朱浩然 耿金 孟思雨 葛培兵 倪天祎 張清 王丙劍

摘要 目的： 觀察血清氧化三甲胺（TMAO）水平對(duì)心房顫動(dòng)病人心房肌纖維化的影響。 方法： 入組31例瓣膜病病人，其中心房顫動(dòng)組（AF組）16例和竇性心律組（SR組）15例；收集入組病人的人口學(xué)資料、相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查及心臟超聲等資料。使用液相色譜法測(cè)定血清TMAO水平并比較兩組間差異；馬松染色分析兩組心房肌組織纖維化差異；蛋白免疫印跡法（Western Blot）測(cè)定病人心房肌組織抗平滑肌抗體（aSMA）蛋白含量。對(duì)TMAO水平與aSMA含量及左房?jī)?nèi)徑（LAD）進(jìn)行線性相關(guān)分析。 結(jié)果： 與SR組比較，AF組LAD、血清TMAO水平及aSMA增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.05）。血清TMAO水平與LAD、aSMA含量均呈正相關(guān)（ r 值分別為0.409，0.633， P ＜0.05）。 結(jié)論： 心房顫動(dòng)病人血清TMAO水平明顯升高，伴隨著心房膠原纖維沉積和LAD擴(kuò)大，提示TMAO可能在促進(jìn)心房顫動(dòng)發(fā)展過(guò)程中對(duì)心房肌纖維化產(chǎn)生作用。

關(guān)鍵詞 ?心房顫動(dòng)；氧化三甲胺；心房肌纖維化；左房?jī)?nèi)徑

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.10.028

近年來(lái)，隨著老齡化問題的加重及心血管疾病的增多，心房顫動(dòng)發(fā)病率日益升高，心房顫動(dòng)可能增加腦卒中、血栓栓塞、心力衰竭及心肌梗死等疾病風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，甚至危及生命 ?［1.2］ 。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并治療心房顫動(dòng)顯得尤為重要。目前認(rèn)為在心房顫動(dòng)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，伴隨心房原有電活動(dòng)及結(jié)構(gòu)特征性改變，早期主要表現(xiàn)為電重構(gòu)，心肌纖維化導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)重構(gòu)是心房顫動(dòng)晚期主要的病理改變 ?［3.4］ 。急性心肌損傷及伴隨的肥胖、糖尿病等代謝紊亂均可加快心肌纖維化的進(jìn)程，且多種炎性因子參與的炎癥反應(yīng)也是心肌纖維化的重要誘發(fā)因素，加速心臟重構(gòu)，促進(jìn)心房顫動(dòng)的維持與進(jìn)展 ?［3，5］ 。氧化三甲胺（trimethylamine N.oxide，TMAO）是含磷脂酰膽堿、膽堿的化合物，經(jīng)腸道菌群代謝吸收后在肝臟內(nèi)氧化的產(chǎn)物，在動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭、心肌梗死等諸多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。相關(guān)研究表明，在心肌肥大及缺血再灌注的小鼠模型中，血清TMAO含量與心肌纖維化相關(guān)，下調(diào)TMAO可顯著抑制心肌纖維化，緩解疾病進(jìn)展 ?［6.8］ 。心房顫動(dòng)涉及心房肌纖維化，TMAO與心房顫動(dòng)及心房纖維化關(guān)系的研究較少。本研究觀察血清TMAO水平對(duì)心房顫動(dòng)病人心房肌纖維化的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年1月—7月于淮安市第一人民醫(yī)院行瓣膜置換手術(shù)的心臟病病人31例。根據(jù)是否合并心房顫動(dòng)及發(fā)病的持續(xù)時(shí)間分為持續(xù)性心房顫動(dòng)組（AF組，16例）和竇性心律組（SR組，15例）。AF組入選心房顫動(dòng)持續(xù)發(fā)作＞7 d，通過(guò)藥物或電復(fù)律中止發(fā)作的病人；SR組入選無(wú)心房顫動(dòng)史，心電圖檢查為竇性心律的病人。納入標(biāo)準(zhǔn)：心臟彩超明確診斷為瓣膜性心臟?。患~約心臟病協(xié)會(huì)（NYHA）心功能分級(jí)Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí)；年齡18～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性左心衰竭、心功能Ⅳ級(jí)；重癥感染和活動(dòng)性風(fēng)濕熱；甲狀腺功能紊亂；嚴(yán)重腎功能不全；病態(tài)竇房結(jié)綜合征或其他需要起搏器治療的疾?。魂嚢l(fā)性心房顫動(dòng)等。本研究符合淮安市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并被批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：KY.2022.125.01），且所有病人均簽署知情同意書。

1.2 治療方法

所有病人均在心臟外科行瓣膜置換或修復(fù)手術(shù)，入院當(dāng)天抽取全血檢測(cè)TMAO。手術(shù)過(guò)程中，探查左心耳心肌組織，在左心耳適當(dāng)部位留取少許左心房標(biāo)本。將馬松染色的心房組織固定于4%多聚甲醛中，其余組織保存在液氮中，－80 ℃保存，用于蛋白免疫印跡法（Western Blot）。

1.3 研究方法

收集病人的人口學(xué)資料、臨床資料及住院期間用藥情況；記錄病人當(dāng)天血肌酐（Cr）和總膽固醇（TC）水平；所有病人在入院3 d內(nèi)完成超聲心動(dòng)圖檢查，記錄左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左房?jī)?nèi)徑（LAD）和左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.4 液相色譜法

所有病人均在清晨、 空腹、清醒時(shí)抽取肘靜脈血3～ ?5 mL置于干燥管中，全血在4 ℃條件下，以2 500 r/min 離心10 min，所得血清約500 μL，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定TMAO水平 ?［9］ 。先將TMAO.d9添加到血清樣品中，在m/z 85.68范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行液相色譜.質(zhì)譜（LC/MS）分析，之后在m/z 76.58范圍內(nèi)對(duì)TMAO進(jìn)行LC/MS分析，最后將TMAO和TMAO.d9加入對(duì)照樣品中，繪制TMAO定量分析的校準(zhǔn)曲線。

1.5 馬松染色

馬松染色按照試劑盒（KGMST.8004，KeyGEN BioTech，China）說(shuō)明書進(jìn)行，石蠟切片脫水后以蒸餾水清洗，蘇木精染色5 min，充分水洗后以麗春紅染色液染色5 min，冰醋酸溶液和磷鉬酸溶液清洗后，以苯胺藍(lán)染色液染色5 min，脫水后封片。采用Image Pro Plus軟件分析膠原含量，評(píng)估其纖維化程度。

1.6 Western Blot試驗(yàn)

使用RIPA（購(gòu)自Beyotime公司）和苯甲基磺酰氟（PMSF，購(gòu)自Beyotime公司）提取心肌組織中的蛋白，之后使用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（購(gòu)自Beyotime公司）定量分析蛋白濃度。在配好的膠中加入蛋白樣品后電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏乙烯膜（PVDF）上，用抗平滑肌抗體（aSMA）一抗（購(gòu)自Proteintech公司，貨號(hào)：14395.1.AP，1∶2 000稀釋）4 ℃孵育過(guò)夜，以二抗（購(gòu)自Proteintech公司，貨號(hào)：SA00001.2，1∶7 500稀釋）孵育1 h后電化學(xué)發(fā)光（ECL）法顯影。以三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，購(gòu)自Proteintech公司，貨號(hào)：10494.1.AP，1∶10 000稀釋）進(jìn)行參照蛋白，采用Image J軟件定量分析蛋白含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0（IBM SPSS，Armonk，NY）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x ?± s ）表示，采用獨(dú)立樣本 ?t 檢驗(yàn)；定性資料以例數(shù)、百分比（%）表示，采用 ?χ ?2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。使用廣義線性模型確定TMAO、aSMA及LAD的相關(guān)性，使用線性回歸模型調(diào)整混雜因素。以 ?P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較

與SR組比較，AF組LAD、血清TMAO水平及aSMA增高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.05）。詳見表1。

2.2 血清TMAO水平及心房肌纖維化程度

Western Blot法檢測(cè)心房肌組織的蛋白相對(duì)表達(dá)，可見纖維化標(biāo)志物aSMA在AF組中高表達(dá)，詳見圖1。馬松染色顯示，AF組膠原明顯高于SR組，詳見圖2。線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，TMAO水平與aSMA相對(duì)表達(dá)（ r ＝0.633， P ＜0.001）、LAD（ r ＝0.409， P ＝0.022）均呈正相關(guān)。詳見圖3。

2.3 不同LAD分層的血清TMAO水平、aSMA表達(dá)比較

為消除混雜因素的影響，對(duì)LAD進(jìn)行了分層分析。AF組血清TMAO水平、aSMA表達(dá)均高于SR組（ P ＜0.05）。詳見表2。提示心房顫動(dòng)病人TMAO水平上調(diào)及纖維化加重與LAD無(wú)關(guān)。

3 討 論

心房顫動(dòng)的常見危險(xiǎn)因素包括年齡、肥胖、高血壓、糖尿病及腎功能不全等 ?［10.11］ ，雖然對(duì)上述因素進(jìn)行預(yù)防與篩查，但心房顫動(dòng)發(fā)病率、致死率仍居高不下 ?［12.13］ 。持續(xù)性心房顫動(dòng)導(dǎo)致心肌纖維化，發(fā)展為心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，從而使心房舒縮功能受損，心臟泵血功能減退甚至喪失，心力衰竭死亡常成為心房顫動(dòng)病人的最終結(jié)局。因此，有效控制纖維化進(jìn)程在治療心房顫動(dòng)過(guò)程中至關(guān)重要。

TMAO是消化過(guò)程中腸道菌群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，膽堿和肉毒堿作為TMAO前體物質(zhì)在紅肉中含量很多，因此，長(zhǎng)期攝入紅肉可使血漿TMAO水平升高 ?［14.15］ 。在腸道中，膽堿、肉毒堿和卵磷脂等代謝前體轉(zhuǎn)化為三甲胺（TMA），TMA穿過(guò)腸壁進(jìn)入血液循環(huán)，在肝臟中由黃素單加氧酶（FMOs）氧化形成TMAO。目前認(rèn)為，TMAO是心血管疾病中一種新型的危險(xiǎn)因素。相關(guān)研究表明，相較于正常飲食的小鼠，高TMAO飲食的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化及心臟纖維化進(jìn)展加劇 ?［6，16］ ；停止攝入TMAO或抑制TMAO生成，可緩解心肌纖維化，改善心臟重構(gòu) ?［17.18］ 。心房纖維化是心房顫動(dòng)重要的病理改變，有研究以快速心房起搏構(gòu)建犬心房顫動(dòng)模型，之后將TMAO注入心臟自主神經(jīng)結(jié)中，結(jié)果顯示，心房顫動(dòng)發(fā)生率升高，神經(jīng)節(jié)活性增強(qiáng)，心房重構(gòu)因子（NGF）表達(dá)升高，且血清炎性因子上調(diào) ?［19］ 。提示TMAO可能參與心房顫動(dòng)的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)心房肌纖維化進(jìn)程。

本研究選取心房顫動(dòng)及竇性心律的瓣膜病病人31例，結(jié)果顯示，心房顫動(dòng)病人血清TMAO水平較竇性心律病人明顯升高，且TMAO水平與LAD呈正相關(guān)。左心房擴(kuò)大與心房顫動(dòng)互為因果，一方面心房顫動(dòng)發(fā)病后，晚期導(dǎo)致心肌膠原纖維沉積、心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)；另一方面，左房擴(kuò)大可促進(jìn)血栓形成、心房顫動(dòng)復(fù)發(fā)。因此，LAD可能提示心房顫動(dòng)的嚴(yán)重程度。血清TMAO水平與LAD存在相關(guān)性，TMAO可能是預(yù)測(cè)心房顫動(dòng)發(fā)生與疾病嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。由于兩組LAD比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此進(jìn)行分層分析以校正其對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，心房顫動(dòng)導(dǎo)致的TMAO上調(diào)及纖維化進(jìn)展不受LAD的影響。本研究將術(shù)中獲取的左心耳組織進(jìn)行Western Blot試驗(yàn)和馬松染色，結(jié)果顯示，AF組心房肌組織纖維化程度高于SR組，且血清TMAO水平與左房aSMA表達(dá)呈正相關(guān)。上述研究結(jié)果表明TMAO可能與心房肌的纖維化有關(guān)，參與了心房顫動(dòng)的維持與進(jìn)展。

TMAO促進(jìn)心房顫動(dòng)發(fā)生發(fā)展的機(jī)制有以下幾方面：1）TMAO與心房顫動(dòng)的危險(xiǎn)因素有關(guān)，如肥胖、糖尿病導(dǎo)致的代謝紊亂及心血管急癥等 ?［20.22］ ；2）TMAO使心房自主神經(jīng)節(jié)活性增高，誘使心房電生理紊亂 ?［19，23］ ；3）TMAO通過(guò)激活NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎性小體、促進(jìn)氧化應(yīng)激、激活多種促炎信號(hào)通路等途徑，促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)重構(gòu) ?［6，8，24］ 。

綜上所述，心房顫動(dòng)病人血清TMAO水平升高，并伴隨心房膠原纖維沉積和LAD的擴(kuò)大，即心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，表明TMAO可能在促進(jìn)心房顫動(dòng)病人心房肌纖維化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究仍缺乏具體證據(jù)解釋TMAO促進(jìn)心房顫動(dòng)病人心房肌纖維化的潛在機(jī)制。需進(jìn)一步研究證實(shí)本研究結(jié)果， 以期為調(diào)整腸內(nèi)代謝進(jìn)而延緩心房顫動(dòng)進(jìn)展提供 依據(jù)。

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（收稿日期：2023.03.23）

（本文編輯 薛妮）