徐瓊芳 鐘斐 李子帥

基金項目：湖南省教育廳科學研究項目（21C1525）

作者單位：1永州職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學院（郵編425100）；2泉州市中醫(yī)院中醫(yī)婦產(chǎn)科

作者簡介：徐瓊芳（1983），女，副教授，主要從事生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的中醫(yī)藥防治方面研究。E-mail：yymkzj@163.com

摘要：目的 探討淫羊藿苷調(diào)節(jié)基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）/CXC型趨化因子受體4（CXCR4）信號軸對多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響。方法 將從PCOS模型組大鼠卵巢組織中成功分離的顆粒細胞分為PCOS組、淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組、淫羊藿苷高劑量組、重組大鼠SDF-1蛋白（Rr-SDF-1）組、淫羊藿苷高劑量+Rr-SDF-1組，另取從正常對照組大鼠卵巢組織中成功分離的顆粒細胞作為對照組。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測卵巢顆粒細胞上清液中卵泡刺激素（FSH）、睪酮（T）、黃體生成素（LH）水平；CCK-8法、EdU染色檢測顆粒細胞增殖；流式細胞術(shù)檢測顆粒細胞凋亡；Western blot檢測顆粒細胞中Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、裂解的胱天蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）、SDF-1、CXCR4蛋白表達。結(jié)果 與對照組比較，PCOS組FSH水平、光密度（OD）450值、EdU陽性細胞率降低，T、LH水平、細胞凋亡率、Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與PCOS組比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組FSH水平、OD450值、EdU陽性細胞率均依次升高，T、LH水平、細胞凋亡率、Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表達水平均依次降低；Rr-SDF-1組對應指標變化趨勢與上述相反（P＜0.05）。與淫羊藿苷高劑量組比較，淫羊藿苷高劑量+Rr-SDF-1組FSH水平、OD450值、EdU陽性細胞率降低，T、LH水平、細胞凋亡率、Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表達水平升高（P＜0.05）。結(jié)論 淫羊藿苷可能通過抑制SDF-1/CXCR4信號通路抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細胞凋亡。

關(guān)鍵詞：淫羊藿苷；基質(zhì)細胞衍生因子-1/CXC型趨化因子受體4信號通路；多囊卵巢綜合征；顆粒細胞；增殖；凋亡

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：ADOI：10.11958/20231504

The effect of icariin on apoptosis of ovarian granulosa cells in polycystic ovary syndrome rats by regulating the SDF-1/CXCR4 signaling pathway

XU Qiongfang1， ZHONG Fei2， LI Zishuai1

1 Medical College of Yongzhou Vocational Technical College， Yongzhou 425100， China; 2 Department of Obstetrics and Gynecology， Quanzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine

Abstract： Objective To investigate the effect of icariin on apoptosis of ovarian granulosa cells in rats with polycystic ovarian syndrome （PCOS） by regulating stromal cell-derived factor-1 （SDF-1）/CXC chemokine receptor-4 （CXCR4） signal axis. Methods Granular cells successfully isolated from ovarian tissue of rats in the PCOS model group were grouped into the PCOS group， the low-dose icariin group， the medium-dose icariin group， the high-dose icariin group， the Rr-SDF-1 group and the high-dose icariin+Rr-SDF-1 group. Granular cells successfully isolated from ovarian tissue of rats in the normal control group were taken as the control group. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was applied to detect levels of follicle-stimulating hormone （FSH）， testosterone （T） and luteinizing hormone （LH） in supernatant of ovarian granulosa cells. CCK-8 method and EdU staining were applied to detect granulosa cell proliferation. Flow cytometry was applied to detect granulosa cell apoptosis. Western blot assay was applied to detect the expression of Bcl-2 associated X （Bax）， Cleaved aspartate-specific cysteine protease-3 （Cleaved Caspase-3）， SDF-1， and CXCR4 proteins in granulosa cells. Results Compared with the control group， the FSH level， OD450 value and EdU positive cell rate were decreased in the PCOS group， and T and LH levels， apoptosis rate， Bax， Cleaved Caspase-3， SDF-1 and CXCR4 protein expression increased （P＜0.05）. Compared with PCOS group， the FSH level， OD450 value and EdU positive cell rate were increased sequentially in the icariin low， medium and high dose groups， T and LH levels， apoptosis rate， Bax， Cleaved Caspase-3， SDF-1 and CXCR4 protein expression levels were decreased sequentially， and change trends of corresponding indicators were opposite to the above in the Rr-SDF-1 group （P＜0.05）. Compared with the high-dose icariin group， FSH level， OD450 value and EdU positive cell rate were decreased in the high-dose icariin+Rr-SDF-1 group， and T and LH levels， apoptosis rate， Bax， Cleaved Caspase-3， SDF-1 and CXCR4 protein expression levels were increased （P＜0.05）. Conclusion Icariin may inhibit the apoptosis of ovarian granulosa cells in PCOS rats by inhibiting the SDF-1/CXCR4 signaling pathway.

Key words： icariin; stromal cell-derived factor-1/CXC chemokine receptor-4 signaling pathway; polycystic ovarian syndrome; granular cells; proliferation; apoptosis

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育齡女性中最常見的復雜內(nèi)分泌疾病，其特征是生殖障礙、內(nèi)分泌異常和代謝紊亂［1］。此外，PCOS可能會增加子宮內(nèi)膜癌、代謝性心血管病的風險［2-3］。在臨床實踐中，PCOS患者通常采用克羅米芬和二甲雙胍藥物治療；但尚無法治愈，主要是緩解相應癥狀和預防潛在問題的發(fā)生［4］。因此，迫切需要開發(fā)治療PCOS的新方法。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，具有抗炎和抗氧化等多種生物活性［5］。有研究報道，淫羊藿苷可抑制PCOS卵巢顆粒細胞凋亡［6］，但具體機制尚不完全明確。另有研究顯示，激活基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）/CXC型趨化因子受體4（CXC chemokine receptor-4，CXCR4）通路可誘導卵巢早衰小鼠卵巢損傷［7］。據(jù)此，筆者推測淫羊藿苷是否通過調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4信號通路抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細胞凋亡。鑒于此，本研究擬探究淫羊藿苷對PCOS大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠24只，3周齡，體質(zhì)量50～60 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2022-0002，動物實驗使用許可證號：SYXK（湘）2022-0016。所有實驗程序均經(jīng)本院實驗動物管理委員會批準（批準號：202110-X38）。

1.1.2 主要試劑與儀器 淫羊藿苷購自上海脈鉑醫(yī)藥科技有限公司；脫氫表雄酮購自信陽市沐凡生物科技有限公司；重組大鼠SDF-1蛋白（Rr-SDF-1）購自北京百奧萊博科技有限公司；大鼠卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、睪酮（testosterone，T）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海杏宜生物科技有限公司；EdU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州復能基因有限公司；Annexin V FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索來寶生物科技有限公司；兔源一抗卵泡刺激素受體（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）、裂解的胱天蛋白酶-3（Cleaved aspartate-specific cysteine protease-3，Cleaved Caspase-3）、SDF-1、CXCR4、GAPDH及辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。DM2500M型熒光顯微鏡購自德國徠卡公司；MK3型酶標儀購自美國Thermo Scientific公司；BD FACSCalibur型流式細胞儀購自美國BD公司；Gel Doc XR型凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCOS模型的構(gòu)建及分組 通過連續(xù)21 d皮下注射脫氫表雄酮（溶于0.2 mL豆油，60 mg/kg，每日1次）的方式構(gòu)建PCOS模型。從造模的第16天開始，若連續(xù)4 d觀察到大鼠的陰道涂片出現(xiàn)角質(zhì)細胞，則為造模成功［8］。按照隨機數(shù)字表法將SD大鼠分為正常對照組和PCOS模型組，每組12只。PCOS模型組大鼠按照上述方法構(gòu)建PCOS模型，正常對照組大鼠皮下注射等體積的豆油代替脫氫表雄酮，其余操作同造模過程。末次處理24 h后，將大鼠禁食12 h，2%戊巴比妥鈉麻醉并處死大鼠，無菌條件下解剖并取出卵巢，然后剪取0.2 g卵巢組織用于分離卵巢顆粒細胞。

1.2.2 卵巢顆粒細胞的分離與鑒定 生理鹽水沖洗大鼠卵巢組織，除去輸卵管和脂肪，將卵巢組織置于DMEM/F12培養(yǎng)基中，用醫(yī)用針頭穿刺竇卵泡釋放顆粒細胞，并使顆粒細胞懸浮在培養(yǎng)基中，將顆粒細胞經(jīng)過濾、純化、重懸、洗滌后，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞完全貼壁后，除去未貼壁細胞。利用顯微鏡（×100）觀察培養(yǎng)3 d的細胞形態(tài)。顆粒細胞的鑒定：將細胞（1×105個/孔）置于24孔培養(yǎng)板（含載玻片）中，待細胞爬片至密度約為70%時，用4%多聚甲醛固定細胞，加入兔源一抗FSHR（1∶5 000）孵育過夜，再滴加DyLight 488標記的山羊抗兔二抗（1∶4 000）在室溫下孵育1 h，DAPI染核后，利用熒光顯微鏡觀察細胞中FSHR表達情況，以呈綠色熒光的細胞熒光強度作為判斷FSHR陽性表達的依據(jù)。

1.2.3 細胞分組 將從正常對照組、PCOS模型組大鼠卵巢組織中成功分離的顆粒細胞分別命名為對照組和PCOS組，再取PCOS組顆粒細胞，分別用15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L淫羊藿苷［6］處理24 h，并命名為淫羊藿苷低、中、高劑量組；用20 μg/L Rr-SDF-1［9］處理24 h，命名為Rr-SDF-1組；用60 μmol/L淫羊藿苷和20 μg/L Rr-SDF-1共同處理24 h，命名為淫羊藿苷高劑量+Rr-SDF-1組。處理結(jié)束后收集各組顆粒細胞或顆粒細胞上清液用于后續(xù)實驗。

1.2.4 ELISA檢測卵巢顆粒細胞上清液中FSH、T、LH的水平 取1.2.3中處理24 h后的顆粒細胞懸液200 μL，3 000 r/min離心15 min收集上清液，嚴格按照試劑盒說明書檢測卵巢顆粒細胞上清液中FSH、T、LH水平。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖 將顆粒細胞（1×105個/孔）接種于96孔板中，按照1.2.3所述進行對應處理后，向各孔中加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃下避光孵育1 h后，酶標儀測量450 nm處的光密度（OD）值。

1.2.6 EdU染色檢測顆粒細胞增殖 取1.2.3中處理24 h后的各組顆粒細胞（1×105個/孔），用100 μL 50 μmol/L EdU溶液孵育顆粒細胞2 h后，利用50 μL細胞固定液固定細胞30 min，100 μL 1×Apollo染色液孵育30 min，再用100 μL 1×Hoechst 33342反應液對細胞進行核染色，通過熒光顯微鏡觀察EdU陽性細胞形成情況，EdU陽性細胞率（%）=EdU陽性細胞數(shù)/Hoechst 33342陽性細胞數(shù)×100%。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測顆粒細胞凋亡 取1.2.3中處理24 h后的各組顆粒細胞，將顆粒細胞重懸于預冷的結(jié)合緩沖液中，并調(diào)整細胞密度為1×105個/mL。取200 μL細胞懸液，經(jīng)Annexin V-FITC和PI溶液避光染色15 min。1 h內(nèi)上機完成檢測，并評估顆粒細胞凋亡。

1.2.8 Western blot檢測顆粒細胞中Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表達 RIPA裂解緩沖液用于提取1.2.3中處理24 h后的各組顆粒細胞總蛋白，每組細胞設置6個復孔，提取的蛋白經(jīng)BCA法定量后，取30 μg蛋白樣品進行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（100 V恒壓）分離，再將凝膠上的蛋白樣本以0.65 mA/cm2的恒流電轉(zhuǎn)移2 h轉(zhuǎn)至PVDF膜上，PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1.5 h后，在4 ℃下將膜與兔源一抗Bax（1∶5 000）、Cleaved Caspase-3（1∶5 000）、SDF-1（1∶4 000）、CXCR4（1∶3 000）、GAPDH（1∶4 000）孵育過夜，TBST漂洗后，再將膜與山羊抗兔二抗（1∶5 000）在室溫條件下孵育1 h。加入ECL試劑可視化蛋白，使用Image-Pro Plus 6.0軟件評估目的蛋白灰度值。以GAPDH為蛋白內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 9.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（[x] ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢顆粒細胞的形態(tài)觀察及鑒定 培養(yǎng)3 d的卵巢顆粒細胞呈紡錘體形態(tài)，見圖1。免疫熒光染色顯示，與對照組（0.98±0.08）比較，PCOS組（8.63±0.37）細胞中FSHR陽性表達水平升高（t=49.501，P＜0.01），見圖2。

2.2 淫羊藿苷對各組卵巢顆粒細胞上清液中FSH、T、LH水平的影響 與對照組比較，PCOS組卵巢顆粒細胞上清液中FSH水平降低，T、LH水平升高（P＜0.05）。與PCOS組比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組卵巢顆粒細胞上清液中FSH水平依次升高，T、LH水平依次降低；Rr-SDF-1組卵巢顆粒細胞上清液中FSH水平降低，T、LH水平升高（P＜0.05）。與淫羊藿苷高劑量組比較，淫羊藿苷高劑量+Rr-SDF-1組卵巢顆粒細胞上清液中FSH水平降低，T、LH水平升高（P＜0.05）。見表1。

2.3 淫羊藿苷對各組卵巢顆粒細胞增殖的影響 與對照組比較，PCOS組卵巢顆粒細胞OD450值、EdU陽性細胞率降低（P＜0.05）。與PCOS組比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組卵巢顆粒細胞OD450值、EdU陽性細胞率均依次升高；Rr-SDF-1組卵巢顆粒細胞OD450值、EdU陽性細胞率降低（P＜0.05）。與淫羊藿苷高劑量組比較，淫羊藿苷高劑量+Rr-SDF-1組卵巢顆粒細胞OD450值、EdU陽性細胞率降低（P＜0.05），見表2，圖3。[Tab.2 Comparison of OD450 value， EdU positive cell rate and apoptosis rate of ovarian granulosa cells between the seven groups

2.4 淫羊藿苷對卵巢顆粒細胞凋亡的影響 與對照組比較，PCOS組卵巢顆粒細胞凋亡率升高（P＜0.05）。與PCOS組比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組卵巢顆粒細胞凋亡率依次降低；Rr-SDF-1組卵巢顆粒細胞凋亡率升高（P＜0.05）。與淫羊藿苷高劑量組比較，淫羊藿苷高劑量+Rr-SDF-1組卵巢顆粒細胞凋亡率升高（P＜0.05）。見圖4、表2。

2.5 淫羊藿苷對各組卵巢顆粒細胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白及SDF-1/CXCR4通路相關(guān)蛋白表達的影響 與對照組比較，PCOS組卵巢顆粒細胞中Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與PCOS組比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組卵巢顆粒細胞中Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表達水平均依次降低；Rr-SDF-1組卵巢顆粒細胞中Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與淫羊藿苷高劑量組比較，淫羊藿苷高劑量+Rr-SDF-1組卵巢顆粒細胞中Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見表3、圖5。

3 討論

PCOS通常表現(xiàn)為LH水平升高、FSH水平降低，高水平的LH會促進卵泡膜細胞合成大量T，而處于較低水平的FSH則會抑制卵巢顆粒細胞中芳香化酶活性，進而抑制T向雌激素轉(zhuǎn)化，此時形成的高雄激素環(huán)境會使卵泡排出受阻，最后形成卵巢多囊性改變［10］。本研究成功分離并鑒定出PCOS卵巢顆粒細胞，結(jié)果顯示，與對照組比較，PCOS組卵巢顆粒細胞上清液中FSH水平降低，T、LH水平升高，表明PCOS卵巢顆粒細胞激素代謝紊亂，符合PCOS卵巢顆粒細胞的特征。有研究顯示，PCOS癥狀可以通過增加顆粒細胞增殖和減少顆粒細胞凋亡來緩解［11-13］。因此，PCOS的發(fā)病與顆粒細胞增殖和凋亡的失調(diào)密切相關(guān)。因此，促進卵巢顆粒細胞增殖，抑制細胞凋亡可能是改善PCOS的有效策略之一。

淫羊藿苷是淫羊藿中的主要活性化合物，具有強大的抗炎特性，還可以改善卵巢功能［14-15］。有研究顯示淫羊藿苷可改善PCOS大鼠卵巢細胞凋亡［16］；能改善自身免疫原發(fā)性卵巢功能不全小鼠受損卵巢的結(jié)構(gòu)及其功能［17］；還可促進卵巢儲備功能減退患者卵巢顆粒細胞增殖［18］。以上研究表明淫羊藿苷對卵巢具有保護作用。本研究結(jié)果亦顯示，淫羊藿苷可上調(diào)PCOS大鼠卵巢顆粒細胞OD450值和EdU陽性細胞率，抑制細胞凋亡率及卵巢顆粒細胞中促凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved Caspase-3表達，且呈劑量依賴性，表明淫羊藿苷可促進卵巢顆粒細胞增殖，抑制細胞凋亡，且呈劑量依賴性。提示淫羊藿苷可能成為治療PCOS的潛在有效藥物。

SDF-1是一種CXC趨化因子，也是CXCR4的唯一配體，SDF-1和CXCR4結(jié)合形成信號通路可以調(diào)節(jié)多種生理活性，包括細胞增殖、凋亡等［19］。抑制SDF-1/CXCR4信號通路可促進骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖及抑制細胞凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示，與PCOS組比較，Rr-SDF-1組卵巢顆粒細胞中SDF-1、CXCR4蛋白表達水平升高，卵巢顆粒細胞增殖能力減弱，凋亡能力增強，且Rr-SDF-1為SDF-1激活劑，證實SDF-1/CXCR4信號通路參與PCOS大鼠卵巢顆粒細胞增殖及凋亡過程。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可呈劑量依賴性地抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細胞中SDF-1、CXCR4蛋白表達，故筆者推測淫羊藿苷可能通過抑制SDF-1/CXCR4信號通路抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細胞凋亡。為了驗證該猜想，本研究在高劑量淫羊藿苷作用的基礎(chǔ)上再加SDF-1激活劑Rr-SDF-1來干預PCOS大鼠卵巢顆粒細胞，結(jié)果顯示，Rr-SDF-1減弱了高劑量淫羊藿苷對顆粒細胞凋亡的抑制作用。進一步提示淫羊藿苷可能通過抑制SDF-1/CXCR4信號通路抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細胞凋亡。

綜上所述，淫羊藿苷可能通過抑制SDF-1/CXCR4信號通路抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細胞凋亡。但該作用機制較為復雜，具體通過SDF-1/CXCR4信號通路下游的哪些蛋白發(fā)揮作用有待進一步探討。

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（2023-11-06收稿 2023-12-20修回）

（本文編輯 陳麗潔）