作者簡介：張麗（1988—），女，江蘇南通人，本科，助理工程師。研究方向：食品分析。

摘 要：利用高效液相色譜儀建立一種快速、簡便、確度高的測定方法來檢測嬰幼兒羊奶粉中的香蘭素含量。樣品經(jīng)乙醇提取后，漩渦振動，快速離心后經(jīng)微孔濾膜過濾，使用Supersil AQ C18柱分離，并將甲醇-水溶液作為流動相進行梯度洗脫，在278 nm的波長下進行檢測，通過外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，在0.5～

50.0 μg·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性系數(shù)為0.999 8，加標(biāo)回收率為96.44%～104.17%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.30%～4.63%，香蘭素的檢出限為0.17 μg·mL-1、定量限為0.51 μg·mL-1。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；香蘭素；嬰幼兒羊奶粉

Determination of Vanillin in Goat Milk Powder for Infants by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Li

（Shanghai Deno Product Testing Service Co.， Ltd.， Shanghai 200436， China）

Abstract： A rapid， simple and accurate method for the determination of vanillin in infant sheep milk powder was established by high performance liquid chromatography. The samples were extracted by ethanol， swirled， centrifuged rapidly， filtered by microporous filter membrane， then separated by Supersil AQ C18 column， and gradient elution was performed with methanol-aqueous solution as mobile phase. The samples were detected at a wavelength of

278 nm and quantified by external standard method. The results showed that the linear range of vanillin standard curve was 0.5～50.0 μg·mL-1， the linear coefficient is 0.999 8， the recoveries were 96.44%～104.17%， and the relative standard deviations were 3.30%～4.63%， the limit of detection of vanillin was 0.17 μg·mL-1 and the limit of quantitation was 0.51 μg·mL-1.

Keywords： high performance liquid chromatography; vanillin; goat milk powder for infants

香蘭素，又名香草醛，為一種廣泛使用的可食用香料[1]，帶有香莢蘭豆芳香和濃郁奶香，最早從蘭科植物香莢蘭中被發(fā)現(xiàn)。香蘭素為白色或淺黃色針狀或結(jié)晶狀粉末[2]，微溶于水，易溶于有機試劑，可用作定香劑、協(xié)調(diào)劑及調(diào)味劑。但是，過量攝入香蘭素會對人體健康產(chǎn)生負面影響[3]，甚至?xí)雰旱母闻K和腎臟造成不可逆轉(zhuǎn)的損害[4]。另外，6個月以下的嬰兒食用含香蘭素的嬰幼兒羊奶粉可能會影響他們的胃口。香蘭素香甜的味道會使嬰幼兒對其形成依賴性[5]，還可能導(dǎo)致嬰幼兒產(chǎn)生偏食、厭食及挑食等不健康的飲食習(xí)慣?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中規(guī)定，

0～6個月嬰兒配方食品中不得添加任何食用香料，較大嬰兒和幼兒配方食品中可以使用香蘭素、乙基香蘭素和香莢蘭豆浸膏，最大使用量為5 mg/100 mL。2025年2月即將實施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2024）對于嬰幼兒食品規(guī)定完全不允許使用任何香精香料。鑒于此，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法測定嬰兒配方奶粉中香蘭素的含量具有重要的現(xiàn)實意義，可為嬰幼兒食品質(zhì)量控制及食品安全監(jiān)管提供一定的科學(xué)依據(jù)。

香蘭素的含量測定方法主要有分光光度法、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）、氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）及電化學(xué)方法等。例如，孟德素等[6]利用紫外分光光度法同時測定香蘭素和水楊酸。楊麗霞[7]利用紫外分光光度法對餅干中的香蘭素含量進行測定，紫外分光光度法成本低，儀器設(shè)備易操作，但靈敏度較低。謝曉丹[8]采用HPLC測定脫石散中的香蘭素含量，這一方法快速、高效，更適用于測定一些基質(zhì)比較簡單的食品或者飲料中的香蘭素含量。詹勝群等[9]采用UPLC-MS/MS快速篩查嬰幼兒配方乳粉中3種香蘭素的污染情況。UPLC-MS/MS具有操作簡單、靈敏、準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點，但存在設(shè)備維護成本高、操作周期長、操作條件要求高等問題。鄭璇等[10]利用GC-MS實現(xiàn)奶粉中香草醛、乙基香草醛的同步檢測，該方法簡單、快速，選擇性強，但操作復(fù)雜，需要反復(fù)提取濃縮。HAREESHA等[11]制備出一種高性能石墨復(fù)合膏體傳感器，然后采用電化學(xué)阻抗譜（Electrochemical Impedance Spectroscopy，EIS）測定食品樣品中的香蘭素。ZIYATDINOVA等[12]制備出一種電聚合溴甲酚紫沉積的傳感器，利用該傳感器對食品中香蘭素含量進行檢測。本文參考已有研究，利用高效液相色譜儀建立一種快速、簡便、確度高的測定方法來檢測嬰幼兒羊奶粉中香蘭素的含量

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1260 液相色譜儀（紫外檢測器）、VM-96A渦旋振蕩器，上海沉匯儀器有限公司；武漢恒信HX-10型10 L超聲波清洗器，武漢恒信世紀(jì)科技有限公司；TH-15離心機，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；0.45 μm微孔濾膜。

香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），天津市眾聯(lián)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈、正己烷，色譜純，國藥試劑；乙醇，分析純，國藥試劑；二次蒸餾水作為實驗用水；6個品牌一至三段嬰幼兒羊奶粉樣品（共計18份），均購自電商平臺。

1.2 實驗方法

1.2.1 香蘭素對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱量1.250 1 g香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇進行充分溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶內(nèi)，用乙醇定容，配制成50 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置于低溫黑暗環(huán)境中保存。取適量該溶液進行稀釋，制成0.5 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1和50.0 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 嬰幼兒羊奶粉樣品溶液的制備

①準(zhǔn)確稱取嬰幼兒羊奶粉2 g放入試管中，加入25 mL常溫二次蒸餾水，使用超聲波清洗器對試樣進行振動處理10 min，使其充分混合均勻和溶解。②利用渦旋振蕩器對試樣進行振蕩處理40 s，移取均勻溶液10.00 mL放入離心管，加入5 mL乙醇，使用渦旋振蕩器對溶液振蕩40 s后離心8 min，上層的清液被收集于容量瓶中。③向容量瓶中加入等量乙醇，同樣的條件下繼續(xù)操作1次，合并兩次的上清液轉(zhuǎn)入同一容量瓶，用乙醇進行定容后充分混合，之后經(jīng)生物膜過濾后獲得樣品溶液。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為Supersil AQ C18柱；流動相用甲醇-水梯度洗脫，洗脫程序見表1，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾；流速1.0 mL·min-1；檢測波長278 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

表1 洗脫程序

時間/min 甲醇/% 水/%

0 10 90

8 30 70

18 80 20

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長選擇

利用Agilent 1260 液相色譜儀（紫外檢測器）對200～400 nm波長的香蘭素標(biāo)準(zhǔn)中間液進行掃描，設(shè)置縱橫軸分別為吸光度和波長，對數(shù)據(jù)進行可視化處理后得到吸收波長圖，共有3處吸收峰是香蘭素的吸收峰，分別為230 nm、278 nm、309 nm。進一步對比分析發(fā)現(xiàn)，230 nm處的峰形與敏感性雖好，但對應(yīng)的干擾很明顯，因而選擇其他兩個吸收峰對應(yīng)的波長為檢測波長。同時，測定發(fā)現(xiàn)，278 nm的吸收峰峰形對稱度更高，干擾小。因此，最終確定檢測波長為278 nm。

2.2 流動相選擇

對比甲醇-水和乙腈-水作為流動相時的檢測效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，香蘭素在兩種流動相中的色譜保留性能和峰響應(yīng)強度均較好。其中，香蘭素在甲醇-水體系中能更快體現(xiàn)高強度峰響應(yīng)，所以選定甲醇-水體系為本實驗的流動相。

2.3 凈化條件優(yōu)化

嬰幼兒羊奶粉經(jīng)乙醇溶劑提取后，還含有少量脂肪，為了減輕油脂對測定結(jié)果的影響，選擇正己烷作為凈化溶劑。取用乙醇2 mL，分別加入正己烷0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL使之純化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入正己烷0.5 mL純化后，再次進行離心過濾，可以有效凈化脂肪。同時，樣品在預(yù)處理過程中沒有受到其他雜質(zhì)的干擾，純化效果較好。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性范圍

對香蘭素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行測定，以香蘭素濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，在0.5～50.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性方程為y=48 429x-265.96，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

2.4.2 檢出限、定量限試驗

在3倍信噪比的進樣濃度水平下計算得出，檢出限為0.17 μg·mL-1；在10倍信噪比的進樣濃度水平下計算得出，定量限為0.51 μg·mL-1。

2.4.3 加標(biāo)回收率

向空白奶粉樣品基質(zhì)中分別添加5 mg·kg-1、

10 mg·kg-1和100 mg·kg-1 3個加標(biāo)水平的香蘭素標(biāo)品，平行測定6次，計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。

2.5 實際樣品測定

采用所建立的方法對6個品牌的18個嬰幼兒羊奶粉中香蘭素的含量進行檢測。結(jié)果顯示，6個品牌的一段奶粉均未檢出香蘭素，符合GB 2760—2014對0～6個月嬰兒乳粉無香精香料添加的限定；6個品牌的二段奶粉中有1個品牌檢測出香蘭素，含量為12.27 mg·kg-1；6個品牌的三段奶粉中有4個品牌檢測出香蘭素，含量為27.11～39.25 mg·kg-1。雖然檢出量并未超過現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014，但考慮到2025年2月即將實行的GB 2760—2024不允許添加任何香精香料類產(chǎn)品，相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)及時調(diào)整工藝流程，杜絕添加香蘭素及其他香精香料。

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了色譜檢測時Agilent 1260 液相色譜儀（紫外檢測器）的波長選擇條件，確定了278 nm處的波長為最佳檢測波長；考察了不同流動相的分離效果，確定了甲醇-水為流動相，香蘭素可被有效分離；確定了0.5 mL正己烷可有效凈化奶粉中的脂肪，最終建立了一種利用HPLC測定嬰幼兒羊奶粉中香蘭素的快速檢測方法。HPLC用于嬰幼兒羊奶粉中香蘭素的測定具有較好的應(yīng)用價值，可為嬰幼兒羊奶粉的安全性評價提供有力的技術(shù)支撐。

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