胡家 殷愛紅

摘要：目的? 了解外泌體的蛋白組成，認識外泌體蛋白的功能。方法? 通過超速離心獲得小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞的外泌體，用液質(zhì)聯(lián)用儀分析外泌體的蛋白成分。通過在線數(shù)據(jù)庫分析、預(yù)測外泌體蛋白功能。結(jié)果? 液質(zhì)聯(lián)用共鑒定到951個蛋白，GO功能聚類分析所鑒定到的蛋白與28條生物過程相關(guān)，與19條細胞組成相關(guān)，與19項分子功能相關(guān)；KEGG通路分析共有89條通路。結(jié)論? 通過超速離心的方法可以獲得外泌體，對外泌體進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析有助深入了解外泌體功能，并為外泌體的臨床應(yīng)用研究提供參考。

關(guān)鍵詞：外泌體；超速離心；液質(zhì)聯(lián)用

中圖分類號：R739.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.11.014

文章編號：1006-1959（2024）11-0079-05

Mass Spectrometry Analysis of Protein Composition of Exosomes from Mouse Neuroblastoma Cells

Abstract：Objective? To understand the proteins composition of exosomes and the functions of the proteome.Methods? The exosomes of mouse neuroblastoma cells were obtained by ultracentrifugation， and the protein components of exosomes were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry. Through online database analysis， the function of exosome protein was predicted.Results? A total of 951 proteins were identified by liquid chromatography-mass spectrometry. The proteins identified by GO functional clustering analysis were related to 28 biological processes， 19 cell compositions， and 19 molecular functions. There were 89 pathways in KEGG pathway analysis.Conclusion? Exosomes can be obtained by ultracentrifuge. Proteomic analysis of exosomes is helpful to understand the function of exosomes. It will provide a reference for the clinical application of exosomes.

Key words：Exosomes;Ultracentrifuge;Liquid chromatography-mass spectrometry

外泌體是一些小的膜泡，直徑在40～160 nm（平均約100 nm），由細胞的內(nèi)吞作用產(chǎn)生并釋放到細胞外環(huán)境中融合成帶有質(zhì)膜的多囊泡體。所有細胞以及各種生物體液都可以產(chǎn)生外泌體，外泌體包含原始細胞的許多成分，包括DNA、RNA、脂質(zhì)、代謝物，以及胞質(zhì)和細胞表面蛋白[1-3]。最近的研究表明[4]，外泌體是一種功能性的、靶向的、機制驅(qū)動的特定細胞成分的積累，承擔(dān)了一些獨特的生物學(xué)功能，尤其對于細胞間通迅起到很重要的作用；針對不同疾病，外泌體提供了一個了解細胞或組織狀態(tài)是否產(chǎn)生變化的窗口，在生物體液中檢測到的外泌體進行臨床試驗分析還可以提供一種診療數(shù)據(jù)。細胞間通過外泌體交換有效的細胞成分，這也提示了可以設(shè)計出基于外泌體的疾病治療方案[4，5]。由此可見對于外泌體功能的深入研究具有很大意義。通過一系列過濾和超速離心等步驟可獲得外泌體[6]，超速離心指轉(zhuǎn)速不低于30 000 rpm的離心技術(shù)，是一項生物化學(xué)和分子生物學(xué)不可缺少的技術(shù)手段[7，8]?；谫|(zhì)譜技術(shù)進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究一直是生命科學(xué)的研究熱門，其中液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛且極為有力的技術(shù)[9]。對于質(zhì)譜鑒定到的蛋白采用在線數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析，可幫助了解已鑒定蛋白的主要功能、參與信號傳導(dǎo)途徑及一些生理過程，從而為后續(xù)深入研究指明方向。小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系（Neuro 2A，N2a）被廣泛用于研究神經(jīng)元分化、軸突生長和信號傳導(dǎo)通路[10]。本實驗通過超速離心提取小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞的外泌體，利用質(zhì)譜分析N2a外泌體的蛋白組成，再對鑒定結(jié)果進行生物信息學(xué)分析，以期了解N2a外泌體的蛋白成分及其功能。

1材料與方法

1.1實驗試劑與儀器? 胎牛血清和DMEM高糖（含谷氨酰胺和丙酮酸鈉）培養(yǎng)液為Vistech公司產(chǎn)品；磷酸緩沖液（PBS）是Biosharp公司產(chǎn)品；尿素、Tris、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol， DTT）和碘乙酰胺均為Sigma公司產(chǎn)品；10 kD超濾濃縮管是Millipore公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為Promega公司產(chǎn)品；水、乙腈、甲酸和三氟乙酸（Fisher公司）。SpeedVac真空濃縮儀（Thermo公司）；Easy-Nano LC液相色譜儀和Triple TOF6600質(zhì)譜儀（Sciex公司）；超速離心機Optima XPN-100（BECKMAN公司）；NanoDrop微量分光光度計（Thermo公司）。

1.2外泌體提取? 收集無外泌體血清培養(yǎng)的N2a細胞培養(yǎng)液，用10 000 g，4 ℃ 離心30 min以去除死細胞、細胞碎片等雜質(zhì)，留取上清液。將所得上清液用超速離心，BECKMAN Optima XPN-100，SW32轉(zhuǎn)子，120 000 g，4 ℃離心1.5 h，獲取N2a細胞培養(yǎng)液中外泌體；收集外泌體沉淀，并用PBS洗滌，超速離心，120 000g，4 ℃ 離心1.5 h，收集沉淀，用PBS溶解沉淀后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3質(zhì)譜樣品制備? 按參考文獻[11]方法，取80 μl外泌體樣品溶液置于10 kD超濾濃縮管內(nèi)管，加入8 mol/L尿素/0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5溶液，進行溶液置換并使外泌體蛋白變性；再加入DTT至終濃度10 mmol/L，37 ℃孵育2.5 h，使樣品中蛋白質(zhì)的二硫鍵處于打開狀態(tài)；再使樣品恢復(fù)至室溫，加入碘代乙酰胺至終濃度50 mmol/L，避光放置40 min，對蛋白打開的二硫鍵進行烷基化保護。向超濾濃縮管中加入200 μl 8 mol/L尿素/0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5溶液，10 000 g、20 ℃離心30 min，重復(fù)本步驟洗滌2～3次。在超濾濃縮管中加入200 μl 50 mmol/L NH4HCO3，10 000 g、4 ℃離心30 min，重復(fù)本步驟2～3次洗滌樣品以去除尿素。換1個新的超濾管套管，在內(nèi)管中加入150 μl 50 mmol/L NH4HCO3，再按照蛋白：Trypsin（M/M）50∶1的比例加入酶液，37 ℃孵育16 h進行酶切反應(yīng)。10 000 g、4 ℃離心30 min。收集超濾管套管中洗脫下來的多肽溶液，再向內(nèi)管加入100 μl 50 mmol/L NH4HCO3，渦旋幾次，10 000 g、4 ℃離心30 min，重復(fù)該步驟3次洗脫多肽產(chǎn)物，收集每次洗脫的多肽樣品混合在同一管內(nèi)。最后，向多肽樣品中加入終濃度1%的甲酸，再用真空濃縮儀旋干樣品，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4液質(zhì)分析? 將外泌體蛋白的酶切產(chǎn)物用液相色譜的A相溶液（2%乙腈、0.1%甲酸）重溶后，經(jīng)NanoDrop定量，再15 000 g離心15 min。根據(jù)定量結(jié)果取4 μl樣品上清液進行納升級液相與Triple TOF6600質(zhì)譜聯(lián)用分析。色譜柱：C18除鹽柱（3 μm，120 ?，350 μm×0.5 mm）、C18分析柱（3 μm，120 ?，75 μm×150 mm），系統(tǒng)柱壓小于6000 Psi；流速：600 nl/min；液相1 h分析梯度設(shè)置為：0 min，5% B（B相溶液：0.1%甲酸、2%水、98%乙腈）；0～0.1 min，5%～9% B；0.1～32 min，9%～22% B；32～48 min，22%～32% B；48～51 min，32%～40% B；51～51.1 min，40%～80% B；51.1～56 min，80% B；56～56.1 min，80%～5% B；56.1～60 min，5% B。質(zhì)譜條件：ESI離子源、正離子掃描模式、噴霧電壓設(shè)為2.3 kV、離子源溫度設(shè)150 ℃。蛋白鑒定質(zhì)譜掃描模式：一級全掃描，質(zhì)荷比（m/z）范圍350～1500；二級質(zhì)譜挑選40個豐度高的母離子進行CID動態(tài)碎裂；掃描范圍m/z 100～1500，動態(tài)排除掃描，動態(tài)排除時間設(shè)置10 s。

1.5數(shù)據(jù)處理? 用Sciex公司的“Protein Pilot Software 5.0”對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)庫檢索分析，使用UNIPROT Mus musculus數(shù)據(jù)庫（更新于2016年8月），設(shè)置一級質(zhì)譜質(zhì)量偏差10 ppm、二級質(zhì)譜質(zhì)量偏差20 ppm，胰蛋白酶酶切，半胱氨酸碘乙酰胺烷基化固定修飾。獲得置信度較高（假陽性率，即FDR<1%）的蛋白鑒定結(jié)果。

2結(jié)果

2.1液質(zhì)聯(lián)用鑒定外泌體蛋白成分? 由圖1可看出液相色譜能分離出一系列色譜峰，代表外泌體蛋白經(jīng)酶切后得到了混合多肽樣品，經(jīng)液相色譜的梯度洗脫，按照多肽組分的極性不同進行了分離。其中橫坐標(biāo)表示液相洗脫時間，縱坐標(biāo)表示洗脫樣品的豐度。在前32 min，液相的B液濃度小于22%，色譜出峰多，表示流出的樣品多，說明樣品中親水性多肽（極性大）占絕對大多數(shù)。液相依據(jù)梯度設(shè)置不斷洗脫出的多肽均直接進入質(zhì)譜同步檢測，得到了22 070張質(zhì)譜圖，再通過與小鼠蛋白數(shù)據(jù)庫匹配檢索，共鑒定到951個蛋白。圖2所示為外泌體特征性蛋白CD9的一級質(zhì)譜峰，以及匹配序列“ELQEFYK”的二級質(zhì)譜峰。

2.2外泌體蛋白成分功能分析? 通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）對本實驗鑒定到的蛋白質(zhì)進行GO功能聚類分析和KEGG通路分析（P<0.05）。GO功能聚類分析見圖3A，所鑒定到的外泌體蛋白與28條生物過程（Biological Process）相關(guān)，主要是物質(zhì)運輸（Transport）、蛋白轉(zhuǎn)運（Protein transport）、細胞周期（Cell cycle）等。有19條細胞組成（Cellular Component）相關(guān)，主要涉及細胞質(zhì)（Cytoplasm）、細胞核（Nucleus）及細胞骨架（Cytoskeleton）等。有19項分子功能（Molecular Function）相關(guān)，包含RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding）、核蛋白（Ribonucleoprotein）和核糖體蛋白（Ribosomal protein）等。KEGG分析見圖3B，共有89條通路，主要涉及代謝途徑（Metabolic pathways）、多種疾病相關(guān)及多種信號通路。

3討論

本實驗通過超速離心的方法獲得小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞外泌體，使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定外泌體蛋白質(zhì)組，再通過在線數(shù)據(jù)庫對實驗結(jié)果進行蛋白功能分析、預(yù)測。結(jié)果顯示，液相色譜能有效分離外泌體蛋白經(jīng)酶切后得到的混合多肽樣品，液相洗脫出的多肽均直接進入質(zhì)譜同步檢測，所鑒定蛋白結(jié)果包含外泌體特征性蛋白CD9、CD81[5]，均為跨膜蛋白。既往文獻報道顯示[12]，小鼠癌細胞來源的外泌體富含熱休克蛋白，如HSP70、HSP90，本實驗與既往研究一致，說明外泌體提取方法得當(dāng)，質(zhì)譜鑒定結(jié)果可靠。通過本實驗可加深對小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞外泌體蛋白質(zhì)組的認識，對于進一步發(fā)現(xiàn)其生理功能，或是利用外泌體進行蛋白功能研究，以及未來在臨床上的應(yīng)用等提供參考。

外泌體通過細胞膜的內(nèi)陷作用導(dǎo)致多泡體形成，這些多泡體可以與細胞內(nèi)其他囊泡以及細胞器進行物資交換，由此形成外泌體成分的多樣性，可能決定其分泌到細胞外空間之后的功能。已有研究發(fā)現(xiàn)[13]，外泌體的獨特生理功能，除了跟外泌體所包含的一些功能元件有關(guān)，還和外泌體所介導(dǎo)的傳輸機制相關(guān)，包括細胞與細胞之間的通訊以及細胞與外環(huán)境的相互作用都很重要。本實驗鑒定到一系列運輸?shù)鞍?、膜轉(zhuǎn)運蛋白、信號受體蛋白及調(diào)節(jié)因子等均可能參與外泌體介導(dǎo)的細胞通訊過程，由此為后續(xù)進行N2a細胞通訊引起的相關(guān)生理功能研究提供了方向。

外泌體以其獨特的生理功能為臨床應(yīng)用研究提供了很好的材料，目前已有學(xué)者正在積極探索外泌體作為治療藥物或作為藥物載體的應(yīng)用。一些研究結(jié)果顯示[14-16]，外泌體蛋白質(zhì)可以選擇性地誘導(dǎo)受體細胞中的特定的信號通路，諸如在發(fā)育、免疫反應(yīng)、并對一些疾病進行調(diào)節(jié)。對于外泌體將功能性物質(zhì)運送到其他細胞并引起細胞病變特征的進一步研究，有利于將外泌體用于疾病治療，比如設(shè)計外泌體類似結(jié)構(gòu)的新藥[16]。外泌體的臨床應(yīng)用除了具備治療潛力外，還有幫助疾病診斷的潛力。外泌體存在于所有的生物體液中，并且所有細胞都會產(chǎn)生外泌體。由此可以通過無創(chuàng)或微創(chuàng)獲取體液進行活檢，提取外泌體以檢測疾病生物標(biāo)志物，也可由此跟蹤疾病進展。已有報道說明外泌體能夠轉(zhuǎn)運疾病相關(guān)物質(zhì)，在神經(jīng)退行性疾病發(fā)生、發(fā)展的病理過程起到重要作用[17，18]。本實驗經(jīng)KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)一系列與疾病相關(guān)蛋白，特別是與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的蛋白較多，有61種蛋白與帕金森疾?。≒D）相關(guān)、有58種蛋白與阿爾茨海默癥（AD）相關(guān)、有56種蛋白與亨廷頓舞蹈癥（HD）相關(guān)。另有6種蛋白與甲狀腺癌相關(guān)，F(xiàn)eng K等[19]闡述了甲狀腺腫瘤來源的外泌體可以作為一種潛在的無創(chuàng)診斷工具以便于甲狀腺瘤的檢測和監(jiān)測。外泌體的功能及應(yīng)用尚需臨床驗證，未來可能產(chǎn)生讓患者受益更多的診斷及治療方法。

綜上所述，通過對N2a細胞外泌體蛋白質(zhì)組的研究，鑒定了外泌體蛋白質(zhì)組成分，并對外泌體蛋白進行了功能分析與預(yù)測，有效幫助了解外泌體的生物學(xué)功能，并可能為外泌體在臨床應(yīng)用提供理論支持。

參考文獻：

[1]Kalluri R，LeBleu VS.The biology， function， and biomedical applications of exosomes[J].Science，2020，367（6478）：eaau6977.

[2]Li D，Wang Y，Jin X，et al.NK cell-derived exosomes carry miR-207 and alleviate depression-like symptoms in mice[J].J Neuroinflammation，2020，17（1）：126.

[3]Kimiz-Gebologlu I，Oncel SS.Exosomes： Large-scale production， isolation， drug loading efficiency， and biodistribution and uptake[J].J Control Release，2022，347：533-543.

[4]Zhang L，Yu D.Exosomes in cancer development， metastasis， and immunity[J].Biochim Biophys Acta Rev Cancer，2019，1871（2）：455-468.

[5]Kowal J，Arras G，Colombo M，et al.Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2016，113（8）：E968-E977.

[6]Faruqu FN，Xu L，Al-Jamal KT.Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells[J].J Vis Exp，2018（142）：10.3791/58814.

[7]黃靖嫻.超速離心機技術(shù)原理與操作維護注意事項[J].科技創(chuàng)新與應(yīng)用，2018（36）：130-132.

[8]黃素梅，殷明，張春芳，等.超速離心機在公共實驗平臺發(fā)揮的作用[J].實驗室研究與探索，2008，27（3）：29-30，58.

[9]Li J，Zhu HJ.Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry （LC-MS/MS）-Based Proteomics of Drug-Metabolizing Enzymes and Transporters[J].Molecules，2020，25（11）：2718.

[10]Tremblay RG，Sikorska M，Sandhu JK，et al.Differentiation of mouse Neuro 2A cells into dopamine neurons[J].J Neurosci Methods，2010，186（1）：60-67.

[11]Wisniewski JR，Zougman A，Nagaraj N，et al.Universal sample preparation method for proteome analysis[J].Nat Methods，2009，6（5）：359-362.

[12]Zhang G，Liu Z，Ding H，et al.Tumor induces muscle wasting in mice through releasing extracellular Hsp70 and Hsp90[J].Nat Commun，2017，8（1）：589.

[13]Zhang H，Wang L，Li C，et al.Exosome-Induced Regulation in Inflammatory Bowel Disease[J].Front Immunol，2019，10：1464.

[14]王藝瑩，李瑞青，李婧雯，等.外泌體介導(dǎo)細胞通訊：帕金森病的潛在生物標(biāo)志物分析[J].中國組織工程研究，2023，27（24）：3883-3891

[15]Choi D，Montermini L，Kim DK，et al.The Impact of Oncogenic EGFRvIII on the Proteome of Extracellular Vesicles Released from Glioblastoma Cells[J].Mol Cell Proteomics，2018，17（10）：1948-1964.

[16]Liang Y，Duan L，Lu J，et al.Engineering exosomes for targeted drug delivery[J].Theranostics，2021，11（7）：3183-3195.

[17]Pinnell JR，Cui M，Tieu K.Exosomes in Parkinson disease[J].J Neurochem，2021，157（3）：413-428.

[18]Zhang T，Ma S，Lv J，et al.The emerging role of exosomes in Alzheimer's disease[J].Ageing Res Rev，2021，68：101321.

[19]Feng K，Ma R，Zhang L，et al.The Role of Exosomes in Thyroid Cancer and Their Potential Clinical Application[J].Front Oncol，2020，10：596132.