楊琳　楊 帆　張杭穎　黃勃誠　邱清華　張君誠

關(guān)鍵詞：五指毛桃；補(bǔ)骨脂素；補(bǔ)骨脂素合成酶；基因表達(dá)；工藝優(yōu)化；含量

中圖分類號(hào)：S567.19 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

五指毛桃（Ficus hirta Vahl）是桑科榕屬植物，異形葉，葉互生，長橢圓狀葉（全緣葉）或有著3～5 深裂 （缺刻葉），表面覆粗硬絨毛，形似毛桃而得名[1]。因五指毛桃的根有椰奶的清香，又稱五指牛奶[1-2]。五指毛桃主要分布于廣西、廣東、海南等道地產(chǎn)區(qū)，在福建、云南、貴州等非道地產(chǎn)區(qū)也有分布[3]。五指毛桃性平味辛，可用于治療脾胃不適、肺癆咳嗽、風(fēng)濕盜汗等常見疾病，民間常用于煲湯、泡酒，香氣濃郁[2-5]。國家衛(wèi)生健康委員會(huì)將五指毛桃作為有傳統(tǒng)食用習(xí)慣的普通食品管理。

五指毛桃的提取物已被鑒定出了百余種成分[5-9]，包括香豆素類[7]、黃酮類[7]、酚類[8]、萜類[9]等，具有抗神經(jīng)炎癥[5]、抑菌保鮮[10]以及抗癌[11-12]等作用。采用超高效液相色譜–光電二極管陣列–質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-PAD-MS）檢測(cè)五指毛桃中的活性成分，其中香豆素類成分補(bǔ)骨脂素是最主要的活性成分，是判定藥用價(jià)值的一項(xiàng)重要指標(biāo)[13]。從五指毛桃根中分離的補(bǔ)骨脂素能有效抑制斷尾誘導(dǎo)的斑馬魚仔魚產(chǎn)生活性氧（ROS）和NO，可能是炎癥治療的潛在候選藥物[14]。

補(bǔ)骨脂素的合成途徑是苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶的作用下生成肉桂酸，然后在肉桂酸羥化酶、4-香豆酸輔酶A 連接酶的作用下形成4-香豆酰輔酶A，再形成二羥基肉桂酰輔酶A，通過自發(fā)內(nèi)酯化生成傘形花內(nèi)酯，然后在傘形酮6-戊烯基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成去甲基軟木花椒素，在異紫花前胡內(nèi)酯合成酶的作用下形成異紫花前胡內(nèi)酯，最后在補(bǔ)骨脂素合成酶的作用下形成補(bǔ)骨脂素[15-18]。因此，補(bǔ)骨脂素合成酶是補(bǔ)骨脂素合成的最后一個(gè)關(guān)鍵限速酶（圖1）。

為了進(jìn)一步豐富五指毛桃研究資料，本研究采用qPCR 和HPLC 技術(shù)測(cè)定不同五指毛桃種質(zhì)不同部位（主根、側(cè)根、缺刻葉、全緣葉、莖、果實(shí)）中補(bǔ)骨脂素合成酶基因（psoralen synthetase，PS）的相對(duì)表達(dá)量與補(bǔ)骨脂素含量，比較不同種質(zhì)和部位對(duì)五指毛桃補(bǔ)骨脂素含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

五指毛桃種子分別來自廣西和福建（以下簡(jiǎn)稱廣西五指毛桃和福建五指毛桃）。在福建省三明市莘口鎮(zhèn)（117°14?E，26°10?N，海拔300～400 m，向陽或半陽坡地）種植1 年。選取條件一致、長勢(shì)良好的五指毛桃主根、側(cè)根、缺刻葉、全緣葉、莖和果實(shí)，洗凈后，一部分置于液氮速凍，并于–70 ℃保存；另一部分置于烘干箱55 ℃烘干至恒重，打磨成粉狀，過60 目篩備用。分別設(shè)置至少3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取和cDNA 合成 參照全能型植物RNA 提取試劑盒（康為世紀(jì)，北京）和cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）說明書提取獲得五指毛桃根、莖、葉和果實(shí)的cDNA，備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 基于五指毛桃RNA-seq 結(jié)果，采用以Primer 5.0 設(shè)計(jì)五指毛桃PS 基因qPCR 引物5'-GGGACGGACACAACCTTCAT-3'/5'-TCTAGGGACCAAGACCGGAG-3'，擴(kuò)增片段為213 bp。

以Actin3 基因（引物分別為5'-TTAGACGTTGTGTAGCCAGCA-3'/5'-CTACTTGCGTTGTGATCCGG-3'）作內(nèi)參[19]，擴(kuò)增長度為174 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 熒光定量PCR 五指毛桃主根、側(cè)根、莖、全緣葉、缺刻葉、果實(shí)的cDNA 樣品稀釋至濃度一致，每個(gè)樣品3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。qPCR 反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 s，然后按94 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，延伸結(jié)束收集熒光，46 個(gè)循環(huán)；之后從50 ℃開始，以每步0.5 ℃的速度升溫至95 ℃，每個(gè)溫度保持5 s。最后用2^–ΔΔC_T法計(jì)算各樣品中PS 基因的相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行顯著性分析。

1.2.4 補(bǔ)骨脂素的提取 取五指毛桃樣品粉末，以料液比（A）、提取時(shí)間（B）和提取溫度（C）為變量超聲波提取，15 000 r/min，在4 ℃下離心15 min 后，用0.45 μm 針孔式過濾器過濾，取上清液。以高效液相色譜檢測(cè)的補(bǔ)骨脂素含量為判斷指標(biāo)，按表1 設(shè)計(jì)水平梯度，獲得五指毛桃最佳提取工藝后，以廣西和福建五指毛桃主根、側(cè)根、缺刻葉、全緣葉、莖和果實(shí)為材料，提取補(bǔ)骨脂素，獲得提取液，備用。

1.2.5 補(bǔ)骨脂素含量測(cè)定 根據(jù)王曉平等[20]的方法，采用Eclipse XDB-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），流動(dòng)相為乙腈–水（35∶65， V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長為245 nm。

在10 mL 容量瓶中加入5.40 mg 補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品粉末，并用甲醇進(jìn)行定容，得到補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品溶液母液。再取6 個(gè)相同的10 mL 容量瓶，準(zhǔn)確吸取補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL）定容。于0.45 μm 針孔濾器過濾后，按上述色譜條件測(cè)定峰值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

按上述色譜條件，吸取20 μm 補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行高效液相色譜實(shí)驗(yàn)。連續(xù)進(jìn)樣6 次，用峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，%），用于評(píng)價(jià)檢測(cè)儀器的精密度及可靠性。

取3 份五指毛桃樣品，分別按照其最佳提取條件加入樣品與甲醇的最佳料液比，然后用超聲提取進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算峰面積及其RSD，對(duì)檢測(cè)儀器的可靠性進(jìn)行判定。

精密吸取同一樣品溶液，按上述色譜條件，分別于1、2、4、8、12 h 用液相色譜儀測(cè)定含量，測(cè)得補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD，用來驗(yàn)證12 h 內(nèi)樣品溶液的穩(wěn)定性。

精密稱取五指毛桃根部粉末，按照最佳提取條件料液比例加入甲醇，經(jīng)超聲波提取，按上述色譜條件進(jìn)行樣品中補(bǔ)骨脂素含量的測(cè)定，再由補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出樣品中的含量。在3 份1 mL 樣品溶液中分別加入0.02、0.33、0.45 mg/mL 補(bǔ)骨脂素對(duì)照品各1 mL，利用超聲波儀器使2 種溶液按1∶1（V/V）混合均勻制成供試樣品溶液，用高效液相色譜儀測(cè)定其含量，并計(jì)算其回收率（%），回收率=（終測(cè)得含量-樣品中含量）/加入標(biāo)準(zhǔn)品的量×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，所得數(shù)據(jù)采用Excel2010 軟件進(jìn)行分析處理并制圖。使用SPSS v.18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)五指毛桃PS 基因表達(dá)和補(bǔ)骨脂素含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PS 基因相對(duì)表達(dá)量

通過qRT-PCR 檢測(cè)廣西和福建五指毛桃PS基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，PS 基因在2 個(gè)產(chǎn)地的五指毛桃根、莖、葉和果實(shí)中均有表達(dá)。將PS 基因在廣西五指毛桃主根的表達(dá)量設(shè)定為1，計(jì)算PS 基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，廣西五指毛桃PS 基因在側(cè)根中的相對(duì)表達(dá)量最高，分別是主根、全緣葉、缺刻葉、莖和果實(shí)的20.20、39.92、57.87、64.74、66.44 倍，差異均為極顯著（P<0.01，圖2A）。福建五指毛桃PS 基因在側(cè)根中的相對(duì)表達(dá)量最高，但僅為廣西五指毛桃側(cè)根表達(dá)量的0.167，分別是主根、全緣葉、缺刻葉、莖和果實(shí)的5.50、8.37、10.78、11.48、11.68 倍，差異均為極顯著（P<0.01，圖2B）。2 種五指毛桃主根和側(cè)根中的SP 基因相對(duì)表達(dá)量差距較大，廣西五指毛桃分別是福建五指毛桃的1.63 、6.00 倍（P<0.01），全緣葉、缺刻葉、莖和果實(shí)的SP 基因相對(duì)表達(dá)量相近，分別為1.26、1.12、1.07、1.06倍， 除全緣葉中的相對(duì)表達(dá)量差異極顯著（P<0.01）外，其余均無顯著性差異。

2.2 補(bǔ)骨脂素提取工藝優(yōu)化

2.2.1 試驗(yàn)水平與結(jié)果 對(duì)五指毛桃補(bǔ)骨脂素提取的料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)分析（表2）。根據(jù)極差值得出：C>B>A，即影響程度的主次順序依次為：提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比。從因素A 的k 值比較顯示：k₃>k₂>k_l，因此推斷出最優(yōu)料液比為A₃。同理確定最優(yōu)提取溫度為B₃，最優(yōu)提取時(shí)間為C₁。綜上篩選得出最優(yōu)組合為A₃B₃C₁，即液料比為l∶20（g/mL），提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為15 min。

2.2.2 方差分析 進(jìn)一步對(duì)正交試驗(yàn)提取結(jié)果和方差分析兩方面進(jìn)行分析（表3），結(jié)果表明，除因素C 以外其余二者的均方均小于誤差的均方，說明其余兩因素對(duì)結(jié)果無較大影響。3 個(gè)因素的P值分別為0.717、0.647、0.284，P>0.05，因此認(rèn)為料液比、提取溫度、提取時(shí)間三者均對(duì)五指毛桃補(bǔ)骨脂素提取量無顯著影響?？芍苯右罁?jù)正交試驗(yàn)結(jié)果的極差值判斷其最優(yōu)提取條件。

結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析得到最優(yōu)提取工藝為A₃B₃C₁，按照最優(yōu)提取條件驗(yàn)證，補(bǔ)骨脂素含量為2.6913 mg/g。

2.2.3 最優(yōu)提取工藝確認(rèn)與驗(yàn)證 結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析結(jié)果進(jìn)行綜合考慮，確定最佳提取工藝的料液比為l∶20（g/mL），提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為15 min。表明優(yōu)化五指毛桃補(bǔ)骨脂素提取工藝參數(shù)的方法有效可行。

2.3 補(bǔ)骨脂素含量測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在流動(dòng)相乙腈–水35∶65（V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長為245 nm 的條件下，測(cè)得補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，出峰時(shí)間在6～7 min之間。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=42 790x+35.397（r=0.9999）。五指毛桃樣品在6～7 min 內(nèi)也出現(xiàn)單一峰，與補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)峰值的時(shí)間一致，峰面積可用于計(jì)算五指毛桃補(bǔ)骨脂素含量。

2.3.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗(yàn) 使用補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品溶液6 次進(jìn)樣，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.05%，說明使用的儀器具有較好的精密度。同一批次3 份樣品的高效液相色譜峰面積值的RSD 為0.26%，表明此方法具有較好的重復(fù)性。通過12 h 內(nèi)5 個(gè)時(shí)間的樣品溶液測(cè)定發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD 小于2%，這說明在這12 h 內(nèi)，提取溶液中的補(bǔ)骨脂素具有良好的穩(wěn)定性。補(bǔ)骨脂素的加樣回收率的RSD 為1.78%，表明具有良好的回收率。

2.3.3 不同五指毛桃種質(zhì)補(bǔ)骨脂素含量的差異利用高效液相色譜法檢測(cè)不同五指毛桃種質(zhì)不同部位的補(bǔ)骨脂素含量，廣西五指毛桃補(bǔ)骨脂素含量高于福建五指毛桃， 含量范圍分別為0.002～3.206 mg/g 和0.001～2.947 mg/g。按補(bǔ)骨脂素含量排序?yàn)椋簜?cè)根>主根>全緣葉>缺刻葉>莖>果實(shí)。廣西五指毛桃中側(cè)根、主根、全緣葉、缺刻葉、莖和果實(shí)的補(bǔ)骨脂素含量占比分別為58.96%、39.28%、1.27%、0.40%、0.06%和0.04%。福建五指毛桃側(cè)根的補(bǔ)骨脂素含量占比高于廣西五指毛桃，為85.83%，但主根與側(cè)根含量的占比和（98.04%）與廣西五指毛桃（98.24%）相當(dāng)（圖3 ）。廣西五指毛桃側(cè)根補(bǔ)骨脂素含量最高為3.206 mg/g，比福建五指毛桃（2.947 mg/g）高0.259 mg/g（圖4A）。主根的補(bǔ)骨脂素含量?jī)H次于側(cè)根，廣西和福建五指毛桃主根的補(bǔ)骨脂素含量分別為2.136、0.419 mg/g（圖4B）。全緣葉的補(bǔ)骨脂素含量高于缺刻葉，廣西和福建五指毛桃全緣葉的補(bǔ)骨脂素含量分別為0.069、0.035 mg/g（圖4C）， 缺刻葉的補(bǔ)骨脂素含量分別為0.022、0.028 mg/g（圖4D）。2 個(gè)五指毛桃種質(zhì)莖的補(bǔ)骨脂素含量相似，均為0.003 mg/g（圖4E）。果實(shí)中的補(bǔ)骨脂素含量最低，廣西五指毛桃的補(bǔ)骨脂素含量含量為0.002 mg/g，福建五指毛桃的為0.001 mg/g（圖4F）。

2.4 相關(guān)性分析

通過對(duì)不同五指毛桃種質(zhì)不同部位中補(bǔ)骨脂素含量與PS 基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，五指毛桃補(bǔ)骨脂素含量與SP 基因表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.722）。其中，主根、側(cè)根、全緣葉、缺刻葉、莖和果實(shí)的補(bǔ)骨脂素含量與PS 基因表達(dá)量的r 分別為0.988、0.822、0.909、0.713、0.171、0.344，說明五指毛桃根和葉的補(bǔ)骨脂素含量與PS基因表達(dá)量的相關(guān)性較高，莖和果實(shí)的補(bǔ)骨脂素含量與PS 基因表達(dá)量相關(guān)性較低。廣西五指毛桃和福建五指毛桃的補(bǔ)骨脂素含量與PS 基因表達(dá)量均呈正相關(guān)，r 分別為0.819 和0.998。

3 討論

3.1 五指毛桃補(bǔ)骨脂素提取工藝優(yōu)化

五指毛桃是嶺南地區(qū)常用的藥食同源的藥材，其香味與藥效均與補(bǔ)骨脂素含量相關(guān)[7， 10]。補(bǔ)骨脂素為脂溶性成分，極性較低的溶劑易提取出油狀物，使用高濃度乙醇或甲醇溶劑提取，補(bǔ)骨脂素含量較高[3， 21]。本研究以甲醇超聲提取，從料液比、提取時(shí)間和提取溫度3 個(gè)因素水平優(yōu)化提取工藝，具有提取效率高、操作簡(jiǎn)單、節(jié)約時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，可為五指毛桃提取工藝的應(yīng)用提供方法學(xué)支持。

3.2 五指毛桃不同部位補(bǔ)骨脂素合成特征

五指毛桃因具有獨(dú)特藥效而被廣泛使用，常用于入藥的部分是其根部[1]。補(bǔ)骨脂素作為五指毛桃藥用價(jià)值質(zhì)量鑒定的一項(xiàng)有效指標(biāo)[10]，五指毛桃根部SP 基因的相對(duì)表達(dá)量和補(bǔ)骨脂素含量在各部位中具有顯著優(yōu)勢(shì)，且具有相關(guān)性。與傳統(tǒng)上以其根入藥相符。該結(jié)果與馬雅靜等[22]在五指毛桃的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中藥用部位根部顯著高于非藥用部位莖部的結(jié)果一致。五指毛桃葉的異性是由全緣葉向缺刻葉發(fā)展，有研究表明五指毛桃植物的葉裂數(shù)越多，其根部的補(bǔ)骨脂素含量越高[20， 23-24]，推測(cè)由全緣葉向缺刻葉發(fā)展，補(bǔ)骨脂素由葉向根部轉(zhuǎn)移。五指毛桃果實(shí)中的補(bǔ)骨脂素含量雖然較低，但有研究表明，果實(shí)分離出生物堿、倍半萜、黃酮等物質(zhì)具有良好的抗真菌活性，可抑制大部分柑橘果實(shí)的腐爛[14， 25]。

3.3 不同五指毛桃種質(zhì)的補(bǔ)骨脂素合成特征

五指毛桃在廣西、廣東等道地產(chǎn)區(qū)備受青睞，在福建、云南等非道地產(chǎn)區(qū)也多有應(yīng)用。不同五指毛桃種質(zhì)藥用部位根中的補(bǔ)骨脂素含量存在一定差異（0.419～3.206 mg/g）。廣西五指毛桃SP 基因的相對(duì)表達(dá)量（0.022～1.445）也高于福建五指毛桃（0.241～0.021）。說明道地產(chǎn)區(qū)廣西的五指毛桃中補(bǔ)骨脂素含量較高，質(zhì)量較好，該結(jié)果與梁梓悠等[3]的研究結(jié)果基本一致，且PS 基因表達(dá)量與產(chǎn)物含量的相關(guān)性均較高。

4 結(jié)論

五指毛桃中補(bǔ)骨脂素最佳提取工藝的料液比為l∶20（g/mL），提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為15 min。HPLC 檢測(cè)五指毛桃的補(bǔ)骨脂素具有良好的重現(xiàn)性，結(jié)果精確可靠。測(cè)得廣西五指毛桃的補(bǔ)骨脂素含量高于福建五指毛桃，其中側(cè)根含量最高，主根次之，全緣葉和缺刻葉含量低于根，但高于莖和果實(shí)。PS 基因在五指毛桃的各部位中均有表達(dá)，且表達(dá)具有特異性。PS 基因表達(dá)量與五指毛桃補(bǔ)骨脂素含量呈正相關(guān)。研究結(jié)果為解析PS 基因在五指毛桃補(bǔ)骨脂素合成中的作用提供參考。