［摘要］阿爾茨海默?。ˋD）是較為常見的慢性神經退行性改變。果蠅遺傳背景清晰、實驗操作簡便、與人類疾病有關的基因或是與其高度相似的同源基因都可以在果蠅體內找到。利用果蠅經典的半乳糖調節(jié)上游啟動子元件4 -上游激活序列（GAL4-UAS）系統(tǒng)已建立了多種AD果蠅模型，開展了AD的分子機制及藥物篩選研究。本文針對不同類型的AD果蠅模型的制備原理、方法及應用作一綜述，為利用果蠅進行AD研究提供思路。

［關鍵詞］阿爾茨海默??；黑腹果蠅；GAL4-UAS系統(tǒng)

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2024.02.018

Utilizing Drosophila Melanogaster in Alzheimer's Disease Research：Applications and Insights

Ma Huiying1，Zhang Xiaoyun1，Zhang Liyuan1，Li Fangyu1，Li Xinran1，Zhu Mingxue2，Yang Limin1，2**

1Department of Human Anatomy and Histology and Embryology，School of Medicine，Dalian University，Dalian116622;2Chronic DiseaseResearch Center of Dalian，Dalian116622

**Corresponding author：Yang Limin，email：yanglimin@dlu.edu.cn

［Abstract］Alzheimer′s disease（AD） is a widely recognized chronic neurodegenerative condition.Drosophila，with its well-defined genetic structure，straightforward experimental methodologies，and the presence of human disease-related genes or highly similar homologous genes，serves as an advantageous model organism.The utilization of "Drosophila′s renowned Galactose-regulated Upstream Promoter Element 4-Upstream Activating Sequence（GAL4-UAS） system has led to the development of various AD models.These models facilitate the exploration of AD′s molecular mechanisms and the advancement of drug discovery efforts.This paper reviews the foundational principles，methodologies，and diverse applications of different AD Drosophila models，offering insights and innovative approaches for AD research utilizing Drosophila.

［Key words］Alzheimer′s disease;Drosophila melanogaster;GAL4-UAS system

阿爾茨海默?。ˋlzheimer 's disease，AD）是老年人群表觀神經元功能障礙中最常見的一種，臨床表現(xiàn)為神經紊亂、認知功能持續(xù)性進行性衰退、運動功能喪失等。在AD患者的大腦中，可以觀察到細胞內神經原的纖維纏結（Neurofibrillary tangles，NFTs）和細胞外淀粉樣斑塊（Senile plaques，SPs）沉積以及腦萎縮，這些病理改變導致進行性神經元死亡、腦內突觸丟失、記憶障礙和認知障礙［1］。當前，對于AD發(fā)病機理存在數(shù)種假說，主要包括炎癥、氧化應激、β淀粉樣蛋白（Amyloid beta，Aβ）在大腦神經元外異常沉積、神經元內Tau蛋白的NFTs、膽堿能神經元損傷等，但其確切的病理機制尚不明確［2］。果蠅壽命僅60 d左右，繁殖周期僅10～12 d，而AD具有緩慢進行性加重的特征，因此，該模型有助于短時間內觀察到完整病程。除此之外，果蠅繁殖力極強，雌性果蠅一次可產卵約400枚，這使得實驗規(guī)模和數(shù)據(jù)獲取速度得以大幅提升。最重要的是，果蠅遺傳物質結構簡單，基因組現(xiàn)已被完全解析，人類AD基因可以在果蠅體內找到相應同源基因。本文對現(xiàn)有的數(shù)種AD果蠅模型及其特點、應用等作一綜述，以期為AD相關研究提供新的方向和選擇。

1黑腹果蠅的簡介

黑腹果蠅（Drosophila melanogaster），以下簡稱果蠅，是昆蟲綱、雙翅目、果蠅科、果蠅屬昆蟲。由于其遺傳背景清晰、繁殖力極強、生命周期較短以及實驗室培養(yǎng)維持成本較低等優(yōu)勢，廣泛應用于遺傳學、生物化學等領域。此外在發(fā)育生物學以及分子生物學領域，果蠅的作用也不容小覷。在人類孟德爾遺傳在線（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫內，929個人類疾病相關基因條目中有714個（77%）在果蠅中具有高度相似的同源基因，與神經系統(tǒng)和神經退行性疾病相關的果蠅基因與潛在人類疾病基因集的分析顯示，兩者相關基因共74個，重合度達10.36%［3］。此外，果蠅還是人類基因組計劃一部分測序工作的主要模式生物之一［4］。

果蠅的半乳糖調節(jié)上游啟動子元件4 -上游激活序列（Galactose-regulated upstream promoter element4- upstream activating sequence，GAL4-UAS）系統(tǒng)是一種雙元表達系統(tǒng)，常被用于果蠅遺傳學相關研究。UAS是基因啟動子的上游激活序列，是酵母中一種類似高等真核生物增強子的序列，可通過增加轉錄活性來增強目的基因的表達。GAL4是一個酵母轉錄激活因子， 其DNA結構結合域（DNA-binding domain，BD）可以識別UAS并與之結合，從而激活UAS下游的目標基因，誘導目標基因的轉錄。在GAL4未與UAS結合的情況下，UAS下游的靶基因處于沉默狀態(tài)［5］。由于 GAL4可強效激活擁有 GAL4 結合位點的基因轉錄，因此，將組織特異性的啟動子或增強子與GAL4基因相連所建立的轉基因系，與UAS-目標基因系進行雜交，可產生在特定組織中表達目標基因的子代［6］。例如，肌動蛋白5C-半乳糖調節(jié)上游啟動子元件4（Actin 5C- galactose regulates upstream promoter elements 4，act5C-GAL4）果蠅品系與UAS-目標基因系進行雜交可使目標基因表達在所有細胞內，而胚胎致死性異常視覺系統(tǒng)-半乳糖調節(jié)上游啟動子元件4（Embryonic lethal abnormal visual system- Galactose regulates upstream promoter elements 4，elav-GAL4）則可使目標基因僅在果蠅神經細胞內特異性表達。目前，果蠅的 GAL4-UAS 系統(tǒng)已廣泛應用于生命科學研究領域，也是利用果蠅研究AD的重要工具之一。

2AD果蠅模型

目前存在多種關于AD的發(fā)病機制的假說，其中Aβ級聯(lián)假說和Tau蛋白異常磷酸化假說得到了科學家的廣泛認可。根據(jù)Aβ級聯(lián)假說，大腦中Aβ的積累是AD的主要原因。淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP）被β分泌酶，也稱為β位點APP裂解酶（Beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme，BACE），和γ分泌酶連續(xù)水解產生Aβ，Aβ逐漸聚合形成SPs，被認為是AD的關鍵致病因素。Tau 蛋白是一種微管相關蛋白，在AD患者腦中，Tau蛋白過度磷酸化，由可溶性轉變?yōu)椴豢扇苄缘模瑫r高度聚集，無法執(zhí)行其原來所具有的生物學功能，反而會產生毒性，并導致NFTs的形成［7］?；谶@兩種主流學說，研究人員構建了多種不同的AD果蠅模型。

2.1基于 APP/BACE的果蠅模型

APP/BACE模型是通過在發(fā)育過程中果蠅的中樞神經系統(tǒng)內過表達人類 APP 和 BACE 基因，造成神經系統(tǒng)內Aβ生成增多，形成Aβ沉積。利用elav-GAL4在神經系統(tǒng)內過表達這兩種基因產物，即親本elav-GAL4;與UAS-APP，UAS-BACE雜交，得到子一代，即目標轉基因果蠅elav-GAL4;UAS-APP;UAS-BACE，該品系果蠅在生物化學、神經病理、神經解剖和行為等方面會發(fā)生明顯改變。包括大腦內出現(xiàn)Aβ樣斑塊、與學習記憶相關腦區(qū)的神經元樹突和軸突的減少等。

該模型的優(yōu)勢在于模擬了人體內從APP剪切到Aβ的累積等一系列AD相關病理過程，由于人類APP和人類BACE基因在果蠅中樞神經系統(tǒng)中的表達以及被γ分泌酶的切割等過程的發(fā)生，會導致果蠅生物化學、神經解剖學、神經病理學和行為學等方面一系列的改變，且這些神經病變和記憶缺陷在數(shù)日內就會發(fā)生，而發(fā)育生物學可以幫助確定藥物在體內的作用機制，因此，與其他果蠅模型相比，該模型與臨床AD關聯(lián)更為緊密，而且更適用于快速檢測小分子藥物對AD干預的有效性［8］。如通過巴浦洛夫嗅覺記憶實驗、壽命實驗等檢測藥物的抗AD效果［9］。但需要注意的是，該模型的果蠅大腦內不會出現(xiàn)顯著的NFTs。其次，利用果蠅經典的 GAL4-UAS 系統(tǒng)，通過連續(xù)雜交和分子表型的篩選建立的，在果蠅全部神經元中表達兩個拷貝APP /BACE的轉基因果蠅，神經退行性病變表型相較于其他模型更為明顯［10］。由此可見，在神經系統(tǒng)中過表達APP/BACE是快速構建 AD果蠅模型的有效工具。

近年來，許多研究人員利用該模型，以γ分泌酶抑制劑為突破口進行了深入研究。例如，實驗證明γ分泌酶抑制劑N-［N-（3，5-二氟苯乙?；? l -丙氨酰］-（S）-苯基甘氨酸叔丁基酯（N-］N-（3，5-difluorophenacetyl）-L-alanyl］-（S）-phenylglycine t-butyl ester ，DAPT）可以降低體內的Aβ水平，有望作為AD的潛在治療藥物［11］。遺傳學相關實驗方法的發(fā)展將會提供蛋白質表達、分布和特性的精確結果，基于 APP/BACE的果蠅模型的遺傳學價值，涉及AD和γ分泌酶抑制劑等藥物之間相互作用的研究將會更加深入、快速和精準。

2.2基于Aβ的果蠅模型

相較于其他模型，Aβ模型是最直接、最便利的研究Aβ42毒性及影響的模型。研究人員將Aβ40或Aβ42基因與果蠅內源性壞死基因序列的信號肽基因融合，通過GAL4-UAS系統(tǒng)，培育了可以在不同時空上表達的Aβ40和Aβ42轉基因果蠅。如將elav-GAL4;與UAS- Aβ42;UAS-Aβ42雜交，得到所有神經元都表達Aβ42的子一代果蠅elav-GAL4;UAS - Aβ42;UAS-Aβ42［12］。成年后的Aβ42轉基因果蠅較正常果蠅相比，具有運動能力下降、壽命縮短等AD病理表型，且表達兩個拷貝Aβ42的果蠅神經退行性變表型相較只表達一個拷貝的果蠅要更為嚴重。

該模型可通過酶聯(lián)免疫吸附實驗、蛋白質印跡實驗、免疫熒光等手段檢測Aβ的含量，從而為藥物作用效果、細胞信號轉導通路探索、疾病進程判斷提供支持，也可以利用果蠅的負趨地性進行爬管實驗，通過逆重力攀爬指數(shù)對運動能力進行評定。由于表達的Aβ40或Aβ42與APP突變產生的肽相對應，因此很好地避免了APP加工過程可能產生的其他大小不同的Aβ對實驗產生的影響［13］。使得此果蠅模型具有直接評估Aβ毒性的主要優(yōu)勢。

有研究人員證實氧化還原傳感器在Aβ果蠅模型中的適用性，首次以定量方式區(qū)分神經毒性蛋白質聚集體對細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的影響，為后續(xù)以Aβ果蠅為模型研究抗氧化劑對Aβ毒性的影響提供了依據(jù)［14］。研究人員通過將在感光神經元中表達Aβ42的果蠅暴露于反應活性氧（Reactive oxygen species，ROS）中，證明了ROS誘導的脂質過氧化可能會加劇Aβ42誘導的表型，以及ROS和Aβ42的存在可以協(xié)同誘導果蠅的神經退行性變的假設。并且利用血腦屏障透過性抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸酰胺（N-acetylcysteine amide，NACA），可以強烈抑制過氧化脂質的形成和果蠅神經膠質細胞中脂滴的積累，從而控制AD的發(fā)展［15］。

2.3基于Tau蛋白異常磷酸化的AD果蠅模型

除基于Aβ級聯(lián)假說的AD果蠅模型外，過表達人的Tau蛋白突變體的果蠅模型的應用也比較廣泛，相較于基于Aβ的相關病理機制，Tau蛋白的病理機理與認知功能減退聯(lián)系更加緊密［16］。Tau蛋白是NFTs的主要組成成分，而NFTs是AD主要病理特征之一［17］。研究人員應用GAL4-UAS系統(tǒng)，將人Tau蛋白或Tau蛋白突變體過表達于果蠅的不同部位，開發(fā)出數(shù)種果蠅模型，用于AD的相關研究。應用elav-GAL4將人Tau蛋白或Tau蛋白突變體過表達于所有神經元，可導致果蠅壽命縮短和漸進性神經退行性病變［18］。應用眼睛表達啟動子（Glass multiple reporter- galactose regulates upstream promoter elements 4 ，GMR -GAL4）將人Tau蛋白或Tau蛋白突變體過表達于果蠅的光感受器神經元，即 GMR-GAL4;與UAS-Tau;雜交，則可導致子一代基因型為GMR-GAL4;UAS- Tau;的果蠅產生粗糙眼表型［19］。該表型可以幫助研究人員直觀地判斷Tau蛋白的毒性作用。

對比基于Aβ級聯(lián)假說的幾種AD果蠅模型，Tau蛋白轉基因模型的最大優(yōu)勢在于可以模擬AD患者Tau蛋白的過度磷酸化，因而被廣泛應用。但該模型不能用于模擬AD其他病理過程。Tau蛋白轉基因模型可應用于針對Tau蛋白毒性或與Tau蛋白相關的細胞信號通路的研究，也可應用此模型進行抗Tau蛋白毒性藥物的快速篩選。近年來，由于以Aβ為靶點的多種藥物在臨床試驗中表現(xiàn)不佳，因此Tau蛋白轉基因果蠅模型正受到來自世界范圍內AD藥物研發(fā)領域的重視。

通過GMR-GAL4將人類Tau基因表達在果蠅視網(wǎng)膜上，將Tau蛋白毒性可視化，研究人員發(fā)現(xiàn)了可以調控AD相關基因表達水平的N6-甲基腺苷（N6 -methyladenosine，m6A），該模型幫助研究人員以一種快速、簡單、定性的方式確認了m6A對Tau蛋白毒性的影響，為AD機制的探索以及未來的藥物研發(fā)提供了新的方向［20］。

3小結與展望

果蠅以其生命周期短，繁殖力強，遺傳背景清晰以及基因組測序已全部完成等顯著優(yōu)勢，克服了AD這一神經退行性疾病研究過程中出現(xiàn)的實驗周期長、成本高、致病機制復雜多樣等困難。但是哺乳動物和昆蟲的神經系統(tǒng)在發(fā)育過程中的組織結構以及發(fā)育方式并不完全相同，這使得果蠅無法完美地模擬AD的一切病理過程，例如哺乳動物神經系統(tǒng)內NFTs的形成在果蠅腦內并未觀察到。但是果蠅最大優(yōu)勢在于其遺傳可處理性，這使得它非常容易克服各種限制，在功能相對簡單但進化保守的體內系統(tǒng)中使用強大的遺傳工具，對疾病過程加以模擬，因此果蠅仍被證明是人類神經退行性疾病的絕佳模型。

近年來，關于AD病理機制以及遺傳相關領域的研究取得了豐富的成果，使得我們對于AD有了更為深入的了解，應用果蠅AD模型，不僅可以對大量藥物的抗AD藥效進行初步篩選，還可以進一步從分子水平，對藥物作用的機制進行研究。本文對現(xiàn)有的AD果蠅模型的制備方案、特點、優(yōu)勢、局限性以及成功應用的案例進行了梳理總結。與對所有AD動物模型的研究一樣，許多用于研究果蠅神經退行性變的實驗方法在疾病基因表達的空間和時間方面存在一些局限，例如Tau蛋白在顆粒細胞層中的積累過程超出了果蠅的壽命以及NFTs的模擬難題等。然而，該領域正在不斷發(fā)展，隨著新的遺傳工具不斷投入使用，研究人員將針對AD進行更深層次、更精確的實驗，使果蠅成為研究AD機制及藥物的強大的非哺乳動物體內系統(tǒng)。

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（2023-09-21收稿）