張彩鳳 張棟 李旭成 周勇 周芳

摘要目的：探討大蒜素對缺血性腦卒中（IS）大鼠血管新生和神經(jīng)保護的影響以及對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路的調(diào)控機制。方法：將90只無特定病原體（SPF）級SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組（12mg/kg尼莫地平）、大蒜素低劑量組（大蒜素25mg/kg）、大蒜素高劑量組（大蒜素50mg/kg）、大蒜素高劑量＋VEGF抑制劑組［50mg/kg大蒜素＋5mg/kg貝伐單抗（Bmab）組］，每組15只。Morris水迷宮檢測各組大鼠認知功能；2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）染色檢測腦梗死面積；蘇木精伊紅（HE）染色觀察海馬組織病理形態(tài)；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素1β（IL1β）、神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）水平；免疫組化法檢測海馬組織中血小板內(nèi)皮細胞黏附分子（CD31）蛋白表達和微血管密度（MVD）；蛋白免疫印跡（WesternBlot）法檢測海馬組織中血管生成素1（Ang1）、VEGF、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（pERK1/2）蛋白的表達。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)紊亂，細胞間隙變大，逃避潛伏期、腦梗死面積、TNFα、IL1β水平升高（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)、NGF、BDNF水平、CD31陽性細胞數(shù)量、MVD、Ang1、VEGF蛋白表達及pERK1/2/ERK1/2降低（P＜0.05）。與模型組相比，陽性對照組、大蒜素高劑量組、大蒜素低劑量組大鼠海馬組織形態(tài)恢復(fù)，細胞間隙縮小，逃避潛伏期、腦梗死面積、TNFα、IL1β水平降低（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)、NGF、BDNF水平、CD31陽性細胞數(shù)量、MVD、Ang1、VEGF蛋白表達及pERK1/2/ERK1/2增加（P＜0.05）。大蒜素高劑量＋Bmab可抑制大蒜素作用，與大蒜素高劑量作用相反。結(jié)論：大蒜素可能通過激活VEGF/MAPK/ERK通路促進缺血性腦卒中大鼠的血管新生，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

關(guān)鍵詞缺血性腦卒中；大蒜素；血管內(nèi)皮生長因子；絲裂原活化蛋白激酶；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；血管新生；神經(jīng)保護；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.16721349.2024.06.013

缺血性腦卒中（ischemicstroke，IS）是導(dǎo)致殘疾和死亡最常見的主要原因之一，通常會造成毀滅性的腦損傷，其主要是由于腦部血流量暫時或永久的缺失，導(dǎo)致氧氣和葡萄糖水平下降、能量不足、組織梗死及其周圍微血管密度增加［12］。因此，研究IS的治療方法不僅需要恢復(fù)神經(jīng)元，還需要促進整個神經(jīng)血管的生成［3］。血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是血管發(fā)育的關(guān)鍵因子，能夠刺激血管的生成。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellularregulatedproteinkinases，ERK）為絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedproteinkinases，MAPKs）家族的關(guān)鍵成員，MAPK/ERK信號通路在多種生物活動中發(fā)揮不可或缺的作用［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF能夠介導(dǎo)MAPK/ERK信號通路，從而影響血管生成以及IS后的抑郁癥狀［56］。大蒜素（allicin）是從大蒜中提取出來的一種防御分子，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用，同時也可作為一種神經(jīng)保護劑，具有改善認知功能障礙的作用［7］。大蒜素已經(jīng)被證實能夠保護缺血再灌注腦損傷的神經(jīng)損傷，并促進腦梗死周圍的血管生成［8］。但其中的作用機制尚不清楚，因此，本研究建立IS大鼠模型，探討大蒜素其血管新生和神經(jīng)保護的影響以及作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠90只，6周齡，體質(zhì)量160～200g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（湘）20190017。

1.2實驗藥品及試劑

大蒜素購自四川省維克奇生物科技有限公司；尼莫地平購自北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20054248；VEGF抑制劑貝伐單抗（Bmab）均購自美國MedChemExpress公司；2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液購自北京普非生物科技有限公司；蘇木精伊紅（HE）染液購自北京伊塔生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素1β（IL1β）、神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自上海酶研生物科技有限公司；血小板內(nèi)皮細胞黏附分子（CD31）、血管生成素1（Ang1）、VEGF、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（pERK1/2）一抗購自英國Abcam生物公司；山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗購自武漢菲恩生物科技有限公司。

1.3大鼠模型制備

參照文獻［9］中大腦中動脈栓塞（MCAO）方法制備IS大鼠模型，用1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，對頸部進行剃毛和消毒，在頸部中間位置做切口，分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈。然后將尼龍縫合線穿入頸內(nèi)動脈中，以阻斷右側(cè)大腦中動脈血的供應(yīng)，2h后拔出縫合線恢復(fù)供血，手術(shù)過程中保持大鼠體溫在37℃左右。假手術(shù)組不使用縫合線插入，其余步驟相同。

1.4分組及給藥

將造模后的大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組（尼莫地平組）、大蒜素低劑量組、大蒜素高劑量組、大蒜素高劑量＋VEGF抑制劑組（大蒜素高劑量＋Bmab組），每組15只。假手術(shù)組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，陽性對照組灌胃給藥12mg/kg的尼莫地平［10］，大蒜素低劑量組、高劑量組分別灌胃給藥25mg/kg、50mg/kg的大蒜素［8］，大蒜素高劑量＋Bmab組先灌胃50mg/kg的大蒜素，再腹腔注射5mg/kg的Bmab［11］。每天1次，持續(xù)14d。

1.5Morris水迷宮檢測各組大鼠認知功能

給藥14d后，對所有大鼠進行水迷宮實驗，檢測大鼠神經(jīng)功能的損傷情況。準備1個直徑1.5m的圓形水池，平均分成4個象限，水池正中央有1個直徑12cm的逃生平臺，置于水面下2cm的位置。將大鼠分別放入4個象限中，并引導(dǎo)其找到平臺。訓(xùn)練第7天記錄各組大鼠到達平臺的時間，記為逃避潛伏期。隨后撤去平臺，從相同的位置放入大鼠，記錄其1min內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)。

1.6TTC染色檢測大鼠腦梗死面積

水迷宮實驗結(jié)束后，每組隨機選取5只大鼠，并用40mg/kg的1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，斷頭，無菌條件下取全腦組織凍存于－20℃冰箱20min，沿冠狀位置切片。將切片放入TTC溶液中，37℃水浴30min，染色結(jié)束放入4%多聚甲醛中固定10min，拍照并用ImageJ軟件分析并計算梗死面積。

1.7HE染色觀察大鼠海馬組織病理形態(tài)

將剩余大鼠麻醉后斷頭處死，解剖腦部取海馬組織凍存在－80℃，部分用4%多聚甲醛中固定并制作石蠟切片。然后將石蠟切片依次進行脫蠟，水化，蘇木精染色，1%鹽酸分化，伊紅復(fù)染，再用乙醇、二甲苯分別脫水、透明，最后樹脂封片，顯微鏡觀察海馬組織的病理形態(tài)。

1.8ELISA法檢測大鼠血清中TNFα、IL1β、NGF、BDNF水平

所有大鼠在麻醉處死前進行腹主動脈采血，3000×g離心10min，取上清保存于－20℃。然后按照ELISA試劑盒的操作步驟檢測血清中TNFα、IL1β、NGF、BDNF水平。

1.9免疫組化法檢測大鼠海馬組織中CD31蛋白表達和微血管密度（MVD）

將石蠟包埋的組織切片脫蠟。然后將切片浸泡在5%脫脂牛奶中封閉2h，加入CD31一抗，4℃孵育過夜，然后加入羊抗兔二抗孵育1h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗后3，3′二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色15min，最后樹脂封片，使用ImageproPlus6.0軟件分析CD31陽性細胞數(shù)，并計算MVD。

1.10蛋白免疫印記（WesternBlot）法檢測大鼠海馬組織中Ang1、VEGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達

將凍存的海馬組織放入勻漿器，加入蛋白裂解液勻漿，提取總蛋白并制備蛋白樣品。用二喹啉甲酸（BCA）檢測試劑盒測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）凝膠電泳分離蛋白條帶并轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后聚偏二氟乙烯（PVDF）膜置于封閉液中封閉2h，然后加入一抗［甘油醛3磷酸脫氫酶（GAPDH）、Ang1、VEGF、ERK1/2、pERK1/2稀釋比例為1∶1000］，4℃孵育過夜，再加入羊抗兔（稀釋比例1∶2000），室溫孵育2h，最后用增強化學(xué)發(fā)光試劑（enhancedchemiluminescence，ECL）顯色。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析蛋白含量。

1.11統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩之間多重比較用SNKq檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大蒜素對IS大鼠認知功能的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組和大蒜素低劑量組、高劑量組大鼠逃避潛伏期時間縮短，穿越平臺次數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與大蒜素高劑量組相比，大蒜素高劑量＋Bmab組大鼠逃避潛伏期時間延長，穿越平臺次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2大蒜素對IS大鼠腦梗死面積的影響

與假手術(shù)組相比，模型組腦梗死面積明顯增加（P＜0.05）。與模型組相比，陽性對照組和大蒜素低劑量組、高劑量組腦梗死面積減?。≒＜0.05）；與大蒜素高劑量組相比，大蒜素高劑量＋Bmab組腦梗死面積增大（P＜0.05）。詳見圖1、表2。

2.3大蒜素對IS大鼠海馬組織形態(tài)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)紊亂，細胞數(shù)量減少，出現(xiàn)壞死，且細胞間隙變大；與模型組相比，陽性對照組和大蒜素低劑量組、高劑量組海馬組織形態(tài)不同程度恢復(fù)，細胞數(shù)量增多，壞死減少，細胞間隙縮?。慌c大蒜素高劑量組相比，大蒜素高劑量＋Bmab組海馬組織損傷加重，形態(tài)與模型組相似。詳見圖2。

2.4大蒜素對IS大鼠血清TNFα、IL1β、NGF、BDNF水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清TNFα、IL1β水平升高，NGF、BDNF水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組和大蒜素低劑量組、高劑量組血清TNFα、IL1β水平降低，NGF、BDNF水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與大蒜素高劑量組相比，大蒜素高劑量＋Bmab組血清TNFα、IL1β水平升高，NGF、BDNF水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表3。

2.5大蒜素對IS大鼠海馬組織CD31蛋白和MVD的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織CD31陽性細胞數(shù)減少，MVD降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組和大蒜素低劑量組、高劑量組CD31陽性細胞數(shù)增多，MVD升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與大蒜素高劑量組相比，大蒜素高劑量＋Bmab組CD31陽性細胞數(shù)減少，MVD降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖3、表4。

2.6大蒜素對IS大鼠海馬組織中Ang1、VEGF、pERK1/2/ERK1/2蛋白的影響

與假手術(shù)組相比，模型組新生大鼠海馬組織中Ang1、VEGF及pERK1/2/ERK1/2蛋白表達降低（P＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組和大蒜素低劑量組、高劑量組大鼠海馬組織中Ang1、VEGF及pERK1/2/ERK1/2蛋白表達升高（P＜0.05）；與大蒜素高劑量組相比，大蒜素高劑量＋Bmab組Ang1、VEGF、pERK及pERK1/2/ERK1/2蛋白表達降低（P＜0.05）。詳見圖4、表5。

3討論

IS是一種復(fù)雜的疾病，其主要病因是血管內(nèi)血栓的形成，由此導(dǎo)致神經(jīng)血管系統(tǒng)受損，并破壞腦組織和神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)，最終造成長期的運動和認知障礙［12］。因此，促進血管新生在恢復(fù)神經(jīng)功能過程中有不可或缺的作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的逃避潛伏期較長，穿越平臺次數(shù)較少，且腦梗死面積增大，海馬組織結(jié)構(gòu)紊亂，細胞數(shù)量減少，出現(xiàn)壞死，且細胞間隙變大，提示IS大鼠模型建立成功。在缺血性腦損傷中，炎性因子TNFα最早出現(xiàn)并參與刺激腦脊液和血清中的炎癥過程；IL1β在接受腦缺血刺激后可激活具有促炎作用的其他因子，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［13］。NGF、BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子在缺血期間能夠促進血管生成，誘導(dǎo)神經(jīng)元的存活和再生［14］。CD31是評估微血管密度的生物標志物。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清促炎因子TNFα、IL1β水平升高，NGF、BDNF水平降低，同時CD31陽性細胞數(shù)量減少，MVD降低，表明IS大鼠海馬神經(jīng)血管系統(tǒng)受損，且存在全身性炎癥反應(yīng)。大蒜素是一種具有抗炎、抗癌、降血壓和改善糖尿病等作用的化合物。而且已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對缺血后的神經(jīng)具有潛在的保護作用［15］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，陽性對照組和大蒜素劑量組大鼠的認知功能明顯恢復(fù)，炎癥反應(yīng)減輕，神經(jīng)營養(yǎng)因子表達增高，同時CD31陽性細胞數(shù)量及MVD增加，提示大蒜素可抑制炎性因子釋放，促進神經(jīng)營養(yǎng)因子產(chǎn)生，進而促進IS大鼠的血管再生，具有神經(jīng)保護功能。但其中具體的分子作用機制尚未明確。

VEGF是一種有效的生長因子，在血管生成中發(fā)揮多種作用。據(jù)了解，在MCAO誘導(dǎo)缺血大鼠模型中，VEGF發(fā)揮神經(jīng)保護、血管生成、神經(jīng)發(fā)生等多種作用［16］。Ang1也是促進血管生成的重要因素，可以增強血管生成中其他細胞因子的作用并維持新血管形成的結(jié)構(gòu)完整［17］。MAPKs作為關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，介導(dǎo)多種生物反應(yīng)，在生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ERK是MAPK通路家族的主要成員，有ERK1和ERK2兩種類型。磷酸化后，pERK1/2進入細胞核并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達［18］。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF與其受體結(jié)合可以啟動MAPK途徑信號傳導(dǎo)使ERK磷酸化［19］，丙酮酸激酶M2（PKM2）通過激活VEGF介導(dǎo)MAPK/ERK通路來改善IS后抑郁癥狀［6］，再次證實了VEGF能夠修復(fù)IS引起的神經(jīng)損傷和腦組織損傷［20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬組織中Ang1、VEGF及pERK1/2/ERK1/2蛋白表達降低，陽性對照組和大蒜素劑量組Ang1、VEGF及pERK1/2/ERK1/2蛋白表達升高。表明大蒜素可激活VEGF/MAPK/ERK信號通路，這可能為其促進IS后血管新生、發(fā)揮神經(jīng)保護作用的潛在機制。進一步使用VEGF抑制劑貝伐單抗發(fā)現(xiàn)，貝伐單抗可以消除大蒜素對IS大鼠血管和神經(jīng)的保護作用。

綜上所述，大蒜素可能通過激活VEGF/MAPK/ERK信號通路，促進IS大鼠血管新生，實現(xiàn)神經(jīng)保護作用。本研究為IS神經(jīng)恢復(fù)及血管生成提供了新的研究方向。但是其通路的下游影響因子還有很多尚未研究，因此大蒜素對血管和神經(jīng)的具體作用機制還需進一步深入研究。

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（收稿日期：20221212）

（本文編輯郭懷?。?/p>

基金項目武漢市衛(wèi)生健康委員會科研項目（No.WZ19A15）；湖北省衛(wèi)生健康委員會項目資助（No.WJ2019H362）

作者單位武漢市中醫(yī)醫(yī)院（武漢430034），Email：zhangcaifeng1992z@163.com

引用信息張彩鳳，張棟，李旭成，等.大蒜素調(diào)控VEGF/MAPK/ERK通路對缺血性腦卒中大鼠血管新生和神經(jīng)保護的機制研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（6）：10401045.