李杰 陳浩宇 郝敬喆 鐘海霞 張付春 伍新宇 范詠梅

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.021

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.021

收稿日期：2022-12-12? 修回日期：2023-03-13

基金項(xiàng)目：中央財(cái)政林草科技推廣示范項(xiàng)目（新［2024］TG14號(hào)）；新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆計(jì)劃（2022E02073）；新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)（KY2022041）。

第一作者：李? 杰，女，博士，從事果樹(shù)病蟲(chóng)害及防控技術(shù)研究。E-mail：278392684@qq.com

通信作者：郝敬喆，男，研究員，從事果樹(shù)病蟲(chóng)害及防控技術(shù)研究。E-mail：urmqhjz@qq.com

范詠梅，女，教授，從事農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)與害蟲(chóng)生物防治研究。E-mail：1013310970@qq.com

摘? 要? 為明確褐紋病菌侵染葡萄葉片的過(guò)程，采用光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡等技術(shù)手段，系統(tǒng)研究了葡萄褐紋病菌在‘無(wú)核白和‘克瑞森無(wú)核葡萄葉片上的侵染過(guò)程。結(jié)果表明：葡萄褐紋菌分生孢子在‘無(wú)核白‘克瑞森無(wú)核葡萄葉片接種1 d后均可萌發(fā)；后期發(fā)育過(guò)程，‘克瑞森無(wú)核葡萄葉片上菌絲細(xì)長(zhǎng)，生長(zhǎng)停滯；‘無(wú)核白葡萄葉片表面初生菌絲密布，持續(xù)在寄主體表生長(zhǎng)擴(kuò)展；接種3 d，‘無(wú)核白葡萄葉片的表面形成了密集的菌絲網(wǎng)，同時(shí)觀察到菌絲從氣孔或直接入侵方式進(jìn)入葉片表皮組織內(nèi)部，隨后，菌絲以胞間和胞內(nèi)生長(zhǎng)的方式擴(kuò)展；接種6 d，菌絲達(dá)到上表皮，隨菌絲在葉片組織內(nèi)不斷地生長(zhǎng)擴(kuò)展，使得寄主細(xì)胞壞死、解體。可見(jiàn)：‘無(wú)核白是親和葡萄褐紋病菌品種，而‘克瑞森無(wú)核葡萄非親和褐紋病菌。

關(guān)鍵詞? 葡萄褐紋菌；‘無(wú)核白；克瑞森無(wú)核；侵染過(guò)程；細(xì)胞學(xué)研究

葡萄（Vitis vinifera L.）屬于葡萄科（Vitaceae）多年生溫帶水果之一，因其獨(dú)特的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而享譽(yù)世界［1］。據(jù)報(bào)道，中國(guó)、意大利、美國(guó)、法國(guó)和西班牙是栽培葡萄最多的國(guó)家［2］。

葡萄褐紋病Scolecotrichum vitiphyllum （Spesch.） Varak.et Vassil.（=Coryneum vitiphyllum Spesch.）是中國(guó)葡萄上發(fā)生的一種新病害，該病菌屬于半知菌類，暗梗孢科雙孢亞科，束梗單隔霉屬，菌絲體在寄主細(xì)胞間蔓延，直至長(zhǎng)滿整個(gè)寄主，引起寄主生長(zhǎng)停滯，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降，對(duì)經(jīng)濟(jì)效益產(chǎn)生影響。Спешнев于1901年首次報(bào)道了葡萄褐紋病致病菌，1950年Вacилъeвcкий和Kapaкyлин記載了該病原菌的形態(tài)，到1953年和1958年κазенасу和Бызова報(bào)道該病原菌在哈薩克斯坦和烏茲別克斯坦危害葡萄［3］。新疆最早于2007年記載此病在吐魯番地區(qū)發(fā)生，此后其在新疆阿克蘇、喀什及和田等傳統(tǒng)葡萄栽培區(qū)被發(fā)現(xiàn)［4］。

葡萄褐紋病主要危害葡萄葉片，在葉片正面初期為黃色不明顯的病斑，后形成褐色斑點(diǎn)，周?chē)型示G的淡綠色至黃色暈圈，后期呈褐色圓形或近圓形斑點(diǎn)。葉背面形成褐色至黒褐色圓形病斑，病斑邊緣明顯，周?chē)悬S色暈圈，病斑表面有許多顆粒物，呈明顯突起狀，為病原菌成簇的分生孢子梗，病斑直徑0.3～1.1 cm，病斑散生或多斑愈合，嚴(yán)重時(shí)可造成葉片枯黃脫落［4］。

目前，葡萄褐紋病病原菌侵染過(guò)程的顯微觀察尚缺乏報(bào)道。為此，本研究通過(guò)光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡、透射電鏡技術(shù)對(duì)葡萄褐紋病菌侵染‘無(wú)核白和‘克瑞森無(wú)核葡萄葉片的過(guò)程進(jìn)行觀察，旨在明確其在葡萄葉片表面上的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，為研究病原菌與無(wú)核葡萄感病和抗病品種間互作關(guān)系，為葡萄抗病品種選育提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自新疆吐魯番葡萄研究所實(shí)驗(yàn)基地葡萄園，品種選取‘無(wú)核白和‘克瑞森無(wú)核，試驗(yàn)材料為‘無(wú)核白和‘克瑞森無(wú)核葡萄上無(wú)病蟲(chóng)害的新葉。

1.2? 病原接種與組織取樣

選取葡萄1 a生枝條上尚未完全展開(kāi)的新葉，用自封口保鮮袋將其套入袋內(nèi)。用無(wú)菌水將發(fā)病葉片上的單菌落孢子洗脫，配制成數(shù)量濃度為108 mL-1的孢子懸浮液。用液滴法取配好的懸浮液接種于新鮮葡萄葉片背面，分別于接種后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d取樣，無(wú)菌水為空白對(duì)照，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3? 葡萄褐紋病菌絲及分生孢子形態(tài)觀測(cè)

參照朱書(shū)生等［5］介紹的曲利苯蘭染色法進(jìn)行，觀察時(shí)以水為浮載劑，將葉盤(pán)背面朝上放置在載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察葡萄褐紋病菌各生長(zhǎng)發(fā)育階段菌絲及分生孢子形態(tài)。參照朱紅惠等［6］的方法測(cè)量菌絲長(zhǎng)度和寬度。每次分別測(cè)定30個(gè)孢子，求其平均值。

1.4? 掃描電鏡樣品制備

參照劉佳［7］的方法進(jìn)行樣品制備與觀察。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3片葡萄新葉，將葉片剪成0.5 cm×0.5 cm小塊，浸泡在4%戊二醛溶液中4 ℃保存過(guò)夜，經(jīng)梯度脫水后，叔丁醇置換3次。經(jīng)真空鍍膜后，掃描電鏡觀察孢子侵入前的行為，并拍照? 記錄。

1.5? 透射電鏡樣品制備

參照張嘯等［8］的方法進(jìn)行樣品的制備與觀察。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3片葡萄新葉，將葉片剪成? 0.1 cm×0.2 cm小塊，戊二醛溶液固定及磷酸緩沖液清洗，清洗之后用1%鋨酸溶液固定，再經(jīng)乙醇梯度脫水處理，然后用LR-White樹(shù)脂膠包埋。樣品超薄切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后進(jìn)行透射電鏡觀察并拍照記錄。

1.6? 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用LSD檢驗(yàn)和Duncan氏檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同接種時(shí)間葡萄褐紋病菌絲及分生孢子形態(tài)觀察

從顯微結(jié)構(gòu)觀察可以看出，接種后1 d，分生孢子在‘無(wú)核白葡萄葉片上開(kāi)始萌發(fā)，出芽，并且從分生孢子的一端產(chǎn)生芽管，一般1個(gè)孢子萌發(fā)后只產(chǎn)生1個(gè)芽管（圖1-A），但也有少數(shù)孢子萌發(fā)后產(chǎn)生2個(gè)芽管（圖1-B）。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，芽管繼續(xù)伸長(zhǎng)并在葉表面自由伸展，遇到合適的氣孔，即從氣孔侵入（圖1-C）。接種后2 d，多數(shù)芽管侵入后，初生菌絲向葉肉細(xì)胞生長(zhǎng)，侵染菌絲在細(xì)胞間發(fā)生分枝，產(chǎn)生次生侵染菌（圖1-D），芽管從葉片表皮直接侵入或者從氣孔侵入。接種3 d后，葉片表面的菌絲分化產(chǎn)生出特異性侵染菌絲。侵染菌絲入侵發(fā)生在寄主表皮細(xì)胞交界處，并且病菌菌絲沿相鄰2個(gè)表皮細(xì)胞間的中膠層向內(nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展（圖1-E）。

2.2? 不同寄主葉片上菌絲芽管長(zhǎng)度和寬度的? 比較

接種1 d后，病原菌在‘克瑞森無(wú)核和‘無(wú)核白葡萄葉片上均能萌發(fā)，形成初生菌絲，基本無(wú)次生菌絲產(chǎn)生，兩種葡萄上菌絲的長(zhǎng)度和寬度差異不顯著。隨著菌絲在不同寄主上生長(zhǎng)，接種2 d后，‘無(wú)核白葡萄葉片上產(chǎn)生的菌絲長(zhǎng)度和寬度開(kāi)始快速增長(zhǎng)，增長(zhǎng)率分別為61.33%和? 59.87%，與接種第1天具有顯著性差異；‘克瑞森無(wú)核葉片上菌絲變細(xì)、變短，低于接種第1天觀測(cè)到的結(jié)果，生長(zhǎng)出現(xiàn)停滯現(xiàn)象。接種3 d和4 d后，觀測(cè)到‘無(wú)核白葉片上菌絲長(zhǎng)度分別是接種第1天的2.78倍和2.95倍，菌絲寬度分別是接種第1天的3.11倍和3.23倍；‘克瑞森無(wú)核葉片上菌絲的長(zhǎng)度和寬度持續(xù)萎縮。接種5 d后，‘無(wú)核白葉片上菌絲長(zhǎng)度達(dá)到11.30 μm，寬度為3.77 μm，與接種第1天均具有顯著性差異。接種6 d后，‘無(wú)核白葡萄葉片上菌絲長(zhǎng)度和寬度分別比接種第1天增加67.08%和70.70%，具有顯著性差異（表1）；而‘克瑞森無(wú)核菌絲變得稀疏，部分菌絲脫落，在后期沒(méi)有顯著性差異。由此可知，‘克瑞森無(wú)核與葡萄褐紋病菌孢子親和性低，表現(xiàn)抗侵染特性，‘無(wú)核白與褐紋病原菌親和性顯著，表現(xiàn)易感葡萄褐紋病。

2.3? 葡萄褐紋病菌侵染途徑的掃描電鏡觀察

繼光學(xué)顯微檢測(cè)后開(kāi)展掃描電鏡觀測(cè)接種葉片表面病原菌分生孢子侵染發(fā)育情況。發(fā)現(xiàn)接種1 d后，在‘克瑞森無(wú)核和‘無(wú)核白葉片上病原菌分生孢子均能萌發(fā)，每個(gè)分生孢子產(chǎn)生1～2個(gè)芽管，新形成的芽管并不直接侵入而在寄主葉片表面擴(kuò)展，‘無(wú)核白葉片上病菌分生孢子的生長(zhǎng)強(qiáng)壯，‘克瑞森無(wú)核接種孢子芽管弱小纖細(xì)，發(fā)育表現(xiàn)出明顯的差異（圖2-A、2-E）。

葡萄褐紋病菌孢子在‘無(wú)核白葡萄葉片表面萌發(fā)，產(chǎn)生芽管，芽管在葡萄葉片表面擴(kuò)張，直接由芽管頂端侵入葉片角質(zhì)層，或趨向氣孔，并在其上方形成膨大的附著胞從氣孔伸入葉片組織內(nèi)（圖2-B）。葡萄褐紋病菌菌絲在寄主‘無(wú)核白葉片表面擴(kuò)張，菌絲厚密，菌絲表面的附著胞寬大緊密附著于葉片表面（圖2-C）。隨著病菌的生長(zhǎng)、繁殖，形成新的產(chǎn)孢機(jī)構(gòu)—子座，子座突破寄主—‘無(wú)核白表面，形成新的分生孢子梗和分生孢子，新孢子不斷生成，完成病原菌孢子的一個(gè)世代（圖2-D）。

從圖2-F可以看到，葡萄褐紋病菌侵染‘克瑞森無(wú)核后，吸器在葉片表面呈菌絲狀分布，瘦弱、細(xì)長(zhǎng)，菌絲浮于‘克瑞森無(wú)核葉片表面。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，病菌在寄主‘克瑞森無(wú)核葉片表面擴(kuò)張的菌絲細(xì)小、稀疏，菌絲表面附著胞數(shù)量少（圖2-G）。病原菌菌絲不能成功侵入葉片組織，菌絲體脫落（圖2-H）。

2.4? 葡萄褐紋病菌侵染‘無(wú)核白葡萄葉片的透射電鏡觀察

通過(guò)掃描電鏡觀察到葡萄褐紋病菌在葡萄葉片表面的侵染動(dòng)態(tài)，為了進(jìn)一步明確此病菌侵染葉片內(nèi)部導(dǎo)致葉片枯黃脫落的過(guò)程，對(duì)此病菌侵染‘無(wú)核白葡萄葉片的過(guò)程進(jìn)行了透射電鏡觀察。通過(guò)透射電鏡觀察，葡萄褐紋病菌在‘無(wú)核白葡萄葉片上生長(zhǎng)（圖3-A，3-a），此時(shí)，菌絲主要分布在寄主的細(xì)胞間隙，寄主細(xì)胞保持完整。隨著病原菌菌絲的生長(zhǎng)，黑色的菌絲在葉片組織細(xì)胞間、細(xì)胞壁和液泡等細(xì)胞器之間擴(kuò)展（圖3-B，3-b）。隨著病原菌的持續(xù)生長(zhǎng)與侵入，病菌菌絲自胞間穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，菌絲在葉片組織中從胞間向胞內(nèi)擴(kuò)展（圖3-C，3-c），菌絲進(jìn)入細(xì)胞器。葡萄褐紋病菌在‘無(wú)核白葡萄葉片上持續(xù)侵染，細(xì)胞內(nèi)菌絲生長(zhǎng)、擴(kuò)展，菌絲布滿細(xì)胞，導(dǎo)致‘無(wú)核白葉片正面細(xì)胞消解，背面細(xì)胞器崩潰（圖3-D，3-d）。

3? 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)光學(xué)和掃描電子顯微鏡觀察葡萄褐紋病原菌侵染‘無(wú)核白葡萄葉片可以看到，病原菌孢子在寄主‘無(wú)核白葡萄葉片表面萌發(fā)后形成芽管和附著胞，菌絲在葉片匍匐生長(zhǎng)，最終病原菌從氣孔或角質(zhì)層直接侵入葉片內(nèi)部。

而‘克瑞森無(wú)核在接種初期孢子雖然能萌發(fā)，隨即菌絲變得細(xì)長(zhǎng)、稀疏，不能正常侵入葉片組織中。透射電鏡觀察葡萄褐紋病菌在‘無(wú)核白葡萄葉片中的擴(kuò)展途徑，開(kāi)始菌絲游走細(xì)胞間隙，寄主細(xì)胞保持完整，黑色的菌絲在葉片組織細(xì)胞間和細(xì)胞壁之間擴(kuò)展。隨時(shí)間推移，病菌菌絲自胞間穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞器。最后菌絲布滿細(xì)胞，導(dǎo)致‘無(wú)核白葉片正面細(xì)胞消解，背面細(xì)胞器崩潰。前人研究發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段的表達(dá)存在不同侵染路線［9-13］。

葡萄褐紋病原菌侵染‘無(wú)核白葡萄葉片表現(xiàn)在萌發(fā)后形成芽管和附著胞等，菌絲在葉片匍匐生長(zhǎng)，而后病原菌從氣孔或角質(zhì)層直接侵入葉片內(nèi)部。

與高啟帆等［14］報(bào)道的黃瓜接種白粉菌孢子3 d后產(chǎn)生寬大的入侵菌絲以直接侵入或通過(guò)氣孔侵入寄主組織體內(nèi)一致。另外研究白粉病菌在抗病和感病葡萄葉片上的侵染過(guò)程，表現(xiàn)出菌絲和分生孢子能成功附著在感病和抗病植株的葉片表面，并且隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，感病葡萄葉片表現(xiàn)出白粉癥狀，抗病葡萄葉片不表現(xiàn)白粉癥狀［15］。相比較，張曉林等［16］認(rèn)為膠孢炭疽病侵染過(guò)程中孢子分別在4 h和8 h開(kāi)始出現(xiàn)萌發(fā)并形成附著胞， 12 h成熟后形成侵染釘。周揚(yáng)［17］研究了桃瘡痂病菌侵染桃葉片，直接形成侵入釘、附著胞等，促進(jìn)定殖，但很少觀察到通過(guò)氣孔侵入。本研究與上述兩種病原菌侵入方式均不相同，可能是由于膠孢炭疽菌和桃瘡痂病菌是半活體營(yíng)養(yǎng)型真菌，葡萄褐紋病菌為活體營(yíng)養(yǎng)型真菌，存在不同的侵染類型涉及不同的侵染過(guò)程和侵染機(jī)制所致。郝雅瓊等［18］認(rèn)為栗疫病菌進(jìn)入枝條內(nèi)部是通過(guò)傷口進(jìn)入，健康無(wú)傷口的枝條并不被病菌侵染。本研究中未觀察到傷口侵染現(xiàn)象。

寄生菌侵入過(guò)程表現(xiàn)出親和性［19］。病原菌菌絲在‘無(wú)核白葡萄葉片上任意延長(zhǎng)擴(kuò)展、繁殖，而‘克瑞森無(wú)核在接種初期孢子雖然能萌發(fā)，隨即菌絲變得細(xì)長(zhǎng)、稀疏，不能正常侵入葉片組織中。說(shuō)明‘無(wú)核白對(duì)葡萄褐紋病菌親和，‘克瑞森無(wú)核對(duì)葡萄褐紋病菌不親和的差異性。葉片表面的蠟質(zhì)層是植物葉片抵御生物危害的第一道屏障［20］，‘克瑞森無(wú)核葡萄葉片的外表面有較厚的蠟質(zhì)層，蠟質(zhì)的存在可能對(duì)菌絲的生長(zhǎng)擴(kuò)展具有抑制作用?！疅o(wú)核白葡萄葉片外表面蠟質(zhì)層較薄，這也可能是‘無(wú)核白葡萄葉片更容易被侵染的原因之一。

通過(guò)對(duì)葡萄褐紋病菌侵染過(guò)程的細(xì)胞學(xué)觀察，明確了該病菌在抗、感病葡萄葉片中的侵染方式與擴(kuò)展途徑，填補(bǔ)了現(xiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于葡萄褐紋病研究的空缺。還需進(jìn)一步研究環(huán)境因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響，結(jié)合生理指標(biāo)與表型性狀觀測(cè)，完善該病的侵染過(guò)程，明確親和侵染依據(jù)。此外，葡萄褐紋病菌在侵染葡萄葉片的過(guò)程中，葡萄葉片組織內(nèi)發(fā)生了一系列病理變化，包括寄主細(xì)胞器的腫脹解體和細(xì)胞壁的坍塌破裂等，這些寄主細(xì)胞病理變化可能與病菌在侵染擴(kuò)展過(guò)程中產(chǎn)生的酶和毒素有關(guān)，關(guān)于這一方面的工作將作進(jìn)一步研究。

本研究從組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平觀察鑒定出葡萄褐紋病親和、非親和品種，為葡萄褐紋病抗病品種選育提供了理論依據(jù)。

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Immune and? Pathogenesis Responses of Grape to Scolecotrichum vitiphyllum Infection

LI Jie1，CHEN Haoyu1，HAO Jingzhe1，ZHONG Haixia2，

ZHANG Fuchun2，WU Xinyu2 and? FAN Yongmei3

（1.Institute of Plant Protection，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi? 830091，China;

2.Institute of Horticultural Crops，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi? 830091，China;

3.College of Plant Protection，Hainan University，Haikou? 570228，China）

Abstract ??To understand the process by which grape brown stripe disease infects grape leaves，a combination of optical microscope，scanning electron microscopy，and transmission electron microscopy was used to systematically? explore the grape Scolecotrichum vitiphyllum? in the infection process of ‘Thompson seedless and ‘Crimson seedless grape leaves.The results showed that after one-day inoculation，conidia could germinate both on ‘Thompson seedless and ‘Crimson seedless grape leaves.In the later stage of development，the hyphae on the leaves of? ‘Crisson seedless grape were slender and stagnant.Primary mycelia on ‘Thompson seedless grape leaves began to show symptoms and continued to grow and expand on the host surface.After three days of inoculation，a dense mycelium network was formed on the surface of ‘Thompson seedless grape leaves，and it was observed that primary mycelia produced invading mycelia，which entered into the lower epidermal tissue of the leaves from the stomata or in a direct invasion way.Subsequently，mycelia expanded in a way of intercellular and endocellular growth.After six days of inoculation，the mycelia reached the upper epidermis and continued to grow and expand with the mycelia in the leaf tissue，resulting in necrosis and disintegration of the host cells.These results indicated that ‘Thompson seedless grape was susceptible to grape brown stripe disease，whereas the ‘Crimson seedless grapes? exhibit incompatibility.

Key words? Grape Scolecotrichum vitiphyllum; Thompson seedless; Crimson seedless; Infection process; Cytological studies

Received ??2022-12-12??? Returned? 2023-03-13

Foundation item? Central Finance Forest and Grass Science and Technology Demonstration Project（No.Xin［2024］TG14）;Autonomous Region Science and Technology Branch Xinjiang Project（No.2022E02073）;the Basic Research Business Funding Support Project for Autonomous Region Public Welfare Research Institutes （No.KY2022041）.

First author? LI Jie，female，Ph.D.Research area：fruit diseases and insect pests and control.E-mail：278392684@qq.com

Corresponding?? author? HAO Jingzhe，male，research fellow.Research area：fruit diseases and insect pests and control.E-mail：urmqhjz@qq.com

FAN Yongmei，female，professor.Research area：environmental oxicology of pesticides and biological pest control.E-mail：1013310970@qq.com

（責(zé)任編輯：郭柏壽? Responsible editor：GUO Baishou）