摘要：［目的］YT521-B 同源（YTH）結(jié)構(gòu)域蛋白可識別結(jié)合N6-甲基腺苷（m6A）調(diào)控mRNA 的代謝過程，在植物生長發(fā)育與逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。探究棉花YTH 家族基因的組織表達(dá)模式、響應(yīng)非生物脅迫和外源激素的表達(dá)特征，可為深入研究棉花YTH 基因功能提供理論依據(jù)。［方法］采用生物信息學(xué)方法對陸地棉YTH 基因家族進(jìn)行全基因組分析，并利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）分析GhYTH 基因在逆境脅迫和外源激素處理下的表達(dá)特征。［結(jié)果］陸地棉中共鑒定獲得26 個(gè)GhYTH 基因，在16 條染色體上呈現(xiàn)不均一分布，其中22 個(gè)YTH-DF 和4 個(gè)YTH-DC 亞家族成員，GhYTHs 具有相似的基序和結(jié)構(gòu)。串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制是驅(qū)動(dòng)陸地棉YTH 基因家族擴(kuò)張的主要方式；陸地棉與擬南芥YTH 共線性基因間Ka/Kslt;0. 5，表明該基因家族在進(jìn)化過程中受到了較強(qiáng)的純化選擇。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示多數(shù)GhYTH 具有組織表達(dá)特異性，GhYTH2/16 在各組織中高表達(dá)；逆境脅迫可顯著增加GhYTH的表達(dá)，尤其是GhYTH9/12/14，qPCR 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致；外源赤霉素、脫落酸和茉莉酸甲酯處理時(shí)，GhYTH10/12/14 的表達(dá)顯著增加。［結(jié)論］本研究通過陸地棉全基因組分析，獲得了5 個(gè)重要的YTH 候選基因GhYTH2/9/10/12/14，它們在棉花生長發(fā)育和逆境抵抗中可能發(fā)揮著重要的作用，為進(jìn)一步解析YTH 介導(dǎo)的m6A修飾的作用提供了重要的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：陸地棉； YTH 基因； 激素； 脅迫； 表達(dá)

中圖分類號：S562 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-8151（2024）03-0001-13

遺傳信息經(jīng)轉(zhuǎn)錄從DNA 傳遞給mRNA，之后經(jīng)翻譯由mRNA 合成具有不同生物功能的蛋白質(zhì)，該過程涉及多水平、多層次的調(diào)控，生物體因而能夠在不同生長發(fā)育階段和外界環(huán)境變化時(shí)啟動(dòng)特定基因的表達(dá)。RNA 化學(xué)修飾是近年來倍受關(guān)注的一種新的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控方式，目前已發(fā)現(xiàn)170 余種化學(xué)修飾存在于mRNAs 和非編碼RNAs 中［1-2］。N6-甲基腺苷（m6A）是廣泛在于真核生物mRNA 中的一種重要的轉(zhuǎn)錄后修飾，最早發(fā)現(xiàn)于1974 年［3-4］。研究表明m6A 修飾調(diào)控mRNA 幾乎所有的代謝過程，包括穩(wěn)定性、拼接、核輸出和翻譯效率，因而參與許多重要的生物學(xué)過程［5］。m6A 是一種動(dòng)態(tài)的、可逆的修飾，由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（“writers”）負(fù)責(zé)將m6A 添至RNA 分子上［6-8］，而去甲基化酶（“erasers”）復(fù)合體可將RNA 分子上的m6A 可逆地清除［9］。m6A 的生物功能主要依賴不同的“reader”蛋白選擇性識別m6A來實(shí)現(xiàn)，這些“reader”包括YTH（YT521-B homol?ogy）結(jié)構(gòu)域蛋白、IGF2BP 和 HNRNP 家族［10-11］，其中YTH 結(jié)構(gòu)域蛋白是最早發(fā)現(xiàn)且目前研究較清楚的m6A“reader”。

動(dòng)物體中YTH 結(jié)構(gòu)域蛋白研究較為清楚，人的YTH 結(jié)構(gòu)域蛋白家族有5 個(gè)成員：YTHDF1-3和YTHDC1-2，均有高度保守的YTH 結(jié)構(gòu)域，但功能不完全相同［5］。植物中，YTH 結(jié)構(gòu)域蛋白是唯一報(bào)道的 m6A“ reader”，與動(dòng)物相比，其家族成員較多［12-15］。模式植物擬南芥中共有13 個(gè)YTH蛋白，其中YTH-DF 成員有11 個(gè)，命名為ECT（Evolutionarily Conserved C-Terminal Region）1-11，YTH-DC 有2 個(gè)成員（ECT12 和 AtCPSF30-L）［12］。擬南芥中ECT2、ECT3 和ECT4 均位于細(xì)胞質(zhì)，以功能冗余的方式調(diào)控葉片發(fā)育和莖的生長［12，16-17］；ECT1 和ECT2 通過與應(yīng)激反應(yīng)蛋白CIPK1 互作，調(diào)控鈣離子信號途徑［18］；AtCPSF30-L 通過識別mRNA 上的m6A 修飾調(diào)控mRNA 的poly（A）位點(diǎn)選擇，影響硝態(tài)氮信號相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控植物氮吸收和同化［19］。水稻中發(fā)現(xiàn)12 個(gè)YTH 蛋白，其中YTH03、YTH05 和YTH10 協(xié)同調(diào)控水稻的株高［13］ 。番茄中鑒定了9 個(gè)YTH 蛋白，敲除SlYTH2 增加了內(nèi)源脫落酸（abscisic acid， ABA）含量，降低了赤霉素（gibberellin， GA）含量，植株呈現(xiàn)矮化、果實(shí)成熟延緩、種子敗育率增加等表型［14］；敲除SlYTH1 抑制GA 的合成，植株根長變短、營養(yǎng)生長受抑制、果實(shí)細(xì)長且扁平［20］。蘋果中共有26 個(gè)YTP 蛋白，過表達(dá)MhYTP1 的蘋果植株在干旱條件下內(nèi)源ABA 水平升高，水分利用效率和凈光合速率增加，耐旱性增強(qiáng)［15］；MhYTP2 過表達(dá)增加了m6A 修飾水平和翻譯效率，促進(jìn)Md?MLO19 和MdMLO19-X1 mRNA 的降解，提高抗氧化相關(guān)基因的翻譯效率，增強(qiáng)了白粉病抵抗能力［21］。由此，植物YTH 結(jié)構(gòu)域蛋白在植物多個(gè)生長發(fā)育過程、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和多種脅迫響應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，但大多數(shù)植物中YTH 結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員尚未得以鑒定。

棉花（Gossypium hirsutum L. ）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，其基因組較大，遺傳背景復(fù)雜，與模式植物相比，棉花中m6A 修飾的功能研究相對滯后。Huang 等［22］發(fā)現(xiàn)棉花m6A 甲基化酶基因GhVIR 沉默植株葉片變小且形態(tài)異常，葉綠體和類囊體結(jié)構(gòu)損壞，光合效率降低。Cui 等［23］研究表明棉花去甲基化酶基因GhALKBH10 沉默提高了植株的耐鹽能力。Wang 等［24］發(fā)現(xiàn)棉花幼苗根部m6A 修飾響應(yīng)鹽脅迫處理發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。陸地棉中YTH 的功能尚不清楚，本研究對陸地棉YTH基因家族進(jìn)行全基因組鑒定，并分析其理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、保守基序、染色體分布、順式作用元件等，探究YTH 家族基因的組織表達(dá)模式、響應(yīng)逆境脅迫和外源激素的表達(dá)特征，為后續(xù)深入研究棉花YTH 基因的功能及揭示m6A 修飾在棉花生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 植物材料與處理

陸地棉（Gossypium hirsutum L.）品種‘ 中棉49’由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院安陽棉花研究所提供。種子經(jīng)10% 次氯酸鈉消毒處理后于28 ℃浸種12 h，將露白的種子種于盛有沙子的培養(yǎng)盒中，培養(yǎng)3 d后移至Hoagland 營養(yǎng)液中于人工氣候室中培養(yǎng)，溫度為28 ℃/22 ℃，光周期為14 h 光照/10 h 黑暗，光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1。培養(yǎng)至三葉期時(shí)進(jìn)行鹽和干旱脅迫處理：在Hoagland 營養(yǎng)液中分別添加250 mmol·L-1 NaCl 和10% PEG-6000，對照組用正常Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)。外源激素處理采用葉面噴施的方法，分別噴施100 μmol·L-1GA3、100 μmol·L-1 ABA 和100 μmol·L-1 茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）。處理后0、3、6、12、24 和48 h 收集棉花幼苗葉片，用蒸餾水快速清洗并用濾紙擦干后，液氮冷凍保存于?80 ℃，用于RNA 提取。每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1. 2 陸地棉YTH 基因家族成員鑒定

從棉花功能基因組數(shù)據(jù)庫CottonFGD（https：//cottonfgd. net/）中下載陸地棉的基因組數(shù)據(jù)（HAU）。在Pfam 數(shù)據(jù)庫（http：//pfam. xfam.org）中獲取YTH 基因家族的隱馬爾科夫模型（hidden Markov models，HMM）文件PF04146。使用HMMER3. 0 軟件對陸地棉參考基因組的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行初步篩選，過濾去除E-value 小于0. 05的序列。將篩選出的蛋白序列上傳至SMART（http：//smart. emblheidelberg. de/）和NCBI CDSearch數(shù)據(jù)庫進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的鑒定，最終篩選獲得26 個(gè)陸地棉YTH 基因。利用在線網(wǎng)站Ex?PASy（https：//web. expasy. org/compute_pi/）獲得GhYTH 蛋白的理論等電點(diǎn)和分子質(zhì)量等信息。利用WoLF-PSORT（https：//wolfpsort. hgc. jp/）預(yù)測GhYTH 蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

1. 3 YTH 基因家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NCBI 網(wǎng)站的CDD（The Conserved Do?main Database）數(shù)據(jù)庫，獲取YTH 蛋白結(jié)構(gòu)域信息，并使用TBtools（https：// github. com / CJChen/ TBtools）軟件進(jìn)行基因保守結(jié)構(gòu)域示意圖繪制。利用陸地棉YTH 蛋白的氨基酸序列，將文件導(dǎo)入MEGA-X 軟件，先使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行多序列比對，再使用鄰接法（neighbor joining， NJ）對YTH 蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)抽樣檢驗(yàn)參數(shù)Bootstrap 值設(shè)置為1000，其他參數(shù)使用默認(rèn)值。使用在線工具ChiPlot（https：//www. chiplot. on?line）對進(jìn)化樹進(jìn)行美化。

1. 4 YTH 基因家族染色體定位與共線性分析

提取陸地棉基因組gff 注釋文件中基因的位置信息，使用TBtools 繪制染色體定位圖。使用TB?tools 軟件工具中的one step MCScanX 進(jìn)行陸地棉基因組自身比對，將得到的blast 結(jié)果進(jìn)行簡化，利用注釋文件簡化并再次提取基因信息，得到共線性文件后用TBtools 軟件中的Advanced Circos 進(jìn)行繪圖，并利用TBtools 軟件計(jì)算各個(gè)基因?qū)Φ腒a/Ks 的值。

1. 5 YTH基因家族基因結(jié)構(gòu)與蛋白保守基序分析

利用MEME 在線網(wǎng)站（http：//meme-suite.org/memei）分析GhYTH 蛋白的保守基序，基序最大發(fā)現(xiàn)數(shù)設(shè)為10，利用TBtools 中的“VisualizeMEME/MAST Motif Pattern”工具對xml 文件進(jìn)行可視化分析。在TBtools“Gene Structure View”頁面，上傳陸地棉基因組注釋文件與YTH 家族的基因ID 分析編碼區(qū)/非編碼區(qū)（CDS/UTR）。

1. 6 YTH基因家族啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析

從棉花功能基因組數(shù)據(jù)庫CottonFGD（https：// cottonfgd. net）中下載陸地棉基因組Gff文件，然后使用TBtools Gff 序列提取工具提取GhYTH 基因起始密碼子上游2000 bp 的序列作為啟動(dòng)子區(qū)域。利用在線工具PlantCARE（http：//bioinformatics. psb. ugent. be/ webtools/plantcare/html）對GhYTH 基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測分析，并用TBtools 軟件將預(yù)測的結(jié)果可視化。

1. 7 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析YTH 基因家族成員的表達(dá)模式

從NCBI 網(wǎng)站SAR 數(shù)據(jù)庫下載陸地棉不同組織（根、莖、葉、花托、花瓣、雄蕊、雌蕊、花萼）及非生物脅迫（低溫、高溫、鹽、干旱）處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（登錄號：PRJNA248163）?；贔PKM（frag?ments per kilobase of transcript per million mappedreads，每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段）對表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行 log2（ FPKM+1）標(biāo)準(zhǔn)化處理，利用TBtools 繪制基因表達(dá)熱圖。

1. 8 qRT-PCR 分析鹽、干旱和外源激素處理時(shí)YTH 基因家族成員的表達(dá)模式

采用Universal Plant RNA Kit 試劑盒（金百特，北京）提取棉花葉片的總RNA，使用Reverse Tran?scriptase M-MLV（TaKaRa，大連）合成第一鏈cDNA。采用Primer Premier 5. 0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1），使用羅氏LightCycler? 96 熒光定量PCR 儀，用2×SYBR Green qPCR Mix（艾德萊，北京）進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系（25 μL）：cDNA 2. 0 μL，正向引物和反向引物各0. 5 μL，SYBR Mix 12. 5 μL，ddH2O 9. 5 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。以GhUBQ7 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1. 9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17. 0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，ANOVA 法進(jìn)行差異顯著性分析（Plt;0. 05），Dun?can’s 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 陸地棉YTH 基因家族的全基因組鑒定

利用擬南芥和水稻的YTH 結(jié)構(gòu)域蛋白序列通過BLASTP 分析陸地棉的蛋白數(shù)據(jù)庫，去除冗余序列和無完整讀碼框序列，共鑒定獲得26 個(gè)YTH 基因，根據(jù)與擬南芥ECT 基因的同源性命名為GhYTH1～GhYTH26（表2）。GhYTH 家族基因的CDS 長度為1062～2097 bp，編碼的蛋白含有338（GhYTH6）～670（GhYTH16）個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為38. 35～73. 96 kD。理論等電點(diǎn)為5. 14～8. 55，平均等電點(diǎn)為6. 43。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，GhYTH21 定位于細(xì)胞質(zhì)，GhYTH1、GhYTH12 和GhYTH26 定位于葉綠體，其余22 個(gè)GhYTH 定位于細(xì)胞核。

2. 2 陸地棉YTH 基因家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域與進(jìn)化分析

陸地棉YTH 基因家族蛋白成員均有保守的YTH 結(jié)構(gòu)域，且多數(shù)位于C- 末端（圖1A）。除YTH 結(jié)構(gòu)域外，GhYTH21 的N- 末端還有1 個(gè)YTH1 超家族結(jié)構(gòu)域，GhYTH2 與GhYTH16 均有1 個(gè)dnaA 超家族結(jié)構(gòu)域，GhYTH5 與GhYTH15均有1 個(gè)PHA03377 超家族結(jié)構(gòu)域。

將陸地棉26 個(gè)YTH 基因家族蛋白與模式植物擬南芥、水稻的ECT 家族蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，YTH 基因家族蛋白共有5 個(gè)分支，而這些分支中均有陸地棉YTH 成員（圖1B）。擬南芥ECT 蛋白中的AtCPSF30、AtECT12 屬于YTH-DC 亞家族，陸地棉GhYTH21 和GhYTH26 與AtCPSF30親緣關(guān)系較近，GhYTH6 和GhYTH17 則與AtECT12 親緣關(guān)系較近，表明這4 個(gè)陸地棉YTH蛋白屬于YTH-DC 亞家族，其余22 個(gè)陸地棉YTH 蛋白屬于YTH-DF 亞家族。

2. 3 陸地棉YTH 基因家族成員染色體分布與共線性分析

基因染色體定位圖顯示，除A04、A06、A07、A09、A10 和D03、D04、D06、D07、D09 染色體，其余染色體上均有GhYTH 基因（圖2）。A 亞基因組中分布有12 個(gè)GhYTH 基因，D 亞基因組中分布有13 個(gè)GhYTH 基因，而GhYTH18 染色體位置未知。A08 和D08 染色體上分別有3 個(gè)GhYTH 基因，是GhYTH 基因分布最多的染色體，A01、A11、D01、D02、D11 染色體上均分布2 個(gè)GhYTH 基因，其余的染色體上均只分布1 個(gè)GhYTH 基因。GhYTH 主要分布在染色體兩端，在A 和D 亞基因組上呈現(xiàn)不完全均勻分布，并且在A、D 亞基因組間無明顯偏好性。

基因復(fù)制對于新基因和新功能的產(chǎn)生十分重要，片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)是基因家族擴(kuò)大的重要驅(qū)動(dòng)力［25］。為進(jìn)一步探索陸地棉YTH 基因家族的進(jìn)化過程，對該家族不同成員間的共線性關(guān)系進(jìn)行了分析，共發(fā)現(xiàn)22 對GhYTH 基因存在共線性關(guān)系（圖3A），A 亞組和D 亞組之間有8 對同源基因呈絕對共線性，此外，A 亞組和D 亞組內(nèi)分別有3 對GhYTH 基因也存在共線性關(guān)系，有2 對串聯(lián)重復(fù)基因（GhYTH8/9、GhYTH19/20），同時(shí)GhYTH 基因家族存在單個(gè)基因?qū)?yīng)多個(gè)基因的情況，表明GhYTH 基因家族的進(jìn)化涉及染色體片段復(fù)制事件。為了解GhYTH 基因家族的進(jìn)化關(guān)系，將陸地棉與擬南芥進(jìn)行了共線性關(guān)系比較，發(fā)現(xiàn)陸地棉中10 個(gè)YTH 基因與擬南芥的5 個(gè)YTH基因存在共線性關(guān)系（圖3B），進(jìn)一步對陸地棉與擬南芥的共線性基因?qū)Φ腒a/Ks 進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)Ka/Ks 值在0. 157 5～0. 269 6 之間，平均值0. 207 7，表明陸地棉YTH 基因家族在進(jìn)化過程中可能受到了較強(qiáng)的純化壓力。

2. 4 陸地棉YTH 蛋白保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

陸地棉YTH 蛋白序列中共發(fā)現(xiàn)10 個(gè)保守的motif，所有的陸地棉YTH 蛋白序列中均有motif 2與motif 3（圖4），表明這2 個(gè)基序是陸地棉YTH基因家族進(jìn)化的主要組成部分。9 個(gè)YTH 蛋白GhYTH2、GhYTH7～10、GhYTH16、GhYTH19、GhYTH20、GhYTH22 含有全部的motif，而GhYTH6、GhYTH17、GhYTH21、GhYTH26 僅有2 個(gè)motif，其余13 個(gè)YTH 蛋白均有6～7 個(gè)motif。

基因的外顯子-內(nèi)含子分布模式與其特異的生物學(xué)功能有關(guān)，陸地棉26 個(gè)YTH 基因均含有內(nèi)含子，外顯子數(shù)目有6～10 個(gè)，內(nèi)含子的數(shù)目有5～9 個(gè)，各基因內(nèi)含子和外顯子數(shù)目差別不大（圖4）。GhYTH14 中的外顯子（10 個(gè)）和內(nèi)含子（9 個(gè)）數(shù)目均最多。陸地棉YTH 基因家族成員中外顯子/內(nèi)含子分布類型較相似。

2. 5 陸地棉YTH 基因家族順式作用元件分析

基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析有助于了解家族基因的不同功能。通過對陸地棉YTH 基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000 bp 的基因組序列進(jìn)行啟動(dòng)子分析，發(fā)現(xiàn)其具有多種順式作用元件（圖5），根據(jù)調(diào)控功能將其分為3 類：第1 類是與生長發(fā)育相關(guān)的元件，包括晝夜節(jié)律調(diào)控元件、種子特異性調(diào)控元件、與分生組織表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件、胚乳表達(dá)調(diào)控元件、類黃酮生物合成基因調(diào)控元件等；第2 類是激素響應(yīng)元件，包括脫落酸響應(yīng)元件、赤霉素應(yīng)答元件、生長素調(diào)控元件、水楊酸響應(yīng)元件和茉莉酸應(yīng)答元件等；第3 類是生物/非生物脅迫響應(yīng)元件，包括防御和應(yīng)激反應(yīng)元件、低溫反應(yīng)元件、響應(yīng)干旱的MYB 結(jié)合位點(diǎn)元件、創(chuàng)傷反應(yīng)元件等。上述應(yīng)答元件的富集表明YTH 基因可能在棉花的生長發(fā)育、激素響應(yīng)和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要功能。

2. 6 陸地棉YTH 基因家族成員組織表達(dá)模式分析

通過分析陸地棉8 個(gè)不同組織的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)GhYTH 的表達(dá)呈現(xiàn)一定的組織特異性（圖6）。GhYTH2/16 在不同組織中的表達(dá)水平均較高，花瓣中表達(dá)最高，其次是莖；GhYTH6/17/21/26 在各組織中的表達(dá)均較低。與其它組織相比，GhYTH14/23 在地上部營養(yǎng)器官莖和葉片中表達(dá)水平較高，GhYTH8/19 在莖和花瓣中表達(dá)水平相對較高，GhYTH7/25 在雌蕊和莖中表達(dá)水平較高，GhYTH1/12 主要在雄蕊中表達(dá)。這些結(jié)果表明不同的GhYTH 基因在棉花生長發(fā)育的不同階段和不同組織中發(fā)揮不同的功能。

2. 7 陸地棉YTH 基因家族成員響應(yīng)非生物脅迫和外源激素的表達(dá)特征

陸地棉YTH 基因響應(yīng)低溫、高溫、干旱和鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，低溫處理時(shí)，GhYTH2/9/12/16/20 的表達(dá)上調(diào)，且處理12 h 時(shí)上調(diào)最明顯；隨著高溫處理時(shí)間的增加，GhYTH1/9/12/14/22/23 表達(dá)上調(diào)幅度增加，其中GhYTH12 上調(diào)最明顯；干旱和鹽脅迫處理時(shí)，GhYTH1/2/10/12/14/22/23 的表達(dá)均明顯上調(diào)，其中GhYTH12上調(diào)最明顯（圖7A）。這些結(jié)果表明YTH 家族基因在不同的非生物脅迫中發(fā)揮不同的功能。

基于以上轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，采用qPCR 對逆境反應(yīng)較敏感的GhYTH2/9/10/12/14 基因在干旱和鹽脅迫條件下的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)GhYTH2/9/12/14 在PEG 和鹽處理時(shí)表達(dá)均顯著增加，尤以GhYTH12 的表達(dá)增加最顯著，在鹽處理6 h 和PEG 處理24 h 時(shí)增至峰值，分別為0 h的33 倍和55 倍；GhYTH10 僅在鹽處理3 h 和PEG 處理12 h 時(shí)表達(dá)水平增加，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致（圖7B～7C）。此外，所檢測的5 個(gè)GhYTH 基因?qū)ν庠碐A3、ABA 和MeJA 處理也較敏感（圖7D-7F），其中，GhYTH10 對3 種外源激素最敏感，表達(dá)水平均顯著增加且在處理6 h 時(shí)達(dá)到峰值；GhYTH12 在GA3 和ABA 處理時(shí)表達(dá)水平先增加后降低，處理3 h 時(shí)增加最明顯，MeJA 處理時(shí)僅6 h 和24 h 顯著高于對照；3 種激素處理時(shí)GhYTH14 的表達(dá)均先增加后降低，分別在ABA和GA3 處理12 h、MeJA 處理6 h 增至峰值。這些結(jié)果進(jìn)一步表明陸地棉YTH 基因家族的不同成員在激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和脅迫響應(yīng)方面發(fā)揮不同的作用。

3 討論

YTH 結(jié)構(gòu)域蛋白是最早被發(fā)現(xiàn)的一類m6A“reader”蛋白，廣泛存在于真核生物中且高度保守，有YTH-DF 和YTH-DC 2 個(gè)亞家族，通過識別結(jié)合m6A 調(diào)控mRNA 的多個(gè)代謝過程，對生命活動(dòng)產(chǎn)生重要的影響［26］。目前YTH 基因家族成員僅在少數(shù)植物中被鑒定，且以YTH-DF 成員居多，YTH-DC 亞家族成員相對較少，如擬南芥有13 個(gè)YTH 成員，YTH-DC 成員2 個(gè)［12］；水稻中YTH 成員12 個(gè)，YTH-DC 成員1 個(gè)［13］；番茄中9個(gè)YTH 成員，5 個(gè)YTH-DC 成員［27］；小麥中39 個(gè)YTH 成員，3 個(gè)YTH-DC 成員［28］。本研究從陸地棉中共鑒定獲得26 個(gè)YTH 基因家族成員，YTHDC亞家族成員有4 個(gè)，其中GhYTH21 與擬南芥AtCPSF30、水稻OsCPSF30 高度同源，它們除具有YTH 保守結(jié)構(gòu)域外，均有YTH1 超家族結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可結(jié)合RNA 并參與RNA 前體的拼接［12］。亞細(xì)胞定位預(yù)測GhYTH21 主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，與報(bào)道的AtCPSF30 亞細(xì)胞定位一致［29］，表明GhYTH21 與AtCPSF30 可能具有相似的功能。此外，GhYTH6、GhYTH17 與擬南芥另一個(gè)YTH-DC 成員AtECT12 高度同源。

陸地棉中26 個(gè)YTH 基因在大多數(shù)染色體上有分布，且主要位于染色體的兩端，該特征與此前水稻、小麥和草莓中的報(bào)道一致［13，28，30］。YTH 基因在陸地棉A 和D 亞基因組上呈現(xiàn)不完全均勻分布，如A02 僅有1 個(gè)YTH 基因，D02 有2 個(gè)YTH基因，A03 和D10 上分別有1 個(gè)YTH 基因，但D03和A10 上無YTH 基因，而小麥39 個(gè)YTH 基因在A、B 和D 亞基因組的染色體上呈現(xiàn)完全均勻分布［28］，表明YTH 家族基因在染色體定位方面具有一定的物種特征。串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)在植物基因擴(kuò)張和功能分化中發(fā)揮重要的作用［25］。研究發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)事件是擬南芥YTH 基因進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力，而水稻YTH 基因家族的基因復(fù)制主要由片段重復(fù)事件主導(dǎo)［29］。本研究發(fā)現(xiàn)陸地棉YTH 基因家族中存在串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)事件，表明這兩種復(fù)制方式在陸地棉YTH 基因家族進(jìn)化中發(fā)揮了重要作用。

隨著少數(shù)植物YTH 基因家族成員的鑒定及功能分析，發(fā)現(xiàn)YTH 蛋白參與調(diào)控植物多個(gè)生長發(fā)育過程［29， 31-32］。Scutenaire 等［31］發(fā)現(xiàn)擬南芥ECT2 在整個(gè)生長發(fā)育過程高水平表達(dá)，調(diào)控毛狀體的形成。ECT2/ECT3/ECT4 在擬南芥器官發(fā)生過程中控制著細(xì)胞的增殖，ect2/3/4 突變降低了葉片和維管束原基中細(xì)胞分裂速率，延緩了葉、根和莖的生長及花的形成［32］。水稻中與擬南芥ECT2 和ECT4 高度同源的OsYTH03（LOC_Os03g06240） 、OsYTH05 （LOC_Os03g53670） 和OsYTH10（LOC_Os07g07490）同樣在各組織中高度表達(dá)，同時(shí)敲除這3 個(gè)蛋白的編碼基因顯著降低植株的高度［13］。本研究對陸地棉、擬南芥和水稻的YTH 基因家族成員構(gòu)建了進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)陸地棉GhYTH2 與擬南芥ECT2、ECT4 及水稻的Os?ECT4（OsYTH05，LOC_Os03g53670）和OsECT6（OsYTH03，LOC_Os03g06240）同源性均較高，且組織表達(dá)模式顯示GhYTH2 在棉花的不同組織中表達(dá)水平均較高，表明GhYTH2 在棉花生長發(fā)育尤其在營養(yǎng)生長階段可能有重要的調(diào)控作用。

植物激素在植物生長發(fā)育和抵抗逆境方面發(fā)揮著非常重要的作用。近期研究發(fā)現(xiàn)YTH 蛋白可通過與植物激素的互作調(diào)控器官發(fā)育，如水稻yth03/05/10 三突變體的矮化表型與油菜素內(nèi)酯合成受阻有關(guān)［13］；敲除番茄SlYTH2 增加了內(nèi)源ABA 含量，降低了內(nèi)源GA3 含量，植株表現(xiàn)為矮化、果實(shí)成熟期延遲和種子敗育率增加［14］。本研究在YTH 基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)許多激素響應(yīng)元件，包括ABA、GA、NAA、SA 和MeJA等應(yīng)答元件，用qPCR 分析陸地棉YTH 基因家族成員對外源激素的響應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)YTH 基因?qū)A3、ABA 和MeJA 均有響應(yīng)，但GhYTH10/12/14 更為敏感，且以上調(diào)為主，而這3 個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)GA、ABA 和MeJA 反應(yīng)元件。GA 是一種重要的植物生長促進(jìn)激素，可通過其信號途徑調(diào)控下游基因表達(dá)影響植物多個(gè)生長發(fā)育過程，如節(jié)間伸長、種子萌發(fā)等［33］；ABA 作為一類重要的植物激素和信號分子，除調(diào)控植物的生長發(fā)育，還參與植物對干旱、鹽脅迫、溫度等多種脅迫應(yīng)對［34］；MeJA 參與植物的多種生理生化過程，在植物應(yīng)對生物和非生物脅迫方面均發(fā)揮著重要的作用［35］。陸地棉YTH 基因家族成員對這3 種激素的響應(yīng)表明它們不僅調(diào)控棉花的生長發(fā)育，也通過激素介導(dǎo)的信號途徑參與棉花對逆境脅迫的適應(yīng)。

陸地棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示YTH 基因家族成員GhYTH2/9/10/12/14/22/23 在低溫、高溫、PEG和鹽脅迫處理時(shí)表達(dá)水平均變化明顯，qPCR 驗(yàn)證了其中5 個(gè)YTH 基因?qū)EG 和鹽脅迫的響應(yīng)，GhYTH12 在PEG 和鹽脅迫處理時(shí)表達(dá)上調(diào)最明顯，而GhYTH9 和GhYTH14 在PEG 處理時(shí)、GhYTH2 和GhYTH14 在鹽脅迫處理時(shí)表達(dá)均顯著上調(diào)，相應(yīng)地在這些對逆境脅迫較敏感的GhYTH 基因啟動(dòng)子區(qū)域檢測到了低溫反應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)的MYB 結(jié)合位點(diǎn)、厭氧脅迫元件、防御和脅迫響應(yīng)元件等，表明這些YTH 基因家族成員可能在棉花應(yīng)對干旱和鹽脅迫時(shí)起重要作用。Guo 等［15， 21］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MhYTP1 可顯著提高蘋果的耐旱能力，過表達(dá)MhYTP2 可提高蘋果對白粉病的抵抗力。YTH 蛋白對生命體活動(dòng)的影響基于對mRNA 代謝調(diào)控，動(dòng)物中的研究表明亞細(xì)胞定位不同的YTH 蛋白調(diào)控mRNA 不同的代謝過程，細(xì)胞核中主要參與mRNA 加工、輸出和表觀調(diào)控，而細(xì)胞質(zhì)中主要控制翻譯和mRNA 穩(wěn)定性［36］。植物中YTH 功能研究非常有限，而YTH 功能與亞細(xì)胞定位之間的關(guān)系還有待研究。本研究中GhYTH10 和GhYTH14 亞細(xì)胞定位預(yù)測為細(xì)胞核，而GhYTH12 定位在葉綠體，其如何參與棉花生長發(fā)育和逆境響應(yīng)的調(diào)控仍需進(jìn)一步開展功能研究。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究從陸地棉中鑒定獲得26 個(gè)YTH 基因家族成員，它們均有YTH 保守結(jié)構(gòu)域，其中YTH-DF 亞家族成員22 個(gè)，YTH-DC 亞家族成員4 個(gè)，A 亞基因組和D 亞基因組上分別有12個(gè)和13 個(gè)YTH 基因。陸地棉YTH 基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域存在許多激素和脅迫響應(yīng)元件，表達(dá)模式顯示大多數(shù)YTH 基因具有組織表達(dá)特異性，YTH 基因?qū)ν庠醇に睾兔{迫處理較為敏感，其中GhYTH10/12/14 最為敏感，表明它們在棉花生長發(fā)育和應(yīng)對逆境脅迫中可能發(fā)揮重要的作用。該研究結(jié)果可為揭示m6A 修飾及其閱讀蛋白YTH 在棉花生長發(fā)育和脅迫應(yīng)對中的功能奠定良好的基礎(chǔ)，為棉花的生長發(fā)育和逆境研究提供了重要的候選基因。

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（編輯：呂俊俐）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31601241）；棉花生物育種與綜合利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金（CB2023A07）