吳靜 范志娟 劉樹業(yè)

基金項目：天津市衛(wèi)生健康科技項目重點學(xué)科專項（TJWJ2023XK021）

作者單位：天津市第三中心醫(yī)院檢驗科，天津市重癥疾病體外生命支持重點實驗室，天津市人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，天津市肝膽疾病研究所（郵編300170）

作者簡介：吳靜（1982），女，副研究員，主要從事肝癌診斷新技術(shù)及個體化診療標(biāo)志物方面研究。E-mail：wujing-tj@outlook.com

△通信作者 E-mail：lshye@163.com

摘要：目的 探究慢性乙型肝炎（CHB）發(fā)展為肝硬化（LC）并最終發(fā)展為肝細(xì)胞癌（HCC）過程中血漿游離氨基酸水平的變化及臨床意義。方法 對49例CHB患者（CHB組）、43例CHB相關(guān)LC患者（LC組）和50例CHB相關(guān)HCC患者（HCC組）的血漿樣本進行氨基酸譜的分析，比較各組間氨基酸水平的差異。同時采用MetaboAnalyst網(wǎng)站對相關(guān)的氨基酸代謝通路進行分析。結(jié)果 共鑒定出16種表達(dá)水平有差異的氨基酸。從CHB發(fā)展到LC再到HCC的過程中，血漿胱氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸水平逐漸升高，支鏈氨基酸/芳香族氨基酸逐漸降低；與CHB組和LC組比較，HCC組中的牛磺酸、蛋氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、谷氨酸、異亮氨酸和色氨酸水平升高，精氨酸水平降低；與CHB組比較，LC組和HCC組中絲氨酸、丙氨酸、脯氨酸升高，HCC組中纈氨酸水平升高（均P＜0.05）。3組的代謝通路分析表明，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成和?；撬岽x等多種代謝途徑發(fā)生了顯著變化。此外，通過構(gòu)建氨基酸-酶-基因相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，共發(fā)現(xiàn)了79個與氨基酸表達(dá)相關(guān)的代謝酶基因。結(jié)論 血漿氨基酸水平對肝癌的早期預(yù)警和預(yù)后具有一定指導(dǎo)意義，可為肝癌的早期預(yù)警和治療提供理論基礎(chǔ)和方法依據(jù)。

關(guān)鍵詞：乙型肝炎，慢性；肝硬化；肝腫瘤；氨基酸類

中圖分類號：R575.1，R575.2，R735.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20231456

Changes and clinical significance of plasma free amino acid levels in the development of chronic hepatitis B to hepatocellular carcinoma

WU Jing， FAN Zhijuan， LIU Shuye△

Department of Clinical Laboratory， the Third Central Hospital of Tianjin， Tianjin Key Laboratory of Extracorporeal

Life Support for Critical Diseases， Artificial Cell Engineering Technology Research Center，

Tianjin Institute of Hepatobiliary Disease， Tianjin 300170， China

△Corresponding Author E-mail： lshye@163.com

Abstract： Objective To investigate changes? and clinical significance in plasma free amino acid levels during the progression from chronic hepatitis B （CHB） to liver cirrhosis （LC） and ultimately to hepatocellular carcinoma （HCC）. Methods The plasma samples of 49 CHB patients， 43 CHB-related LC patients and 50 CHB-related HCC patients were analyzed using the Hitachi L-8900 amino acid analyzer. The differences in amino acid levels were compared between groups. Simultaneously， the MetaboAnalyst website was used to analyze the relevant amino acid metabolism pathways. Results A total of 16 amino acids with different expression levels were identified. During the development from CHB to HCC， plasma levels of cystine， phenylalanine and glycine gradually increased， while the ratio of branched chain amino acids/aromatic amino acids gradually decreased. Compared with the CHB and the LC groups， levels of taurine， methionine， tyrosine， ornithine， glutamate， isoleucine and tryptophan were significantly increased in the HCC group， while the level of arginine was significantly lower. Compared with the CHB group， levels of serine， alanine and proline were higher in the LC and the HCC groups， while the level of valine was also higher in the HCC group （all P＜0.05）. The metabolic pathway analysis of three groups showed significant changes in various metabolic pathways， including phenylalanine， tyrosine， tryptophan biosynthesis， phenylalanine metabolism， glycine， serine， threonine metabolism， valine， leucine， isoleucine biosynthesis， and taurine metabolism. In addition， by constructing a network diagram of amino acid enzyme gene interactions， a total of 79 metabolic enzyme genes related to amino acid expression were discovered. Conclusion Plasma levels of amino acids are of certain guiding significance for early warning and prognosis of HCC and can provide a theoretical basis and methodological basis for the diagnosis and treatment of HCC in the future.

Key words： hepatitis B， chronic; liver cirrhosis; liver neoplasms; amino acids

全球約三分之一的人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），其中2.4億～3.5億將發(fā)展為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）［1］。大多數(shù)CHB患者無明顯癥狀，但可能發(fā)展為肝硬化（liver cirrhosis，LC）甚至肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［2］。LC是一個長期的病理過程，而CHB是導(dǎo)致LC的主要原因之一。HCC是成人最常見的慢性肝癌類型，也是LC患者最常見的死因。慢性HBV感染通過反復(fù)誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答，導(dǎo)致肝細(xì)胞被病毒感染，并最終進展為HCC［3］。肝臟是體內(nèi)氨基酸代謝的主要器官。當(dāng)肝臟受損傷時，氨基酸代謝會發(fā)生紊亂，肝臟受損傷的程度不同，血漿氨基酸水平的變化也各不相同。這些變化常與肝臟的病理改變程度有較好的一致性［4］。因此，分析體內(nèi)氨基酸水平有助于診斷肝臟的受損傷程度。支鏈氨基酸水平在肝癌患者中表達(dá)下調(diào)，補充支鏈氨基酸可以提高患者的生存質(zhì)量［5］。然而，有關(guān)CHB進展為HCC過程中多類氨基酸水平變化的研究鮮見報道。本研究通過對CHB及其相關(guān)LC和HCC患者的血漿氨基酸水平進行測定，旨在探討CHB進展為HCC過程中血漿氨基酸代謝譜和代謝途徑的動態(tài)變化及其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2021年10月—2023年6月于天津市第三中心醫(yī)院肝膽科就診的142例患者為研究對象，年齡28～85歲，平均（56.33±17.22）歲；其中49例CHB患者、43例CHB相關(guān)LC患者和50例CHB相關(guān)HCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）CHB和LC的診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。（2）HCC的診斷符合《原發(fā)性肝癌診療指南（2022年版）》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。排除已使用氨基酸藥物及患有影響氨基酸代謝疾病（如感染性、炎癥性疾病等）的患者。同期選取50例來院檢查的健康體檢者為對照組，年齡23～79歲，平均（56.10±10.55）歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，且研究對象或其家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實驗室檢查 取研究對象晨起空腹靜脈血3 mL，用肝素抗凝，室溫靜置30 min后，12 000 r/min離心10 min。分離血漿，置于-80 ℃冰箱中保存。全自動生化分析儀檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶? （γ-GGT）、堿性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）、白蛋白/球蛋白（A/G）、總膽汁酸（TBA）、總膽紅素（TBIL）、結(jié)合膽紅素（DBIL）和甲胎蛋白（AFP）。

1.2.2 氨基酸檢測 取研究對象晨起空腹靜脈血2～3 mL，用肝素抗凝，3 000 r/min離心10 min后取上清液，加入8%磺基水楊酸混勻，靜置30 min后12 000 r/min離心15 min，將上清液用0.45 μm的濾器過濾后加入樣品瓶中，再放到樣品架上，使用日立L-8900型高速全自動氨基酸分析儀對樣本進行氨基酸檢測。顯色液茚三酮、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液和緩沖液均購自FUJIFILM Wako Pure Chemical公司。

1.2.3 氨基酸代謝通路和代謝網(wǎng)絡(luò)圖分析 通過采用MetaboAnalyst網(wǎng)站（http：//www.metaboanalyst.ca）和Cytoscape軟件進行代謝通路和代謝網(wǎng)絡(luò)圖分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以[[x] ±s

]表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法；非正態(tài)數(shù)據(jù)采用 M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實驗室指標(biāo)比較 所有患者乙肝表面抗原（HBsAg）均呈陽性。與對照組比較，CHB組、LC組和HCC組的ALT、AST、AFP水平升高；與CHB組比較，LC組和HCC組γ-GGT、TBA、AFP水平升高；與LC組比較，HCC組的γ-GGT、TBIL、DBIL、ALP、AST和AFP水平升高，A/G和ALB水平降低（均P＜0.05）。見表1。

2.2 各組患者血漿氨基酸水平比較 見表2。從CHB到LC再發(fā)展到HCC的過程中，血漿胱氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸水平逐漸升高，支鏈氨基酸/芳香族氨基酸（BCAA/AAA）逐漸降低，而蘇氨酸水平先升高后降低；與CHB和LC組比較，HCC組中的?；撬帷⒌鞍彼?、酪氨酸、鳥氨酸、谷氨酸、異亮氨酸和色氨酸水平升高，精氨酸水平降低；與CHB組比較，LC和HCC組中絲氨酸、丙氨酸和脯氨酸升高，HCC組中纈氨酸水平升高（均P＜0.05）。各組患者的賴氨酸、亮氨酸、組氨酸和天冬氨酸水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 CHB、LC和HCC差異表達(dá)氨基酸的代謝通路分析 通過人類代謝組數(shù)據(jù)庫（Human Metabolome Database，HMDB）搜索以上有變化趨勢氨基酸的HMDB ID，并將其導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建相關(guān)代謝通路，共發(fā)現(xiàn)19類代謝通路，3組間氨基酸水平的變化主要與19類代謝通路有關(guān)，見圖1、2。而主要富集的代謝通路有5類，按富集比率從大到小依次為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，牛磺酸代謝以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（均P＜0.05），見表3。

2.4 3組差異表達(dá)氨基酸相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)分析 為進一步鑒定差異表達(dá)氨基酸相關(guān)的代謝酶和基因，通過Cytoscape構(gòu)建了氨基酸-酶-基因相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，共獲得了79個與氨基酸表達(dá)相關(guān)的代謝酶基因，見圖3。

3 討論

3.1 氨基酸代謝紊亂是慢性肝病和肝癌發(fā)生的重要特征 肝癌是常見的惡性腫瘤之一，對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅［8］。由CHB引發(fā)LC并最終發(fā)展為HCC仍然是HCC和肝功能衰竭的主要原因之一。深入研究CHB向HCC發(fā)展過程中與病理改變相關(guān)的代謝變化，對進一步探索治療HCC的新策略具有重要意義。研究表明，氨基酸代謝紊亂與慢性肝病和肝癌的發(fā)生密切相關(guān)［9］。慢性肝病患者的氨基酸和蛋白質(zhì)代謝方面主要表現(xiàn)為血氨增加、血漿白蛋白減少和血液中氨基酸譜的變化［10］。當(dāng)肝功能受損時，許多酶系統(tǒng)受損或功能受阻，減少了利用氨基酸合成蛋白，因此大量氨基酸從肝臟釋放，導(dǎo)致血液中氨基酸的濃度升高。

3.2 CHB、LC和HCC患者血漿中游離氨基酸水平變化及其臨床意義 BCAA主要包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，屬于維持人體肝臟正常功能的必需氨基酸。它們不能在人體內(nèi)合成，只能通過膳食攝取。BCAA可以調(diào)節(jié)腫瘤的生長代謝，其調(diào)控方式包括轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控以及直接改變蛋白質(zhì)水平或酶活力等［11］。BCAA缺乏可以造成腫瘤細(xì)胞的快速增殖。AAA包括苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸［12］，其功能是促進甲狀腺素和腎上腺素的合成，調(diào)節(jié)宿主局部和全身的免疫、代謝和神經(jīng)元反應(yīng)。BCAA/AAA比值的變化能較好反映肝臟受損的嚴(yán)重程度和預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，從CHB發(fā)展為HCC的過程中，患者血漿中BCAA/AAA比值逐漸降低，苯丙氨酸水平逐漸升高。因此補充BCAA和維持正常的BCAA/AAA比值對肝癌患者的生存和預(yù)后是有利的。

本研究顯示，從CHB發(fā)展為HCC過程中，患者血漿中胱氨酸和甘氨酸水平逐漸升高。與CHB和LC組比較，HCC組中谷氨酸、蛋氨酸等水平明顯升高，而精氨酸水平明顯降低。谷氨酸是生物機體內(nèi)氮代謝的基本氨基酸之一［13］，屬于生糖氨基酸，能參與腦內(nèi)蛋白質(zhì)和糖的代謝，促進氧化過程，降低血氨水平，減輕肝昏迷癥狀。由于高度增殖的腫瘤組織內(nèi)存在糖有氧代謝障礙，糖酵解增強，糖消耗量增加，因此HCC患者的谷氨酸水平會受機體調(diào)節(jié)而升高。蛋氨酸是含硫必需氨基酸，已有研究證實蛋氨酸水平的升高與肝臟細(xì)胞的損傷程度有關(guān)，蛋氨酸的缺乏會導(dǎo)致肝癌細(xì)胞DNA、RNA的合成受到抑制，肝癌細(xì)胞增殖受阻，還可能提高化療藥物的療效［14-15］，因此HCC患者血漿中蛋氨酸水平會明顯升高。而精氨酸具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移、降低復(fù)發(fā)率的作用［16］，補充精氨酸可以提高患者生存率。由于精氨酸在體內(nèi)合成速度緩慢，HCC組精氨酸水平顯著降低。絲氨酸也是一種生糖氨基酸［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，與CHB組比較，LC和HCC組中絲氨酸水平均顯著升高，這可能也是由于肝臟損傷程度的加重和病理改變以及肝癌組織的無氧酵解增強所致。

3.3 血漿氨基酸分析對肝癌早期預(yù)警和預(yù)后的意義 目前，實現(xiàn)HCC的早期診斷仍是一個難題。AFP作為臨床上廣泛使用的一個肝癌診斷標(biāo)志物，其靈敏度和特異度并不高［18］，大多數(shù)患者確診時已處于晚期。臨床研究人員一直在尋找新的診斷HCC的血液標(biāo)志物，如AFP-L3、異常凝血酶原和鱗狀細(xì)胞癌抗原［19］，但尚未廣泛使用。本研究發(fā)現(xiàn)，從CHB發(fā)展到LC再到HCC的過程中，血漿胱氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸水平逐漸升高，BCAA/AAA比值逐漸降低，蘇氨酸水平是先升高后降低。因此，多種氨基酸的組合可能有利于預(yù)測并區(qū)分CHB、LC和HCC，它們的臨床價值還有待進一步研究。監(jiān)測氨基酸相關(guān)代謝酶和代謝途徑的變化可以直接反映HCC發(fā)展過程中的代謝特征和致病機制。通過分析差異表達(dá)氨基酸和79種氨基酸相關(guān)代謝酶的聯(lián)合途徑發(fā)現(xiàn)，從CHB發(fā)展到LC再到HCC過程中顯著改變的代謝途徑主要集中在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝等。這些發(fā)現(xiàn)揭示了肝癌發(fā)展過程中的一部分代謝變化及其機制，為下一步詳細(xì)闡述氨基酸相關(guān)代謝酶的表達(dá)與肝癌發(fā)生發(fā)展之間的相關(guān)性及其潛在機制奠定了基礎(chǔ)。

CHB發(fā)展到LC再到HCC是HCC發(fā)生的三部曲，由于臨床上對患者氨基酸的分析尚未完全普及，而且對同一個患者疾病進程的追蹤研究有一定困難。因此，筆者分別選擇CHB、LC和HCC患者，比較其氨基酸水平的差異及變化趨勢，初步分析與疾病進展相關(guān)的氨基酸，并對其進行代謝通路及代謝相關(guān)酶的分析，探討與肝癌進展過程相關(guān)的代謝機制，這些對肝癌患者的早期預(yù)警和預(yù)后也具有一定的指導(dǎo)意義。

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（2023-10-17收稿 2024-03-26修回）

（本文編輯 李鵬）