蔡振璇 張城煉 許衛(wèi)攀

摘要目的：分析腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子5（TRAF5）對缺氧誘導(dǎo)心肌細胞損傷的影響及相關(guān)分子機制。方法：體外培養(yǎng)H9c2細胞，以800μmol/L濃度的二氯化鈷（CoCl2）處理細胞建立缺氧誘導(dǎo)心肌細胞損傷模型，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將TRAF5過表達質(zhì)粒（pcDNATRAF5）和空載質(zhì)粒（pcDNANC）轉(zhuǎn)染至缺氧誘導(dǎo)的H9c2細胞。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRTPCR）法檢測細胞TRAF5基因表達水平，細胞計數(shù)試劑盒（CCK8）檢測細胞存活率，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，試劑盒法檢測乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性及丙二醛（MDA）含量，蛋白免疫印跡（WesternBlot）法檢測細胞中TRAF5、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、磷酸化ERK（pERK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（pp38MAPK）、氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（pJNK）蛋白表達水平。結(jié)果：與Control組比較，Hypoxic組H9c2細胞中TRAF5mRNA和蛋白表達水平均降低，細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，細胞中LDH水平、MDA含量升高，SOD、GSHPx水平降低，細胞中pERK/ERK、pp38MAPK/p38MAPK、pJNK/JNK比值均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與Hypoxic組比較，Hypoxic＋pcDNATRAF5組H9c2細胞中TRAF5mRNA和蛋白表達水平均升高，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，細胞中LDH水平、MDA含量降低，SOD、GSHPx水平升高，細胞中pERK/ERK、pp38MAPK/p38MAPK、pJNK/JNK比值均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：TRAF5通過介導(dǎo)心肌酶活性和氧化應(yīng)激水平減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷，其作用機制可能與調(diào)控MAPK信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子5，TRAF5；心肌細胞損傷；氧化應(yīng)激；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.16721349.2024.06.010

急性心肌梗死（acutemyocardialinfarction，AMI）是一種因心肌缺血和缺氧而導(dǎo)致的具有高死亡率和嚴重并發(fā)癥的臨床急重癥，是世界范圍內(nèi)的一個重大公共衛(wèi)生問題。當前，臨床治療AMI在經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和抗血小板藥物方面取得了一些進展，但AMI病人心力衰竭的發(fā)生率仍然很高［12］。多項研究指出，持續(xù)缺氧是AMI后心肌細胞受損的主要原因，缺氧會導(dǎo)致心肌細胞發(fā)生炎癥、細胞凋亡、壞死和心肌重塑等一系列生理病理變化，從而介導(dǎo)心肌功能嚴重受損和心力衰竭發(fā)生［35］。抑制AMI后心肌細胞損傷是提高治療效果、改善病人預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，探索缺氧誘導(dǎo)心肌細胞損傷的分子機制可能會為AMI提供一種新的治療策略。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子5（tumornecrosisfactorreceptorassociatedfactor5，TRAF5）是腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF）家族的成員之一，TRAF5具有E3泛素連接酶的活性，可通過其受體激活TNF誘導(dǎo)的核因子κB（NFκB）通路參與細胞生物學過程［6］。TRAF5基因缺陷促進脂肪組織炎癥及加重飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖［7］。在心肌缺血再灌注（myocardialischemiareperfusioninjury，I/R）損傷過程中，TRAF5敲除加重I/R小鼠心臟損傷、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，而TRAF5過表達抑制I/R刺激的心肌細胞炎癥和凋亡［8］。此外，TRAF5缺乏通過激活絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MEK）/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路而促進心肌肥厚和纖維化［9］。然而，TRAF5在AMI中發(fā)揮作用的研究報道較少。本研究旨在探討TRAF5在缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷中的作用及相關(guān)作用機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

心肌細胞H9c2購自武漢普諾賽生命科技有限公司；純度≥97%的二氯化鈷（CoCl2）購自上海源葉生物科技有限公司；TRAF5過表達質(zhì)粒（pcDNATRAF5）和空載質(zhì)粒（pcDNANC）均購自基因科技（上海）股份有限公司；乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatinekinase，CK）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSHPx）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒均購自江蘇科惟生物技術(shù)有限公司；細胞計數(shù)試劑盒（cellcountingkit8，CCK8）、人膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（AnnexinVfluorescinisothiocyanate/propidiumiodide，AnnexinVFITC/PI）凋亡檢測試劑盒均購自愛必信（上海）生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRTPCR）試劑盒均購自北京諾博萊德科技有限公司；放射免疫沉淀分析（radioimmunoprecipitationassay，RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白定量試劑盒、增強化學發(fā)光試劑（enhancedchemiluminescence，ECL）均購自武漢博爾夫生物科技有限公司；兔抗TRAF5、MEK、p38絲裂原活化蛋白激酶（p58MAPK）、磷酸化p38MAPK（pp38MAPK）、氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（pJNK）、β肌動蛋白（βactin）一抗以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司。

MCO15AC型恒溫培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；FACSVerse流式細胞儀購自美國BD公司；ST360多功能酶標儀購自上?？迫A生物工程股份有限公司；ChemiDocTouch化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國BioRad公司；Accurate96qRTPCR儀購自北京信鈺儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

將心肌細胞H9c2置于含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃下、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞貼壁生長達到80%左右時，收集心肌細胞進行實驗。

1.2.2缺氧細胞模型建立、細胞轉(zhuǎn)染及分組

實驗分為對照組（Control組）、缺氧組（Hypoxic組）、缺氧＋空載質(zhì)粒對照組（Hypoxic＋pcDNANC組）、缺氧＋TRAF5過表達組（Hypoxic＋pcDNATRAF5組）。其中Control組H9c2細胞正常培養(yǎng)12h；Hypoxic組H9c2細胞用800μmol/L濃度的CoCl2處理12h；Hypoxic＋pcDNANC組H9c2細胞轉(zhuǎn)染pcDNANC質(zhì)粒48h后用800μmol/L濃度的CoCl2處理12h；Hypoxic＋pcDNATRAF5組H9c2細胞轉(zhuǎn)染pcDNATRAF5質(zhì)粒48h后用800μmol/L濃度的CoCl2處理12h。使用LipofectamineTM2000試劑盒進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3qRTPCR法檢測細胞TRAF5mRNA表達

使用Trizol試劑從H9c2細胞中提取總RNA，以紫外分光光度計測量RNA純度和濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進行qRTPCR擴增。引物序列：TRAF5正向引物為5′CACTCCGTGCTTCACAAC3′，反向引物為5′AAGGTGGTCCTGGAATCG3′；甘油醛3磷酸脫氫酶（glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase，GAPDH）正向引物為5′ATCACTGCCACCCAGAAG3′，反向引物為5′TCCACGACGGACACATTG3′。反應(yīng)條件（40次循環(huán)）：95℃60s，95℃40s，60℃40s，72℃30s。使用GAPDH作為內(nèi)部對照基因，以2－△△Ct法計算目的基因相對表達水平。

1.2.4CCK8法檢測細胞存活率

收集處理后的細胞，將細胞稀釋至3×105個/mL并按每孔100μL接種到96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，每孔加入10μL用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的CCK8溶液，混勻后，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，用酶標儀測量450nm處各孔的吸光度（absorbance，A），計算細胞存活率，細胞存活率＝A處理組/A對照組×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況

收集處理后的細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞兩次，以500μL結(jié)合緩沖液重懸細胞調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，取100μL細胞懸液加入5μL的AnnexinVFITC溶液和10μL的PI溶液，室溫下避光孵育15min，采用流式細胞儀進行檢測，計算細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.2.6試劑盒法測定細胞中LDH、SOD、GSHPx活性及MDA含量

收集處理后的H9c2細胞，根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書進行實驗，檢測細胞中LDH、SOD、GSHPx活性及MDA含量。

1.2.7蛋白免疫印跡法（WesternBlot）檢測細胞中相關(guān)蛋白表達

使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取細胞中總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白質(zhì)通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1h后，在4℃下用TRAF5（1∶1000）、ERK（1∶800）、pERK（1∶800）、p38MAPK（1∶800）、pp38MAPK（1∶800）、JNK（1∶800）、pJNK（1∶800）、βactin（1∶1000）一抗孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5min，將膜與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶2000）在室溫下孵育2h，TBST洗滌3次，每次5min，隨后用ECL發(fā)光液顯影，以βactin為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析。

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSDt檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染后各組H9c2細胞中TRAF5表達水平比較

與Control組比較，Hypoxic組H9c2細胞中TRAF5mRNA和蛋白表達水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Hypoxic組比較，Hypoxic＋pcDNANC組H9c2細胞中TRAF5mRNA和蛋白表達水平變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Hypoxic＋pcDNATRAF5組H9c2細胞中TRAF5mRNA和蛋白表達水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖1～圖3。

2.2TRAF5過表達對缺氧誘導(dǎo)的H9c2細胞存活率和凋亡率的影響

與Control組比較，Hypoxic組H9c2細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Hypoxic組比較，Hypoxic＋pcDNANC組H9c2細胞存活率和細胞凋亡率變化差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Hypoxic＋pcDNATRAF5組H9c2細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖4～圖6。

2.3TRAF5過表達對缺氧誘導(dǎo)的H9c2細胞中LDH水平的影響

與Control組比較，Hypoxic組H9c2細胞中LDH水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Hypoxic組比較，Hypoxic＋pcDNANC組H9c2細胞中LDH水平變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Hypoxic＋pcDNATRAF5組H9c2細胞中LDH水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖7。

2.4TRAF5過表達對缺氧誘導(dǎo)的H9c2細胞中氧化應(yīng)激水平的影響

與Control組比較，Hypoxic組H9c2細胞中SOD、GSHPx水平均降低，MDA含量升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Hypoxic組比較，Hypoxic＋pcDNANC組H9c2細胞中SOD、GSHPx、MDA水平變化差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Hypoxic＋pcDNATRAF5組H9c2細胞中SOD、GSHPx水平均升高，MDA含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.5TRAF5過表達對缺氧誘導(dǎo)的H9c2細胞中MAPK信號通路的影響

與Control組比較，Hypoxic組H9c2細胞中pERK/ERK、pp38MAPK/p38MAPK、pJNK/JNK比值均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Hypoxic組比較，Hypoxic＋pcDNANC組H9c2細胞中pERK/ERK、pp38MAPK/p38MAPK、pJNK/JNK比值變化差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Hypoxic＋pcDNATRAF5組H9c2細胞中pERK/ERK、pp38MAPK/p38MAPK、pJNK/JNK比值均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖8、圖9。

3討論

TRAF家族是一個關(guān)鍵的適應(yīng)因子家族，存在于哺乳動物和多細胞生物中，迄今為止，已經(jīng)確定了TRAF家族的7名成員（TRAF1～7），其中TRAF5因其結(jié)構(gòu)的特殊性，可作為連接細胞表面受體和細胞內(nèi)信號通路的細胞質(zhì)銜接蛋白，調(diào)控多種信號通路，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細胞增殖和凋亡、自噬和細胞因子合成等許多生物學過程［1011］。有研究報道，TRAF5能夠與腫瘤壞死因子（TNF）受體的細胞質(zhì)部分結(jié)合，介導(dǎo)下游核因子κB（NFκB）、干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和MAPK信號通路［12］。TRAF5還負性調(diào)節(jié)B淋巴細胞中的Toll樣受體信號［13］。Teng等［14］研究表明，過表達miRNA4103p通過靶向TRAF5保護缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。Cai等［15］研究表明，上調(diào)miR29b3p通過靶向TRAF5保護缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。這些研究結(jié)果均提示TRAF5參與缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷，但TRAF5參與缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的相關(guān)分子機制尚未完全清楚。本研究結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)的H9c2細胞中TRAF5表達下降，同時，H9c2細胞存活率下降，凋亡率增加。TRAF5過表達則能夠提高細胞存活率、降低細胞凋亡率。該結(jié)果表明TRAF5對缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞具有保護作用。

LDH是人體能量代謝過程中的一種重要酶，幾乎存在于肝臟、腎臟、心肌、骨骼肌、胰腺和肺等所有組織中。當組織壞死發(fā)生時，血液中的LDH水平會升高。LDH常被用作心肌壞死的輔助診斷標志物［16］。心肌損傷時LDH水平升高，LDH水平降低則提示心肌損傷得到改善［17］。氧化應(yīng)激是心肌缺血缺氧損傷時的病理生理學標志，持續(xù)的低氧可誘導(dǎo)心肌中活性氧（ROS）的產(chǎn)生。而高水平的ROS會導(dǎo)致心肌細胞凋亡，并激活多個不良級聯(lián)反應(yīng)，進一步導(dǎo)致心肌細胞功能障礙［18］。因此，抗氧化指標SOD、GSHPx、MDA水平也用于評估氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細胞損傷［19］。Tang等［20］研究表明，缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞中MDA含量增加，SOD、GSHPx活性相應(yīng)降低，而升高抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量，提高心肌細胞抗氧化能力，能夠明顯減少心肌細胞凋亡，改善缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。本研究中，缺氧誘導(dǎo)的H9c2細胞中SOD、GSHPx活性下降，LDH活性和MDA含量升高。該結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞存在氧化應(yīng)激反應(yīng)。而缺氧誘導(dǎo)的H9c2細胞中TRAF5過表達時，細胞中SOD、GSHPx水平均升高，LDH活性和MDA含量降低，提示TRAF5過表達可能通過調(diào)控細胞內(nèi)心肌酶活性和氧化應(yīng)激反應(yīng)保護缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。

MAPK通路是細胞內(nèi)識別并響應(yīng)細胞外刺激的特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，主要包括p38MAPK、ERK和JNK通路。ERK通路與細胞增殖、轉(zhuǎn)化和分化相關(guān)，而JNK和p38MAPK通路則參與細胞凋亡、癌基因轉(zhuǎn)化以及炎癥反應(yīng)等［2122］。MAPK通路在心血管疾病中被激活，參與細胞存活和受損心肌細胞凋亡的恢復(fù)［23］。心肌發(fā)生缺血缺氧損傷時，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致MAPK級聯(lián)的激活。在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷中JNK和p38MAPK信號通路被激活，抑制JNK和p38MAPK通路可保護心肌細胞免受缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的損傷［24］。也有研究報道，阻斷MAPK信號通路能夠有效保護H9c2細胞免受鈷氯酸鹽誘導(dǎo)的缺氧損傷［25］。既往研究證實，TRAF5可通過介導(dǎo)MAPK通路參與黑色素瘤發(fā)展和經(jīng)典豬瘟病毒復(fù)制［2627］。TRAF5還通過靶向JNK信號通路調(diào)控肝臟脂肪變性［28］。這些研究結(jié)果均表明TRAF5可通過調(diào)控MAPK通路介導(dǎo)疾病發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)的H9c2細胞中p38MAPK、ERK及JNK磷酸化水平均升高，表明MAPK通路激活參與缺氧誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷。TRAF5過表達明顯降低了缺氧誘導(dǎo)H9c2細胞中p38MAPK、ERK及JNK磷酸化水平。提示TRAF5可能通過抑制MAPK通路激活減輕缺氧誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷。

綜上所述，TRAF5參與缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷，TRAF5過表達可通過調(diào)控心肌酶活性和氧化應(yīng)激反應(yīng)保護缺氧誘導(dǎo)的心肌損傷，其作用機制可能與調(diào)控MAPK通路活性有關(guān)。TRAF5有望成為AMI治療的新靶點。

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（收稿日期：20220901）

（本文編輯郭懷?。?/p>

基金項目湖北省衛(wèi)生健康委青年人才項目（No.WJ2019Q011）

作者單位黃石市中心醫(yī)院/湖北理工學院附屬醫(yī)院（湖北黃石435000）

通訊作者張城煉，Email：466122457@qq.com

引用信息蔡振璇，張城煉，許衛(wèi)攀.腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子5對缺氧誘導(dǎo)心肌細胞損傷的影響及作用機制研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（6）：10211026.