楊睿 魏瓊 孫逸坤 趙夢竹 程序 劉夢華 張冬梅

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81973780）

作者單位：北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院/中醫(yī)內科學教育部和北京市重點實驗室（郵編100700）

作者簡介：楊睿（1993），女，主治中醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥防治心血管疾病方面研究。E-mail：Reyoung12@126.com

△通信作者 E-mail：chaweto@126.com

摘要：目的 探討缺氧狀態(tài)下大鼠心肌細胞H9c2來源外泌體對血管新生的影響。方法 采用混合氣體法制備H9c2細胞缺氧模型，以正常培養(yǎng)細胞為對照。分別提取2組細胞分泌的外泌體，采用納米顆粒跟蹤分析檢測外泌體的濃度和粒徑，透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)和大小，Western blot驗證外泌體標志蛋白。制備人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）缺氧模型，并與H9c2外泌體共同孵育，分為常氧組、缺氧組、缺氧+正常H9c2外泌體（EXO-C）組和缺氧+缺氧H9c2外泌體（EXO-M）組。通過CCK-8法、細胞劃痕實驗、Matrigel體外三維成形實驗分別檢測HUVEC增殖、遷移、成管能力。結果 外泌體鑒定結果顯示常氧組和缺氧組H9c2外泌體樣本顆粒濃度均處于1×107～1×1012/mL，粒徑大小40～160 nm；形態(tài)特征均為球形或茶托狀結構，大小均一，形態(tài)完整；外泌體標志蛋白腫瘤易感基因101（TSG101）、CD63、CD9均有表達，無陰性蛋白鈣聯(lián)蛋白（Calnexin）的表達。與常氧組比，缺氧組HUVEC增殖能力、遷移面積、遷移率均顯著下降，參與成管的長度及分支數(shù)、節(jié)點數(shù)均減少（P＜0.01）；與缺氧組比，EXO-M組HUVEC細胞增殖能力下降，遷移面積減少、遷移率下降，參與成管長度及分支數(shù)進一步減少（P＜0.05）；與EXO-C組相比，EXO-M組增殖能力下降，細胞遷移面積減少，遷移率下降（P＜0.01）。結論 缺氧H9c2來源的外泌體對HUVEC增殖、遷移、成管能力有一定程度的抑制作用。

關鍵詞：外泌體；心肌梗死；內皮細胞；低氧；血管新生

中圖分類號：R54，R363文獻標志碼：ADOI：10.11958/20231930

Effects of hypoxia H9c2 exosome on proliferation，migration and tube formation of HUVEC

YANG Rui， WEI Qiong， SUN Yikun， ZHAO Mengzhu， CHENG Xu， LIU Menghua， ZHANG Dongmei△

Dongzhimen Hospital， Ministry of Education and Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine

Internal Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China

△Correspongding Author E-mail： chaweto@126.com

Abstract： Objective To investigate the role of H9c2-derived exosomes in regulating angiogenesis in rat cardiomyocytes under hypoxia. Methods The hypoxia model of H9c2 cells was prepared by mixed gas method （the hypoxia model group）， and the normal cultured cells were used as the control group. The exosomes secreted by the two groups of cells were extracted respectively. The concentration and particle size of exosomes were detected by nanoparticle tracking analysis. The morphology and size of exosomes were detected by transmission electron microscopy. Western blot assay was used to verify the exosome marker proteins. The hypoxia model of human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） was established. HUVECs were incubated with H9c2 exosomes and divided into the normoxia group， the hypoxia group， the hypoxia + normal H9c2 exosomes （EXO-C） group and the hypoxia + hypoxia H9c2 exosomes （EXO-M） group. The proliferation， migration and tube formation of HUVECs were detected by CCK-8 method， cell scratch test and Matrigel in vitro three-dimensional forming test. Results The results of exosome identification showed that the particle concentration of H9c2 exosome samples was 1×107-1×1012 particles/mL and the particle size was 40-160 nm in the normoxia group and the hypoxia group. The morphological characteristics were spherical or saucer-like structure， uniform in size and complete in shape. Exosome marker proteins TSG101， CD63 and CD9 were expressed， and there was no expression of negative protein Calnexin. Compared with the normoxic group， the proliferation ability， migration area and migration rate of HUVEC were significantly decreased in the hypoxic group， and the length of tube， the number of branches and the number of nodes were decreased （P＜0.01）. Compared with the hypoxia group， the proliferation ability of HUVEC cells was decreased， the migration area was decreased， the migration rate was decreased and the length and number of branches involved in tube formation were further decreased in the EXO-M group （P＜0.05）. Compared with the EXO-C group， the proliferation ability of the EXO-M group decreased， the cell migration area decreased and the migration rate decreased （P＜0.01）. Conclusion Exosomes derived from hypoxic H9c2 can inhibit the proliferation， migration and tube formation of HUVEC.

Key words： exosomes; myocardial infarction; endothelial cells; hypoxia; angiogenesis

急性心肌梗死（AMI）具有高發(fā)病率和高死亡率，為心血管系統(tǒng)的危急重癥［1］。其發(fā)病機制主要是心臟冠狀動脈血供急劇減少或中斷而導致相應區(qū)域心肌細胞的氧氣和營養(yǎng)物質供應不足，進而引發(fā)部分心肌壞死。治療性血管新生作為AMI后的一種特殊治療手段，可在原有的受阻血管基礎上，通過刺激新生血管網(wǎng)的生成來建立有效的側支循環(huán)，以彌補原本動脈供血的不足，重新恢復心臟缺血區(qū)氧氣和營養(yǎng)供應，從而達到治療的目的［2］。研究表明，外泌體可通過調節(jié)心肌梗死（MI）后血管生成相關因子的表達，調控內皮細胞增殖、遷移和管腔形成，從而促進或抑制血管新生［3-4］。作為細胞間通訊的重要載體，外泌體對微環(huán)境的改變響應迅速，是血管新生調控過程中的重要因素。但目前缺氧條件下心肌細胞來源外泌體對血管新生的影響尚存爭議。心肌細胞缺氧模型和內皮細胞缺氧模型是體外模擬AMI的常用模型，而血管內皮細胞的增殖、遷移、成管能力是血管新生過程中的關鍵環(huán)節(jié)。因此，本研究采用混合氣體法制備細胞缺氧模型并提取細胞外泌體，通過人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增殖、遷移、成管實驗，探討缺氧狀態(tài)下大鼠心肌細胞H9c2來源外泌體對血管新生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 （1）細胞。大鼠心肌細胞H9c2來源于大鼠胚胎心肌細胞系，購于國家生物醫(yī)學實驗細胞資源庫（編號：1101RAT-PUMC000219）。HUVEC購于中喬新舟生物科技（上海）有限公司。（2）主要試劑及儀器。ECM培養(yǎng)基購自中喬新舟生物（上海）有限公司；胎牛血清購于Gibco公司；CD9抗體、CD63抗體購于安諾倫（北京）生物科技有限公司，TSG101抗體購于Abcam公司，Calnexin抗體購于圣克魯斯生物技術（上海）有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；外泌體提取試劑盒、外泌體專用培養(yǎng)基購自宇玫博生物科技（上海）有限公司；胰酶中和液、牛源纖維黏連蛋白購自美國Sciencell研究實驗室；Matrigel基底膠、磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM高糖培養(yǎng)基購自索萊寶科技（北京）有限公司；HRP-山羊抗小鼠IgG（H+L）、HRP-山羊抗兔IgG（H+L）購自博士德生物（中國）有限公司。MCO-20AIC二氧化碳細胞培養(yǎng)箱購于日本SANYO公司；MiniGalaxy A缺氧培養(yǎng)箱購于英國RS biotech公司；IMT-2倒置相差顯微鏡購于日本Olympus公司；納米顆粒跟蹤分析儀購于德國Particle Metrix公司；透射電子顯微鏡購于北京中榆科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 H9c2缺氧模型建立及分組 將H9c2細胞分為正常對照組和模型組。模型組采用混合氣體法制備H9c2細胞缺氧模型。細胞置于缺氧培養(yǎng)箱（37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2）中分別培養(yǎng)0、24、30、48、54 h，建立缺氧H9c2細胞模型；正常對照組細胞置于常規(guī)培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)相應時間。向2組細胞中加入CCK-8工作液，取空白孔加入等量CCK-8工作液作為空白對照組，避光孵育1.5 h，檢測各組光密度（OD）值，計算H9c2細胞存活率。細胞存活率=（模型組OD值-空白對照組OD值）/（正常對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。根據(jù)細胞存活率確定最佳缺氧干預時間。

1.2.2 外泌體的提取 選擇最佳缺氧干預時間造模，分別收集模型組和正常對照組H9c2細胞上清樣品，向上清液中加入外泌體濃縮液，4 ℃靜置2 h以上。靜置后采用4 ℃、10 000×g離心60 min，保留沉淀為外泌體粗品。外泌體粗品用PBS重懸，4 ℃、12 000 ×g離心2 min，保留上清液。將上清液轉入外泌體純化柱上室中，4 ℃、3 000×g離心10 min，離心后收集外泌體純化柱管底的液體，即純化后的外泌體懸液。

1.2.3 納米顆粒跟蹤分析（NTA）檢測外泌體的濃度和粒 徑 用去離子水清洗樣本池，以聚苯乙烯微球標準品110 nm校準；再次以1×PBS buffer清洗樣本池，用粒子矩陣ZetaView PMX 110在405 nm發(fā)射光下對分離得到的外泌體進行濃度測定；PBS稀釋2組外泌體（約1×107～1×109/mL為宜），測定其大小及質量。每個樣本重復檢測3次。

1.2.4 透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)和大小 將8 μL外泌體懸液加到載樣銅網(wǎng)上，靜置1 min；濾紙吸去多余的外泌體樣品后滴加15 μL 2%醋酸雙氧鈾，室溫染色1 min，干燥 5 min后，100 kV下拍攝電鏡照片。

1.2.5 Western blot檢測外泌體標志蛋白表達 將提取純化后的外泌體加入等量的外泌體專用裂解液，冰上裂解10 min；BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白定量結果，向提取的外泌體樣品中加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮樣20 min，電泳1 h，200 mA恒流條件下轉膜100 min；5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h，孵育一抗TSG101（1︰1 000）、CD63（1︰1 000）、CD9（1︰1 000）、Calnexin（1︰200），4 ℃冰箱孵育過夜；TBST洗滌后用二抗（1∶5 000）孵育1 h；TBST再次洗滌，置于發(fā)光液中避光反應1～5 min后曝光，根據(jù)蛋白預染Marker位置判斷目標條帶的位置。

1.2.6 CCK-8法檢測不同濃度外泌體對HUVEC增殖的影響 HUVEC分為常氧H9c2外泌體干預組（EXO-C組）和缺氧H9c2外泌體干預組（EXO-M組），分別用含外泌體終質量濃度為0、5、10、20、30 mg/L的專用培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，加入CCK-8工作液避光孵育3 h，檢測并確定外泌體干預的最佳濃度。

1.2.7 CCK-8法檢測H9c2外泌體對缺氧HUVEC增殖的影響 將HUVEC分為常氧組、缺氧組、EXO-C組、EXO-M組。常規(guī)培養(yǎng)待細胞融合率＞70%時換含0.5%胎牛血清的ECM培養(yǎng)基同步化24 h。缺氧組、常氧組換外泌體專用培養(yǎng)基，EXO-C組換含合適濃度常氧H9c2外泌體的專用培養(yǎng)基，EXO-M組換含對應濃度缺氧H9c2外泌體的專用培養(yǎng)基。缺氧組、EXO-C組、EXO-M組置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，常氧組置于正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按1.2.6中CCK-8法檢測HUVEC增殖情況，每個樣本均設6個復孔，重復6次取均值。

1.2.8 細胞劃痕實驗檢測H9c2外泌體對缺氧HUVEC遷移的影響 取對數(shù)期生長期的HUVEC，均勻接種于提前包被好的6孔板（6孔板底部劃線，使得每孔有3條平行線穿過），每孔加入2.5 mL細胞懸液，按照1.2.7所述方法造模及分組；待細胞融合成片且無較大細胞空隙時，用200 ?L槍頭垂直于標記線在底部劃線；吸棄培養(yǎng)基后用PBS沖洗細胞，去除劃下和凋亡的細胞；各組均換用基礎ECM培養(yǎng)基，培養(yǎng)0 h、12 h后于倒置顯微鏡下拍照，每個樣本均設6個復孔，重復6次取均值。使用Image J軟件對2次照片之間劃痕面積進行統(tǒng)計分析，計算遷移率。遷移率（%）=（A0-AX）/A0×100%，A0表示初始劃痕面積，AX表示測量時的殘留面積。

1.2.9 Matrigel基質膠檢測H9c2外泌體對缺氧HUVEC成管能力的影響 取50 ?L Matrigel基質膠，平鋪于4 ℃預冷的96孔板內，37 ℃孵育30 min使其凝固；按照1.2.7所述方法造模及分組；胰酶消化后收集各組細胞懸液，離心后加入基礎ECM培養(yǎng)基重懸，按2×105 個/mL將細胞接種于含凝固Matrigel基質膠的96孔板中，每孔100 ?L，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育6 h后，倒置顯微鏡下觀察各組HUVEC成管情況并拍照記錄，每個樣本均設6個復孔，重復6次取均值。使用Image J軟件對成管情況進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism8、Photoshop進行繪圖。計量資料以均數(shù)±標準差（[x] ±s）表示，2組比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同缺氧時間對H9c2心肌細胞存活率的影響 缺氧24、30、48、54 h時細胞存活率較缺氧0 h下降，缺氧48 h時細胞存活率較缺氧24、30 h均下降（P＜0.05），見圖1。為保證既能成功制備心肌細胞缺氧模型，又能提取較多的外泌體以順利開展后續(xù)研究，本研究選取缺氧48 h作為造模條件。

2.2 NTA檢測血清外泌體的顆粒濃度和粒徑 常氧組H9c2外泌體樣本的顆粒濃度為1.6×1011/mL，粒徑峰值95.1 nm，峰面積占比93.4%，峰形尖銳，無雜峰（圖2A）；缺氧組H9c2外泌體樣本的顆粒濃度為9.4×1010/mL，粒徑峰值94.5 nm，主峰面積占比86.8%，且峰形尖銳，無雜峰（圖2B）。本實驗所提取的常氧組和缺氧組H9c2外泌體的樣本顆粒濃度在1×107～1×1012/mL，粒徑大小40～160 nm。

2.3 透射電子顯微鏡檢測血清外泌體的形態(tài)和大小 透射電子顯微鏡下常氧組H9c2外泌體樣本（圖3A）和缺氧組H9c2外泌體樣本（圖3B）的形態(tài)特征均為典型的球形或茶托狀結構，直徑在100 nm左右，大小均一，形態(tài)完整。

2.4 外泌體的標志蛋白表達 外泌體陽性標志蛋白TSG101、CD63、CD9在常氧/缺氧H9c2外泌體樣本（圖4A、B）和H9c2細胞（圖4C、D）中均有表達，外泌體陰性蛋白Calnexin在細胞樣本中有少量表達，在外泌體樣本中未見表達。

2.5 不同濃度H9c2外泌體對HUVEC細胞活力的影響 用不同濃度的2組H9c2外泌體分別與正常HUVEC共孵育24 h后，與對照組（0 mg/L EXO-C組）相比，常氧H9c2外泌體濃度為20 mg/L、30 mg/L時，HUVEC細胞活力下降（F=5.016，P＜0.05）；與對照組（0 mg/L EXO-M組）相比，各濃度的缺氧H9c2外泌體均能顯著抑制HUVEC的活力（F=7.682，P＜0.01）。外泌體濃度相同時進行比較，當外泌體濃度為10 mg/L時，EXO-M組對HUVEC活力的抑制程度大于EXO-C組（t=3.041，P＜0.05），故后續(xù)實驗選擇10 mg/L為外泌體干預濃度。見圖5。

2.6 各組HUVEC增殖情況 與常氧組比，缺氧組HUVEC增殖率顯著下降；與缺氧組比，EXO-C組和EXO-M組HUVEC增殖率均下降；與EXO-C組比，EXO-M組增殖率進一步下降（P＜0.05），見圖6。

2.7 各組HUVEC遷移能力情況 與常氧組比，缺氧組HUVEC細胞遷移面積減小，遷移率下降（P＜0.05）；與缺氧組比，EXO-M組HUVEC遷移面積進

3 討論

3.1 缺氧誘導心肌細胞來源的外泌體抑制血管新生 外泌體可以來源于多種類型的細胞，包括一般不被認為是典型分泌細胞的心肌細胞。在AMI造成的缺氧環(huán)境誘導下，心肌細胞可以釋放大量外泌體。研究表明，暴露于中度缺氧2 h可使心肌細胞釋放的外泌體數(shù)量增加2倍［5］。但缺氧條件誘導心肌細胞分泌的外泌體對血管新生的調控作用尚未達成一致。有研究表明，心肌梗死后的心肌細胞外泌體中富含的miR-19a-3p能減弱心肌梗死后小鼠的心臟功能，并通過缺氧誘導因子-1α抑制內皮細胞的增殖和血管生成［6］。另有研究表明心肌細胞在低氧情況下釋放含有高表達CircHIPK3的外泌體，可以通過抑制miR-29a活性來促進血管內皮生長因子表達，進而促進心肌內皮細胞的細胞周期進程和增殖，并減少梗死面積［7］。為了進一步探索心肌細胞來源的外泌體與AMI后血管新生的關系及其作用機制，本研究采用缺氧培養(yǎng)模擬體外心肌梗死后心臟環(huán)境，造模成功后提取心肌細胞外泌體并進行鑒定，再觀察不同組別外泌體對HUVEC細胞的影響。結果顯示，H9c2心肌細胞來源的外泌體均對HUVEC細胞增殖、遷移、成管能力有一定程度的抑制作用，其中，缺氧誘導H9c2心肌細胞來源外泌體的抑制作用更明顯。由此，筆者認為缺氧誘導心肌細胞來源的外泌體可以抑制血管新生。

3.2 缺氧H9c2來源的外泌體可能通過其內載物調控血管新生 張春祥等［8］認為MI后心肌細胞來源的外泌體可以部分反映心臟的病理狀態(tài)，其可能會加重心臟損傷，也可能具有一定的治療作用。既往也有實驗證明外泌體治療可改善MI動物模型心功能、減輕炎癥反應、減少細胞凋亡和自噬等［9］。因此，在本實驗的基礎上進一步深入研究缺氧H9c2心肌細胞來源外泌體抑制血管新生的具體機制有助于實現(xiàn)在分子水平上的精準調控，對推進外泌體治療AMI進程具有重要意義。

外泌體被稱為“細胞間信息傳遞的使者”，可以直接與鄰近細胞相互作用，也可以間接通過體循環(huán)與遙遠的受體細胞相互作用。作為生物體中天然存在且可以提取的一種內源性物質，外泌體具有靶向特異性、良好的生物相容性、不易被免疫清除以及易通過多種生物屏障等特點，是機體內重要的信息運載體。外泌體主要通過攜帶的內容物包括脂質、代謝物、蛋白質、microRNAs、mRNAs、LncRNAs和DNA等［10］來發(fā)揮作用，其特有的雙層脂質膜結構使得被包裹物不受外界酶解物影響，可以更穩(wěn)定高效地遠距離輸送內容物到受體細胞發(fā)揮生物學作用。因而，當微環(huán)境變化后，外泌體數(shù)量改變或內容物成分改變均可能引起一系列生物學反應。有研究表明，在缺氧處理的心肌細胞分泌的外泌體中，miRNAs表達譜出現(xiàn)顯著差異，許多與血管新生相關的miRNAs，如miR-211、miR-143等被高度選擇性地分選入外泌體［11］。侯永波等［12］也認為不同微環(huán)境下的心肌細胞分泌的外泌體由于內容物有所差異，因而會發(fā)揮出不同的心肌修復能力。因此，既往已知的關于缺氧后心肌細胞分泌的外泌體與血管新生關系的研究結果之所以存在不一致性，也可能與其重點研究的外泌體內容物不同有關，這提示研究外泌體內容物對深入了解外泌體如何在細胞通訊間發(fā)揮作用具有重要意義。

基于本次研究發(fā)現(xiàn)缺氧H9c2心肌細胞來源的外泌體對HUVEC細胞增殖、遷移、成管能力具有抑制作用，筆者認為缺氧環(huán)境下外泌體可能參與介導心肌細胞與內皮細胞之間的信息傳遞，缺氧H9c2來源外泌體中可能存在抗血管新生的調控分子，但其具體調控機制尚不清楚，有待后續(xù)研究進一步探討。

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（2024-01-10收稿 2024-03-05修回）

（本文編輯 李鵬）