李東　單曉麗　周峰

摘 要：本研究旨在開(kāi)發(fā)一種高效、經(jīng)濟(jì)的方法，利用高效能液相層析儀（HPLC）配合光二極管偵測(cè)器（PDA），對(duì)飼料中乙烯雌酚含量進(jìn)行分析。為了避免在低濃度情況下的誤判，同時(shí)采用高效液相層析質(zhì)譜儀（HPLC/MS）進(jìn)行了再確認(rèn)。在實(shí)驗(yàn)中，飼料樣品以甲醇為萃取液，經(jīng)過(guò)振蕩、離心、濃縮上清液，殘?jiān)?0%甲醇溶解，通過(guò)Oasis?HLB卡匣去除干擾物質(zhì)，最后用甲醇進(jìn)行沖提，沖提液經(jīng)高效液相層析儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于飼料添加0.5、1、3、5 ppm的情況，回收率在80.8%到107.5%。僅采用光二極管偵測(cè)器檢測(cè)時(shí)，最低檢測(cè)限為0.03 ppm；而采用質(zhì)譜偵測(cè)器檢測(cè)時(shí)，最低檢測(cè)限可達(dá)0.005 ppm。研究結(jié)果表明，所開(kāi)發(fā)的高效液相層析儀飼料中乙烯雌酚檢測(cè)方法具有便捷、經(jīng)濟(jì)、可行的特點(diǎn)，可作為飼料中乙烯雌酚檢驗(yàn)的一種有效方法。

關(guān)鍵詞：乙烯雌酚，高效能液相層析儀（HPLC），光二極管偵測(cè)器（PDA），飼料分析，液相層析質(zhì)譜儀（LC/MS）

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.10.034

0 引 言

乙烯雌酚是由英國(guó)內(nèi)科醫(yī)師查爾斯 多茲（CharlesDodds等）于1938年開(kāi)發(fā)的一種合成雌激素。由于其比天然雌激素具有更強(qiáng)的效果、生產(chǎn)成本低、口服方便等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛用于預(yù)防流產(chǎn)、早產(chǎn)以及減輕更年期障礙癥狀[1]。在農(nóng)業(yè)方面，由于乙烯雌酚對(duì)牛、雞和綿羊具有顯著的促進(jìn)生長(zhǎng)和提高飼料利用率的作用，自1941年起曾廣泛應(yīng)用。

近年來(lái)，氣相層析質(zhì)譜儀（GC/MS）檢測(cè)乙烯雌酚的方法得到了廣泛應(yīng)用。然而，由于GC/MS的前處理過(guò)程繁瑣，需要經(jīng)過(guò)衍生化后才能進(jìn)行檢測(cè)，因此液相層析質(zhì)譜儀（LC/MS）檢測(cè)方法成為新的發(fā)展趨勢(shì)[2]。盡管質(zhì)譜儀具有高靈敏度、高分辨率和專一性等優(yōu)點(diǎn)，但由于其昂貴的價(jià)格和高昂的維護(hù)費(fèi)用，如果應(yīng)用于例行檢測(cè)業(yè)務(wù)，相對(duì)成本也較高。因此，本研究嘗試開(kāi)發(fā)一種以廣泛應(yīng)用的高效能液相層析儀結(jié)合光二極管偵測(cè)器的方法，用于分析飼料中的乙烯雌酚含量，并通過(guò)質(zhì)譜儀進(jìn)行再確認(rèn)[3]。本實(shí)驗(yàn)的目的在于開(kāi)發(fā)一種更為便捷和經(jīng)濟(jì)的方法，以檢測(cè)飼料中乙烯雌酚的含量，以便應(yīng)用于飼料查驗(yàn)管理，預(yù)防乙烯雌酚的違法使用，確保畜產(chǎn)品的安全和消費(fèi)者的健康。

1 材料及方法

1.1 儀器設(shè)備及器材

溶液輸送系統(tǒng)及自動(dòng)采樣注射器：Alliance2695；

光二極管偵測(cè)器：Water s 29 9 6 Photodiode Array Detector；

質(zhì)譜偵測(cè)器：ZQ4000；

層析資料處理系統(tǒng)：Waters Empower Software分析管柱：Atlantis?C185μm，4.6x150mm超音波振蕩器：BRANSON8510；

離心機(jī)：KUBOTA5010；

減壓濃縮機(jī)：HEIDOLPH WB2001/VV2011；

固相萃取匣：Oasis?HLB 3cc/60mg Extractioncartridge。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品及試藥

標(biāo)準(zhǔn)品：diethylstilbestrol；

溶劑：甲醇、蒸餾水。

1.3 檢量線制作

（1）將乙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品以甲醇稀釋成濃度為10 0 μg /mL的標(biāo)準(zhǔn)原液。取適量的標(biāo)準(zhǔn)原液，以甲醇分別稀釋成0.25、0.5、1、3、5 μg /mL等5種濃度的工作液，H PLC / PDA分析條件的移動(dòng)相為methanol∶H2O＝65∶35，流速設(shè)定為1 mL/min，偵測(cè)波長(zhǎng)為240 nm，每種濃度注入20 μL，重復(fù)分析三次，測(cè)定波峰面積以制作檢量線。

（2）取適量的標(biāo)準(zhǔn)原液，以甲醇分別稀釋成0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 μg/mL共5種濃度，HPLC/MS分析條件設(shè)定為ESI Negative Mode的離子模式，準(zhǔn)分子離子峰（SIR）為「M-H」-267，Capillary Voltage為3.3 kV，Cone Voltage為35 V，每種濃度重復(fù)分析3次，制作一檢量線。

1.4 飼料中乙烯雌酚分析

取空白飼料，添加乙烯雌酚，使飼料中乙烯雌酚的含量分別為0.01、0.05、0.1、0.5、1、3、5 ppm。各組飼料分別取5 g（3份）加入40 mL甲醇，置于超音波震蕩器震蕩30分鐘后，離心10分鐘（3000 rpm），取上清液減壓濃縮至干，以70%甲醇5 mL溶出。取2 mL的溶出液注入Oasis?HLB3 cc/60 mg卡匣內(nèi)（預(yù)先以3 mL甲醇活化及3 mL水平衡），以3 mL70％甲醇洗凈后，再以甲醇2 mL沖提，沖提液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，注入液相層析儀測(cè)定。

2 結(jié) 果

根據(jù)上述分析條件以HPLC/PDA分析乙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品5種濃度（0.25、0.5、1、3、5 μg/mL），所得結(jié)果由層析結(jié)果中可見(jiàn)于波長(zhǎng)240 nm下，滯留時(shí)間9.49分鐘有一明顯吸收峰。波峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差介于0.4％～3.4％之間，檢量線Y=552.5+66247.2X，線性系數(shù)為r 2=0.99998（見(jiàn)表1）。

檢量線 Y=552.5+66247.2X；

相關(guān)系數(shù) r 2=0.99998。

以H P L C / M S 分析乙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品5種濃度（0.0 05、0.01、0.05、0.1、0. 5 μg /mL），所得結(jié)果由質(zhì)譜結(jié)果顯見(jiàn)其吸收峰，檢量線的相關(guān)系數(shù)r 2 = 0 . 9 9 8 5，波峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%～10.60%（見(jiàn)表2）。

檢量線Y=191502.1+37690.2X

相關(guān)系數(shù)r 2=0.9985

最低檢測(cè)界限及最低定量界限依公式LOD=3.3σ/S及LOQ＝10σ/S（式中σ為回歸線在y軸的截距的標(biāo)準(zhǔn)差，S為分析物檢量線的斜率），可得最低檢測(cè)極限為0.028 ppm，最低定量極限為0.084 ppm。

飼料中添加乙烯雌酚0.5、1.0、3.0、5.0 ppm4種濃度，依上述分析條件與飼料前處理方法處理分析后，結(jié)果顯示其平均回收率為80.8％～107.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～6.0%（見(jiàn)表3）。

于空白飼料添加乙烯雌酚0.05 ppm，經(jīng)飼料前處理以LC/PDA/MS偵測(cè)結(jié)果，由以SIR（Select IonRecording）267偵測(cè)特定分子量的質(zhì)譜，相較于所得的層析，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用質(zhì)譜儀檢測(cè)時(shí)，可減少噪聲干擾，降低偵測(cè)極限。

飼料中乙烯雌酚的濃度雖有添加至0.1、0.05、0.01 ppm，但由分析所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以HPLC/PDA偵測(cè)時(shí)僅能準(zhǔn)確定量至0.5 ppm，為避免低濃度所造成誤判的困擾，遂以HPLC/MS進(jìn)行檢測(cè)。在質(zhì)譜儀檢測(cè)下，可準(zhǔn)確定性至0.01 ppm。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用固相萃取技術(shù)進(jìn)行飼料的前處理，然后以高效能液相層析儀配合光二極管偵測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)飼料中乙烯雌酚的含量。本實(shí)驗(yàn)參考Alda D L J M ，Barceló D，2001與Y M ，2000所使用的C18 Vac及Oasis? HLB[4]二種固相萃取卡匣進(jìn)行試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)SPE C18 Vac回收率為84.2%，Oasis?HLB回收率為99.7%，這表明在此條件下Oasis? HLB滯留效果較C18Vac為佳。另外也曾嘗試運(yùn)用不同極性溶劑（如乙氰、乙醚、丙酮、氯仿等）萃取飼料中乙烯雌酚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用的溶劑極性愈低時(shí)，會(huì)同時(shí)將飼料中油脂萃取出，導(dǎo)致凈化困難，因此在考慮去油脂與相關(guān)有機(jī)溶劑的環(huán)保問(wèn)題下，遂選用甲醇作為萃取液。在飼料前處理過(guò)程中減壓濃縮步驟應(yīng)是影響本次實(shí)驗(yàn)回收率的主因，未來(lái)可嘗試使用大容量的固相萃取匣直接進(jìn)行凈化，減少濃縮回溶所造成的損失，應(yīng)可再提高回收率。

本實(shí)驗(yàn)最初以HPLC/ PDA檢測(cè)飼料中乙烯雌酚含量，于結(jié)果顯示飼料中添加乙烯雌酚濃度愈低時(shí)，其回收率反而愈高，推測(cè)可能因藥品濃度愈低，相對(duì)基質(zhì)的干擾也愈低所致，如加強(qiáng)樣品前處理，去除干擾物質(zhì)，回收率應(yīng)可獲得改善。

飼料中添加乙烯雌酚經(jīng)前處理后，以LC/PDA/MS偵測(cè)結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)于低濃度時(shí)運(yùn)用質(zhì)譜儀檢測(cè)，不僅可減少噪聲干擾，降低偵測(cè)極限，亦可避免造成誤判。雖然應(yīng)用質(zhì)譜儀檢測(cè)時(shí)可明顯見(jiàn)其吸收峰，但由于經(jīng)離子化過(guò)程的變異因子如溫度、氣體流速等影響，導(dǎo)致偵測(cè)結(jié)果的重復(fù)性不佳，波峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大于10%，如要準(zhǔn)確定量仍須添加內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品加以校正，以達(dá)準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

4 總 結(jié)

本研究致力于發(fā)展一種經(jīng)濟(jì)高效的方法，利用高效能液相層析儀（HPLC）結(jié)合光二極管偵測(cè)器（PDA），對(duì)飼料中的乙烯雌酚含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。乙烯雌酚因其在農(nóng)業(yè)中促進(jìn)生長(zhǎng)的作用而曾被廣泛使用。本研究采用固相萃取技術(shù)進(jìn)行飼料前處理，以甲醇為溶劑，通過(guò)HPLC/PDA進(jìn)行初步分析，并結(jié)合質(zhì)譜儀進(jìn)行再確認(rèn)，旨在確保畜產(chǎn)品的安全性和消費(fèi)者的健康。

在實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)選擇適宜的固相萃取卡匣（Oasis? HLB），優(yōu)化溶劑和萃取步驟，提高了乙烯雌酚的回收率。HPLC/PDA分析結(jié)果表明，所建立的檢量線具有良好的線性關(guān)系和重現(xiàn)性。同時(shí)，通過(guò)引入HPLC/MS技術(shù)，成功降低了噪聲干擾，提高了檢測(cè)的敏感性，尤其在低濃度范圍內(nèi)的準(zhǔn)確性得到了顯著提升。

通過(guò)在飼料中添加不同濃度的乙烯雌酚進(jìn)行分析，驗(yàn)證了該方法在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法的最低檢測(cè)限為0.028 ppm，最低定量限為0.084 ppm。對(duì)于添加乙烯雌酚的飼料樣品，所獲得的平均回收率為80.8％～107.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～6.0%，證明了該方法的可靠性和穩(wěn)定性。

總體而言，本研究成功地利用HPLC/ PDA和HPLC/MS相結(jié)合的方法，對(duì)飼料中乙烯雌酚進(jìn)行高效、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的檢測(cè)。該方法為飼料查驗(yàn)管理提供了一種可行的手段，確保了畜產(chǎn)品的安全性，維護(hù)了消費(fèi)者的健康。

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作者簡(jiǎn)介

李東，本科，工程師，研究方向?yàn)椴ＡЮw維增強(qiáng)塑膠、肥料、飼料、化工產(chǎn)品、食品、食用農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)檢測(cè)。

（責(zé)任編輯：張瑞洋）