唐春慧 張振博 吳冬琴 環(huán)飛 張靜姝 王玉邦

DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.20230144

收稿日期：2023-09-25

作者簡(jiǎn)介：唐春慧（1998—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槟z原蛋白脂質(zhì)體的制備工藝及性能研究。E-mail：2582600514@qq.com

*通信作者，王玉邦（1965—），男，教授，研究方向?yàn)樯硟?nèi)分泌毒理學(xué)。E-mail：ncsa@njmu.edu.cn

摘要：以蛋黃卵磷脂、膽固醇和神經(jīng)酰胺為成膜材料，采用薄膜分散法制備膠原蛋白神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體（CO-CS）。以包封率為響應(yīng)值，以藥脂比、膜材比、超聲時(shí)間和水合時(shí)間為影響因素對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)藥脂比為1：16、超聲時(shí)間為8.5 min、膜材比為4.3：1時(shí)，包封率可達(dá)90.73%。在此條件下，樣品的粒徑為（206.63±2.06） nm，聚合物分散性指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）為0.187±0.010，Zeta電位為（-34.90±0.82） mV。避光保存60 d后，CO-CS的包封率為87.2%，粒徑為（223.70±1.85） nm、PDI為0.174±0.013、Zeta電位為（-33.51±2.10） mV。結(jié)果表明，本研究制備的CO-CS包封率高，穩(wěn)定性良好，制備工藝合理可行。

關(guān)鍵詞：膠原蛋白；神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體；響應(yīng)面；包封率

中圖分類號(hào)：TQ658.2??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? 文章編號(hào)：1002-4026（2024）03-0018-09

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

Preparation and quality evaluation of collagen ceramide liposomes

TANG Chunhui1，ZHANG Zhenbo1，WU Dongqin1，HUAN Fei1，2，ZHANG Jingshu1，2，WANG Yubang1，2*

（1.School of Public Health， Nanjing Medical University，Nanjing 211166，China;2.Jiangsu Pharmaceutical Pesticide

Veterinary Drug Safety Evaluation and Research Center， Nanjing 211166，China）

Abstract∶In this study， egg yolk lecithin， cholesterol，and ceramide were used as film-forming materials to prepare collagen ceramide liposomes （CO-CS） by the thin film dispersion method. To optimize the process， encapsulation efficiency was used as the response value， and it was evaluated by influencing factors such as drug-lipid ratio， film-material ratio， ultrasonic time， and hydration time. Results showed that encapsulation efficiency reached 90.73% when the drug-lipid ratio， film-material ratio， and ultrasonic time were 1：16， 4.3：1， and 8.5 min， respectively. Under these conditions， the particle size， polymer dispersity index （PDI）， and zeta potential of CO-CS were（206.63±2.06） nm， 0.187±0.010， and （34.90±0.82

） mV， respectively. After 60 days of storage at room temperature in the dark， the encapsulation efficiency was 87.2 %. Furthermore， the particle size， PDI， and zeta potential of CO-CS changed to （223.70±1.85） nm， 0.174±0.013， and （33.51±2.10） mV， respectively. In summary， CO-CS produced in this study revealed high encapsulation efficiency and good stability， and the preparation process is reasonable and feasible.

Key words∶collagen; ceramide liposome; response surface; encapsulation efficiency

膠原蛋白（collagen，CO）是哺乳動(dòng)物皮膚、肌腱、骨骼和軟骨等結(jié)締組織中含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，占人體總蛋白質(zhì)含量的30%以上［1］。膠原蛋白生物材料具有低免疫原性、可生物降解、生物相容性、親水性以及促進(jìn)細(xì)胞增殖分化等優(yōu)良特性，應(yīng)用于食品、化妝品、制藥和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域［2］。膠原蛋白作為化妝品原料的有效性已經(jīng)確立，通常以原液的形式添加到乳液、面膜、保濕霜等中，用來改善皮膚的色澤、細(xì)紋及皺紋，但皮膚對(duì)膠原蛋白的吸收程度是影響其發(fā)揮功效的關(guān)鍵因素［3］。

從皮膚結(jié)構(gòu)來看，物質(zhì)透皮吸收的途徑主要有三條：角質(zhì)層、毛囊及汗管［4］。孫婭楠等［5］觀察了分子量為58 kDa左右的重組人源膠原蛋白的透皮吸收情況，發(fā)現(xiàn)重組人源膠原蛋白可以沿著毛囊進(jìn)入真皮層，并從毛囊中擴(kuò)散至膠原纖維層從而補(bǔ)充皮膚中的膠原纖維［12］；Sun等［6］研究發(fā)現(xiàn)，分子量為55 kDa的外源性重組人源膠原蛋白通過毛囊滲透表皮、皮脂腺到達(dá)真皮，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些研究結(jié)果顯示，膠原蛋白這種大分子物質(zhì)主要通過毛囊途徑進(jìn)入皮膚真皮層中，然而毛囊及汗管等皮膚附屬器官與整個(gè)皮膚表面積相比僅占1%以下，透皮效率低，因此，單純體外涂敷膠原蛋白不能被良好地吸收，其利用率很低，需考慮促透皮的策略。

神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體（cerosomes，CS）是由磷脂、神經(jīng)酰胺、膽固醇等組成的具有類脂雙分子層結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體，能夠高效經(jīng)皮遞送包封在其中的活性成分，并具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和皮膚耐受性，另因其中添加了神經(jīng)酰胺，還能夠更新皮膚的天然保護(hù)層并形成有效的屏障以防止水分流失［7］。

因此，為了提高膠原蛋白的生物利用度，將其制備成脂質(zhì)體。目前常用制備脂質(zhì)體的方法有薄膜分散法［8］、逆向蒸發(fā)法［9］、乙醇注入法［10］等。在我們前期的實(shí)驗(yàn)中，分別考察了乙醇注入法、薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法制備膠原蛋白神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體（CO-CS）。結(jié)果顯示薄膜分散法制備的CO-CS包封率較高，粒徑分散性良好，且制備工藝簡(jiǎn)單，故采用此方法制備CO-CS，以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化其制備工藝，并測(cè)定了CO-CS平均粒徑、粒徑分布和電位等質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察CO-CS的最佳制備工藝，為膠原蛋白產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1? 實(shí)驗(yàn)部分

1.1? 材料與儀器

重組人源膠原蛋白（分子量為55 kDa，批號(hào)LA22007004，江蘇江山聚源生物技術(shù)有限公司）；蛋黃-卵磷脂（批號(hào)EK21009，上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；膽固醇（批號(hào)C10780，上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；油溶性神經(jīng)酰胺3（批號(hào)CONA23，韓國(guó)斗山集團(tuán)）；無水乙醇（分析純，批號(hào)20230412，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；吐溫-80（化學(xué)純，批號(hào)20200609，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；曲拉通（TritonX-100，批號(hào)9002-93-1，北京博奧拓達(dá)科技有限公司）；BCA試劑盒（批號(hào)P0011-1，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；透析袋（截留分子量300 kDa，批號(hào)SBJ131456-1M，南京森貝伽生物科技有限公司）。

ME503T型精密分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；NANOZS-90型馬爾文粒徑分析儀（馬爾文帕納科公司）；TP-350E型磁力攪拌器（杭州米歐有限公司）；VORTEXX-5型渦旋振蕩儀（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；FEI Tecnai G2型透射電子顯微鏡（FEI捷克有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? CO-CS的制備

CO-CS基本處方見表1。按處方量精密稱取蛋黃卵磷脂、膽固醇、神經(jīng)酰胺，加入無水乙醇，超聲10 min溶解，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)40 min，去除無水乙醇，形成均勻脂質(zhì)薄膜。加入處方量膠原蛋白原液和1%吐溫-80至圓底燒瓶，旋轉(zhuǎn)水合（水合溫度40 ℃）1 h至薄膜完全脫離形成乳白色混懸液，超聲處理10 min（功率60 W）。所得膠原蛋白混懸液經(jīng)0.45 μm水性微孔濾膜過濾，即得CO-CS混懸液，室溫避光保存［3，11］。

1.2.2? 包封率的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用透析法分離游離膠原蛋白與CO-CS，采用BCA（二喹啉甲酸，Bicinchoninic acid） 方法測(cè)定CO-CS的包封率［3］。將0.5 mL新鮮制備的脂質(zhì)體放入透析袋中，在200 mL、pH 7.4 PBS（磷酸緩沖鹽溶液，phosphate buffer saline）透析液中4 ℃透析24 h以除去游離的膠原蛋白。分別采用2.0 mL 的0.3% Trition X-100溶液對(duì)透析前后的0.5 mL脂質(zhì)體進(jìn)行破乳，釋放出包裹在脂質(zhì)體中的膠原蛋白。采用BCA蛋白測(cè)定法，在562 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定膠原蛋白的質(zhì)量濃度。包封率按公式（1）計(jì)算：

包封率=WW總×100%，（1）

其中，W總表示破乳前脂質(zhì)體中膠原蛋白質(zhì)量濃度；W表示破乳后脂質(zhì)體中膠原蛋白質(zhì)量濃度。

1.2.3? 透射電鏡觀察

取10.0 μL 脂質(zhì)體，加入990 μL 超純水將其稀釋，于干燥的銅網(wǎng)上滴加樣品，紅外燈源下一定距離進(jìn)行烘干，待銅網(wǎng)完全干燥后，銅網(wǎng)上滴加一滴 1%的磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染，用濾紙吸干銅網(wǎng)多余的磷鎢酸。完全干燥后，透射電鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.4? 粒徑、PDI和Zeta 電位的測(cè)定

采用動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）技術(shù)對(duì)CO-CS進(jìn)行粒徑、PDI（聚合物分散性指數(shù)，polymer dispersity index）和 Zeta電位的測(cè)定。取10.0 μL新鮮制備的CO-CS溶液，加入990 μL超純水稀釋至 1.0 mL 后，用馬爾文粒徑分析儀測(cè)定粒徑、PDI 和 Zeta 電位。

1.2.5? 單因素實(shí)驗(yàn)

（1）篩選藥脂比。固定其他條件不變，考察膠原蛋白與蛋黃卵磷脂質(zhì)量比分別1∶20、1∶16、1∶12、1∶8、1∶4時(shí)對(duì)CO-CS包封率的影響，每個(gè)水平平行實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

（2）篩選膜材比。固定其他條件不變，考察蛋黃卵磷脂和神經(jīng)酰胺的量與膽固醇質(zhì)量比分別為3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1時(shí)對(duì)CO-CS包封率的影響，每個(gè)水平平行實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

（3）篩選超聲時(shí)間。固定其他條件不變，考察超聲時(shí)間分別為5、10、15、20、25 min時(shí)對(duì)CO-CS包封率的影響，每個(gè)水平平行實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

（4）篩選水合時(shí)間。固定其他條件不變，考察水合時(shí)間分別為15、30、45、60、75 min時(shí)對(duì)CO-CS包封率的影響，每個(gè)水平平行實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.2.6? 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取出藥脂比、超聲時(shí)間、膜材比3個(gè)顯著因素，以包封率為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，通過 Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果預(yù)測(cè)CO-CS的最佳制備工藝，按照最佳制備工藝制得CO-CS 5組，將其包封率與預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較。

1.2.7? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將CO-CS置于室溫下避光保存，分別于當(dāng)天及7、14、21、28 、60 d取樣，測(cè)其包封率、粒徑、PDI及電位。

2? 結(jié)果與討論

2.1? 單因素結(jié)果分析

不同因素對(duì) CO-CS包封率的影響見圖1。

由圖1（a）可知，當(dāng)膠原蛋白與蛋黃卵磷脂的質(zhì)量比為1：16時(shí)包封率最大為89.04%。隨著膠原蛋白用量的增加，包封率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，這是因?yàn)橐欢康闹|(zhì)體膜所能包封的膠原蛋白是有限的，在超過脂質(zhì)體膜的飽和度后，膠原蛋白的質(zhì)量再增加，脂質(zhì)體膜不能繼續(xù)包封，故其包封率下降［11］。綜上所述，膠原蛋白與蛋黃卵磷脂質(zhì)量比在1：16較為合適。

由圖1 （b）可知，隨著膜材比的增加，包封率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，在膜材比為5：1時(shí)其包封率最大為86.16%。由于單獨(dú)磷脂形成的脂質(zhì)膜不穩(wěn)定，膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性及穩(wěn)定磷脂雙分子層的作用，因此在制備時(shí)加入膽固醇［12］。當(dāng)膽固醇加入量較少時(shí)，膽固醇的加入使脂質(zhì)體膜變得越來越牢固；當(dāng)膽固醇的量超過最佳添加量時(shí)，制成的脂質(zhì)膜親水性太強(qiáng)，容易被破壞。因此隨著膜材比的逐漸增大，脂質(zhì)體的包封率漸漸增大，在其質(zhì)量比超過5：1 后，包封率隨之減小。綜上所述，膜材比應(yīng)在5：1較為合適。

由圖1 （c）可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，CO-CS包封率呈先上升再下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間10 min時(shí)，脂質(zhì)體包封率最大為87.40%；隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，脂質(zhì)體包封率反而減小。出現(xiàn)該結(jié)果可能是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)某暱梢允箞F(tuán)聚的脂質(zhì)體粒子逐漸分開，從而更好地包裹膠原蛋白，但是過長(zhǎng)時(shí)間的超聲，導(dǎo)致脂質(zhì)體粒子被過度振蕩碎裂而一定程度發(fā)生泄漏，包封率下降［13］。因此，最佳的超聲時(shí)間在10 min。

由圖1 （d）可知，為了避免脂質(zhì)體制備過程中水合時(shí)間過久而被氧化，本實(shí)驗(yàn)考察了水合時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，水合時(shí)間在15～75 min范圍內(nèi)，包封率受水合時(shí)間的影響并不明顯，在水合時(shí)間為45 min時(shí)CO-CS包封率最大，之后緩慢下降，因此水合時(shí)間固定為45 min。

2.2? 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1? 響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案及結(jié)果

為進(jìn)一步優(yōu)化CO-CS的制備條件，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取出藥脂比、超聲時(shí)間、膜材比3個(gè)顯著因素，以包封率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表3。

利用 Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到CO-CS包封率對(duì)藥脂比A、超聲時(shí)間B、膜材比C的二次多項(xiàng)回歸模型為Y=89.29+2.31A-1.18B-4.22C-0.16AB-0.57AC+2.03BC-6.85A2-6.23B2-5.88C2，R2=0.991 6。對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)見表4。

回歸方程式描述了CO-CS包封率與各影響因素間的關(guān)系，由表4 的回歸模型的顯著性分析可知，一次項(xiàng)A、C，交互項(xiàng)BC和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)CO-CS包封率的影響極顯著，一次項(xiàng)B對(duì)CO-CS包封率的影響顯著，其他因素的影響不顯著。F值的大小可以分析出CO-CS的包封率被單個(gè)因素所影響的程度。表中F值：FC>FA>FB，易得影響包封率的因素排序由大到小為膜材比、藥脂比、超聲時(shí)間。另外由該模型的顯著性分析得F值為91.60，相應(yīng)總模型的P<0.000 1，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到了極顯著水平（P<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.199 5>0.05），變異系數(shù)為1.21%（<10%），說明非試驗(yàn)因素對(duì)結(jié)果的影響不大，模型具有較好的試驗(yàn)穩(wěn)性?？偰Ｐ偷南嚓P(guān)系數(shù)R2為0.991 6，說明該模型的可信度為99.16%，試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中約99.16%的結(jié)果可通過該擬合模型進(jìn)行解釋。校正后的決定系數(shù)R2adj為0.980 8，說明此模型有充分的準(zhǔn)確性和通用性，可信度高，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用此模型對(duì)CO-CS的包封率進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

2.2.2? 響應(yīng)面分析交互作用

在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過Design-Expert 8.0.6軟件依據(jù)回歸方程式，繪制出各實(shí)驗(yàn)因素的響應(yīng)面圖及等高線圖，分析藥脂比、超聲時(shí)間、膜材比對(duì)CO-CS包封率的影響。當(dāng)固定藥脂比、超聲時(shí)間、膜材比三個(gè)因素中其中一個(gè)因素時(shí)，剩下的兩個(gè)因素的交互作用及其對(duì)包封率的影響可用等高線和響應(yīng)面圖表示，響應(yīng)面圖和等高線圖能夠直觀地看出顯著實(shí)驗(yàn)因素及各實(shí)驗(yàn)因素之間的相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度，曲面越陡，等高線越密集，則該實(shí)驗(yàn)因素越顯著，等高線越接近橢圓，則兩個(gè)因素的交互作用越強(qiáng)［14-15］。根據(jù)CO-CS包封率的回歸方程作出各實(shí)驗(yàn)因素的響應(yīng)面圖及等高線圖，結(jié)果如圖 2。

由圖2可知，超聲時(shí)間和膜材比的交互作用對(duì)脂質(zhì)體包封率影響最大，藥脂比和超聲時(shí)間的交互作用及藥脂比和膜材比的交互作用對(duì)脂質(zhì)體包封率影響不顯著。

圖2（a）表示膜材比在中心水平時(shí)，藥脂比和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響。如圖所示，當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，脂質(zhì)體包封率受藥脂比的影響不大，隨著藥脂比的增大，制備的脂質(zhì)體包封率先增大后減??；當(dāng)藥脂比一定時(shí)，超聲時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響也不顯著。

圖2（b）表示超聲時(shí)間在中心水平時(shí)，藥脂比和膜材比的交互作用對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響。當(dāng)藥脂比一定時(shí)，脂質(zhì)體包封率受膜材比的影響不大，隨著膜材比的增加，脂質(zhì)體包封率先增大后有所下降；當(dāng)膜材比一定時(shí)，脂質(zhì)體包封率與藥脂比保持不變時(shí)有相同的變化趨勢(shì)，則表示藥脂比和膜材比的交互作用不顯著。

圖2（c）表示藥脂比在中心水平時(shí)，超聲時(shí)間和膜材比的交互作用對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響。在超聲時(shí)間一定時(shí)，隨著膜材比的增加，脂質(zhì)體包封率先增大后逐漸減小；當(dāng)膜材比一定時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，脂質(zhì)體包封率先增大后逐漸減小。響應(yīng)面圖形曲面較陡，等高線呈橢圓形且密集，表明超聲時(shí)間和膜材比的交互作用極顯著。

2.2.3? CO-CS優(yōu)化工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將脂質(zhì)體的包封率作為考察指標(biāo)，通過軟件Design-Expert 8.0.6得到CO-CS的最優(yōu)制備條件為藥脂比為1：16.37，超聲時(shí)間為8.55 min，膜材比為4.29：1，此時(shí)得到的脂質(zhì)體包封率為90.25%。根據(jù)實(shí)際操作的可能性，將最佳制備條件調(diào)整為：藥脂比為1：16，超聲時(shí)間8.5 min，膜材比為4.3：1，利用該條件制備CO-CS，驗(yàn)證包封率是否為預(yù)測(cè)的最大包封率值，進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5。

據(jù)表5可知，在最優(yōu)制備條件下制備的CO-CS與通過Design-Expert 8.0.6軟件預(yù)測(cè)的脂質(zhì)體最大包封率接近，CO-CS的平均包封率為90.73%，與理論預(yù)測(cè)值相差不大，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.29%，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的CO-CS工藝可靠，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3? 優(yōu)化工藝制備的CO-CS的質(zhì)量與穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1? CO-CS的外觀與電鏡觀察結(jié)果

CO-CS的外觀如圖3所示，外觀呈乳白色的混懸液，流動(dòng)性良好。圖4為CO-CS的透射電鏡觀察結(jié)果，結(jié)果顯示其為分散、單一的圓球形顆粒，無明顯聚集現(xiàn)象，排列相對(duì)均勻，粒徑在200 nm左右。

2.3.2? 粒徑分布及 Zeta 電位

CO-CS的粒徑分布較為均勻，平均粒徑為206.63 nm，電位為-34.9 mV，粒徑分布及Zeta電位圖見圖 5。

2.3.3? 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將制備的CO-CS放置在常溫避光的儲(chǔ)存條件下進(jìn)行保存，考察其儲(chǔ)存穩(wěn)定性。在儲(chǔ)存的第7、14、21、28及60 d后取樣，測(cè)定其包封率、粒徑、PDI 和Zeta 電位。

避光保存60 d后，CO-CS外觀為白色溶液，色澤均勻，與剛制備的脂質(zhì)體溶液外觀無明顯差異。在粒徑、PDI、Zeta電位和包封率方面，粒徑稍有增大，變化不明顯；電位絕對(duì)值在30 mV以上，可認(rèn)為是比較穩(wěn)定的；包封率稍有下降，但都大于80% ，符合《中國(guó)藥典》2020 年版要求［16］，表明CO-CS避光儲(chǔ)存60 d的穩(wěn)定性較好。

3? 結(jié)論與討論

粒徑大小被認(rèn)為是與穩(wěn)定性、生物利用度和包封率相關(guān)的一個(gè)重要因素。只有50～500 nm的顆粒才能滲透到皮膚中，較小的顆?？梢允顾幬锔菀状┻^角質(zhì)層的屏障［17］。PDI 表明顆粒尺寸分布非均勻性的程度，范圍為0～1.0，PDI 數(shù)值越小表明粒度分布的均勻性越高。對(duì)于脂質(zhì)體納米粒子而言，PDI 值在0～0.3，表明粒子分散均勻［18］。Zeta 電位是脂質(zhì)體穩(wěn)定性的屬性之一，Zeta 電位是脂質(zhì)體表面電荷的指標(biāo)，絕對(duì)值越高，相互排斥作用越大，脂質(zhì)體碰撞的頻率就降低，從而體系越穩(wěn)定，相對(duì)較高的 Zeta 電位對(duì)于脂質(zhì)體的物理和化學(xué)穩(wěn)定性非常重要。Zeta電位絕對(duì)值大于30 mV，表明脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)制備的CO-CS粒徑為206.63 nm，PDI為0.187，Zeta 電位為-34.9 mV，可見試驗(yàn)所制備的脂質(zhì)體符合預(yù)期要求。

本研究成功優(yōu)化并建立起了一種簡(jiǎn)單高效的CO-CS制備工藝，制得脂質(zhì)體粒徑小、包封率高、分散性較好、較為穩(wěn)定，但將其轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用時(shí)還需對(duì)其成本、貨期等進(jìn)行評(píng)價(jià)。目前關(guān)于CO-CS制備的文章較少，故本研究制備的CO-CS具有良好的應(yīng)用推廣前景，可為膠原蛋白產(chǎn)品進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

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