(shí)的結(jié)果呈現(xiàn)比較典型穩(wěn)定，因此每個(gè)樣品相同進(jìn)樣量的不同次實(shí)驗(yàn)其結(jié)果均一致，但縱向比較同一樣品不同進(jìn)樣量的檢測(cè)結(jié)果又發(fā)現(xiàn)，樣品最終抗凝活性結(jié)果差異很大，樣品1的最大最小值差可達(dá)約96個(gè)活性單位；樣品2則達(dá)到約120個(gè)活性單位。筆者認(rèn)為，菲牛蛭這個(gè)品種的抗凝血活性本身很高，根據(jù)中國(guó)藥典的規(guī)定，不吸血的寬體金線蛭（螞蟥）和尖細(xì)金線蛭（柳葉螞蟥）的抗凝活性不得低于3U/g，日本醫(yī)蛭（水蛭）不得低于16U/g，而現(xiàn)行云南標(biāo)準(zhǔn)對(duì)與菲牛蛭藥材活性要求則是不低于60U/g，對(duì)于菲牛蛭凍干粉則不低于200U/g。新規(guī)征求意見(jiàn)稿更是將標(biāo)準(zhǔn)提高到不低于240U/g，并將700U/g作為活性上限。為在較短時(shí)間內(nèi)盡快得出結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)中用來(lái)滴定反應(yīng)的凝血酶溶液濃度較高，且制備供試液時(shí)樣品提取液較為稀釋。以云南現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)單次進(jìn)樣量為5μL為例，每滴定1次，即需要中和120U的凝血酶，這個(gè)數(shù)值的浮動(dòng)空間是很大的。本實(shí)驗(yàn)在5μL滴定2次，即中和掉240 U的凝血酶溶液后，尚未達(dá)到終點(diǎn)，滴定3次后才出現(xiàn)凝固，說(shuō)明樣品待測(cè)液活性在240～360U/g之間，同理，在進(jìn)樣量為4μL、3μL、2μL時(shí)，樣品1的活性結(jié)果誤差區(qū)間分別在約288～384U/g、216～288U/g、240～288U/g。隨著單次進(jìn)樣量的減少，結(jié)果浮動(dòng)范圍越小，結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，但滴定次數(shù)和實(shí)驗(yàn)時(shí)間會(huì)相應(yīng)延長(zhǎng)，根據(jù)之前的研究結(jié)論來(lái)看，又會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響，這或許解釋了本實(shí)驗(yàn)中樣品1在單次進(jìn)樣量為4μL時(shí)，滴定3次并未出現(xiàn)凝固，而進(jìn)樣量為3μL、2μL時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，終點(diǎn)也發(fā)生變化的現(xiàn)象。同理樣品2在進(jìn)樣量為4μL和3μL與2μL時(shí)的終點(diǎn)差異也是因反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而產(chǎn)生的影響。

3.2 菲牛蛭白瓷板滴定法實(shí)驗(yàn)分析 從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，每個(gè)進(jìn)樣的平行實(shí)驗(yàn)中，均有判定終點(diǎn)到來(lái)時(shí)滴定次數(shù)不一致，即消耗凝血酶單位數(shù)量不相同的情況發(fā)生，且單次進(jìn)樣量越多，平行結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差越大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果越不穩(wěn)定。同時(shí)橫向?qū)Ρ人幍錁?biāo)準(zhǔn)中滴定法來(lái)看，單次進(jìn)樣量越多，兩種方法的滴定結(jié)果差異越大。

分析其差異原因，筆者認(rèn)為，藥典標(biāo)準(zhǔn)方法是在試管中進(jìn)行反應(yīng)，液面表面積較小，滴定動(dòng)作后通過(guò)振搖的方式能迅速且均勻地將濃度較大的凝血酶溶液稀釋分散到供試液中，客觀因素也提升了本法在平行檢測(cè)過(guò)程中的穩(wěn)定重現(xiàn)性；而白瓷板本身較淺，供試液在白瓷板中表面積較大，滴定后又需要較尖細(xì)的攪拌針來(lái)輔助分散，從單人操作的層面就已經(jīng)增加了難度。用細(xì)針?lè)稚⒒靹虻男时静患罢駬u，且筆者在實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)，濃度較高的凝血酶溶液在滴入白瓷板供試液時(shí)，會(huì)出現(xiàn)供試液于凝血酶注入?yún)^(qū)域迅速產(chǎn)生結(jié)塊或絲狀物，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)因“假陽(yáng)性”現(xiàn)象而提前出現(xiàn)，而根本原因可能僅僅是攪拌不夠及時(shí)與均勻，或滴定瞬時(shí)局部濃度太高未來(lái)得及分散形成的凝結(jié)。而兩個(gè)菲牛蛭樣品白瓷板實(shí)驗(yàn)數(shù)值隨著單次進(jìn)樣量的減少，其標(biāo)準(zhǔn)差也隨之減小，平行結(jié)果趨于穩(wěn)定的結(jié)果也同樣可用上述分析進(jìn)行解釋。

另一方面，纖維蛋白原結(jié)構(gòu)也有其特殊性，在藥典滴定方法中，若對(duì)供試液進(jìn)行劇烈搖晃，則可能會(huì)破壞其原有內(nèi)部結(jié)構(gòu)，提前出現(xiàn)液體渾濁或不再隨著凝血酶溶液的添加而凝固，因此不論是纖維蛋白原溶液在配制過(guò)程中，還是與凝血酶溶液解除后的振搖混勻，都要求實(shí)驗(yàn)人員要?jiǎng)幼骶徛?，幅度小，力道輕，以避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果失真。而白瓷板滴定法則需要工具介入到反應(yīng)液內(nèi)進(jìn)行攪拌，這個(gè)過(guò)程是否會(huì)對(duì)供試液原有結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，進(jìn)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定或不準(zhǔn)確，也有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 寬體金線蛭兩種滴定方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比 通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難看出，兩種滴定方法對(duì)于抗凝活性較低的寬體金線蛭幾乎沒(méi)有影響，分析原因如下。

首先，寬體金線蛭的供試液濃度高。通過(guò)前文，寬體金線蛭和菲牛蛭供試液提取條件可看出，寬體金線蛭的取樣量為1g，是菲牛蛭的4倍；提取溶劑添加量為5mL，為菲牛蛭的1/3，供試液的濃度已相差12倍。此外，滴定時(shí)藥典規(guī)定寬體金線蛭對(duì)供試液滴加的凝血酶溶液濃度為10 U/mL，是菲牛蛭的1/4，且單次規(guī)定進(jìn)樣量為2μL，是菲牛蛭現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的2/5，在反應(yīng)環(huán)節(jié)每滴定一次中和凝血酶的量又與菲牛蛭相差10倍，綜合整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，兩個(gè)品種的實(shí)驗(yàn)濃度相差120倍。供試液與凝血酶溶液的濃度反差也使兩種方法下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不穩(wěn)定性的概率增加，因此相比之下，寬體金線蛭的藥典標(biāo)準(zhǔn)滴定法和白瓷板滴定法結(jié)果均較穩(wěn)定且一致。

3.4 白瓷板滴定法的發(fā)展 一般說(shuō)到中藥水蛭白瓷板滴定法，大多會(huì)追溯到萬(wàn)明等［7］2012年發(fā)表的文獻(xiàn)，其本身是為比較幾種對(duì)中藥水蛭不同提取方式對(duì)其抗凝活性的影響，并輔以APTT（活化部分凝血活酶時(shí)間）試劑盒法進(jìn)行驗(yàn)證；2014年劉義梅等［8］將白瓷板法與藥典操作進(jìn)行對(duì)比，還進(jìn)一步考察可能影響檢測(cè)結(jié)果的因素，如滴定間隔時(shí)間、凝血酶濃度等，完善了滴定體系。以上研究成果為白瓷板法運(yùn)用到水蛭抗凝活性效價(jià)的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)，但文獻(xiàn)均是以供試液凝固的時(shí)長(zhǎng)作為比較指標(biāo)，并未體現(xiàn)出藥典法對(duì)抗凝活性單位的直接判斷，且供試液制備過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)、步驟多，并不能較快速地對(duì)一批樣品進(jìn)行處理并得出結(jié)果。2017年張利等［9-10］學(xué)者的研究將藥典中供試液的制備方法和抗凝活性評(píng)價(jià)指標(biāo)引入白瓷板法，并通過(guò)對(duì)影響因素的考察較為直觀地便顯出兩種滴定方法在檢測(cè)結(jié)果上的差異，提出操作改進(jìn)建議。2022年云南省“征求意見(jiàn)稿”也將藥典凝血酶滴定法改為白瓷板法，并通過(guò)調(diào)整凝血酶溶液進(jìn)樣量、限定實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間等方式力求檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.5 關(guān)于水蛭抗凝活性檢測(cè)的建議 本實(shí)驗(yàn)對(duì)同一樣品的兩種滴定方法進(jìn)行了較多重復(fù)次數(shù)的實(shí)驗(yàn)，從結(jié)果看，針對(duì)抗凝活性較高且實(shí)驗(yàn)中凝血酶溶液濃度較大的菲牛蛭來(lái)說(shuō)，白瓷板滴定法的穩(wěn)定性相比于藥典標(biāo)準(zhǔn)中滴定法較低。

一些研究認(rèn)為原藥典方法的反應(yīng)終點(diǎn)難以判斷，筆者經(jīng)過(guò)較多次實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，造成這個(gè)問(wèn)題的原因主要在于實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的載體和操作中的一些細(xì)節(jié)。原法在試管中進(jìn)行反應(yīng)，而試管也有材質(zhì)之分。筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察到，塑料材質(zhì)試管，因試管壁較厚，且內(nèi)徑較窄，供試液在管內(nèi)張力較大，會(huì)影響對(duì)其流動(dòng)性的判斷，再加之所料材質(zhì)的透明度較差，會(huì)綜合影響筆者從試管壁外觀察供試液是否有凝固的效果。相較于塑料材質(zhì)，管壁較薄且透明度好的玻璃試管觀察效果更佳，但同樣因?yàn)閮?nèi)徑較細(xì)，從直立到傾斜判斷其流動(dòng)性的觀察過(guò)程也會(huì)受到張力的影響而失真。

研究認(rèn)為，將反應(yīng)容器替換成平底的2mL左右大小的玻璃液相進(jìn)樣瓶為宜。相較于圓底的試管，在液相進(jìn)樣瓶中反應(yīng)會(huì)增加液體在底部的平展空間，一定程度還原了供試液的流動(dòng)性，同時(shí)在滴入凝血酶溶液并搖勻后，建議將反應(yīng)容器呈一定角度傾斜放置，下次滴定前先將容器直立判斷是否有凝固，這樣凝固初期的一些“掛壁”現(xiàn)象或供試液流動(dòng)性顯著降低的狀態(tài)就會(huì)相對(duì)敏銳地被實(shí)驗(yàn)人員捕捉到，也一定程度簡(jiǎn)化了判斷標(biāo)準(zhǔn)，提高了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性與效率。

3.6 小結(jié) 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析，筆者認(rèn)為當(dāng)凝血酶溶液濃度較高時(shí)，白瓷板滴定法會(huì)因滴入凝血酶溶液瞬間使供試液局部濃度過(guò)高而導(dǎo)致“假陽(yáng)性”凝固出現(xiàn)而影響檢測(cè)結(jié)果，故建議在檢測(cè)吸血品種菲牛蛭和日本醫(yī)蛭時(shí)，仍保留現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)滴定法為主要測(cè)定方法，并結(jié)合前文操作改進(jìn)方法，提升結(jié)果準(zhǔn)確度與穩(wěn)定性。若采取白瓷板法，則減少單次進(jìn)樣量或降低凝血酶溶液濃度，且通過(guò)多次平行實(shí)驗(yàn)得到相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)果。而不吸血的寬體金線蛭和尖細(xì)金線蛭本身抗凝活性較低，且滴定溶液凝血酶含量較低，故兩種方法均適用。為提升檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度，也可通過(guò)同一份樣品的兩種滴定方法互為驗(yàn)證。

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（收稿日期：2023-07-14 編輯：陶希睿）

基金項(xiàng)目：

作者簡(jiǎn)介：

王文祎（1990—），男，漢族，博士研究生在讀，研究方向?yàn)閯?dòng)物藥安全性評(píng)價(jià)、民族動(dòng)物藥。E-mail：13511026431@163.com

通信作者：

楊瑤珺（1969—），女，漢族，博士，教授、博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幤贩N及質(zhì)量鑒定、動(dòng)物類(lèi)中藥的安全性研究。E-mail：yangyaojunbucmtcm@163.com