摘 要 山杏營(yíng)養(yǎng)豐富，是很多加工產(chǎn)品的原材料。山杏不僅有生態(tài)效應(yīng)，還有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。組織培養(yǎng)技術(shù)是植物種質(zhì)資源保存、快速繁育與工廠化育苗的重要技術(shù)手段。概述了近年來(lái)山杏組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展，重點(diǎn)對(duì)外植體的選擇與滅菌、直接途徑培養(yǎng)、間接途徑培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等方面的研究成果進(jìn)行了總結(jié)，并提出山杏組織培養(yǎng)中存在的問(wèn)題及需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

關(guān)鍵詞 山杏；組織培養(yǎng)；愈傷組織；培養(yǎng)途徑

中圖分類號(hào)：S662.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.09.002

山杏[Armeniacasibirica（L.）Lam.]為薔薇科杏屬灌木或小喬木，主要分布在俄羅斯的西伯利亞，蒙古東部、東南部及我國(guó)內(nèi)蒙古、北京、山西、遼寧、吉林、黑龍江、新疆、西藏等地區(qū)。山杏具有耐風(fēng)沙、耐貧瘠及耐寒等特點(diǎn)，還具有明顯的水土保持、防風(fēng)固沙作用[1]。山杏果肉、種仁營(yíng)養(yǎng)豐富，包含蛋白質(zhì)、脂肪、脂肪酸、糖類和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，是食品[3]、化妝品[4]、食品添加劑[5]、生物柴油[6]等良好的原材料。山杏在退耕還林、水土保持等生態(tài)建設(shè)中有重要作用，也是發(fā)展貧困山區(qū)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的重要作物之一。組織培養(yǎng)可以保持品種的優(yōu)良特性及快速繁殖、節(jié)省土地、無(wú)季節(jié)限制等。對(duì)山杏組織培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了總結(jié)，以期為山杏組織培養(yǎng)研究和工廠化育苗應(yīng)用提供借鑒。

1" 外植體選擇及消毒方法

1.1" 外植體選擇

外植體是指植物組織培養(yǎng)中的各種接種材料。從理論上講，植物細(xì)胞具有全能性，能夠再生新植株，任何器官、組織、單個(gè)細(xì)胞和原生質(zhì)體都可以作為外植體。為保證植物組織培養(yǎng)獲得成功，選擇合適的外植體是非常重要的。1）選擇優(yōu)良的種質(zhì)及母株：無(wú)論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，還是進(jìn)行生物技術(shù)研究，培養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)、特殊的基因型和生長(zhǎng)健壯的無(wú)病蟲(chóng)害植株。尤其是進(jìn)行離體快繁，只有選取優(yōu)良的種質(zhì)和基因型，離體快繁出來(lái)的種苗才有意義，才能轉(zhuǎn)化成商品；生長(zhǎng)健壯無(wú)病蟲(chóng)害的植株及器官或組織代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，培養(yǎng)后容易成功。2）選擇適當(dāng)時(shí)期的材料：組織培養(yǎng)選擇材料時(shí)，要注意植物的生長(zhǎng)季節(jié)和生長(zhǎng)發(fā)育階段，要在開(kāi)始生長(zhǎng)或生長(zhǎng)旺季采樣，此時(shí)材料內(nèi)源激素含量高，容易分化，組織培養(yǎng)不僅成活率高，而且生長(zhǎng)速度快，增殖率高。3）選取適宜大?。号囵B(yǎng)材料的大小根據(jù)植物種類、器官和培養(yǎng)目的來(lái)確定。材料太大，不易徹底消毒，污染率高；材料太小，易消毒死亡，難以成活。4）外植體要易于消毒：在選擇外植體時(shí)，應(yīng)盡量選擇帶雜菌少的器官或組織，葉片枝條之類應(yīng)先用洗潔精清洗表面再用清水沖洗2～3 h，降低初代培養(yǎng)時(shí)的污染率。1年生組織比多年生組織消毒容易，幼嫩組織比老齡和受傷組織消毒容易。

山杏選取不同的外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的效果也不同。何炎紅等人以山杏成熟胚和胚乳為外植體，研究了山杏經(jīng)愈傷組織途徑建立再生植株的技術(shù)[7]；吳高殷以山杏的成熟胚、子葉、葉片和莖尖作為外植體，研究不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和分化，發(fā)現(xiàn)成熟胚和莖尖是山杏再生植株建立和體細(xì)胞胚胎發(fā)生的最佳外植體[8]；邊俊榮以山杏的成熟胚為外植體，篩選出了山杏成熟胚滅菌時(shí)間，研究了山杏愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)、壯苗和生根培養(yǎng)過(guò)程中的最佳基本培養(yǎng)基和最適激素配比組合，初步建立了山杏成熟胚的再生體系[9]；吳高殷等以山杏莖尖和莖段為外植體，建立起莖尖和莖段組織培養(yǎng)體系[10]；劉曉光等以山杏幼嫩莖尖為外植體，研究山杏初代培養(yǎng)影響因素[11]；萬(wàn)冬梅以當(dāng)年新生嫩枝為外植體，發(fā)現(xiàn)外植體取材最佳時(shí)間為5—7月[12]；劉小蕾通過(guò)試驗(yàn)初步建立了山杏的莖尖、葉片和下胚軸再生體系[13]；董勝君等以山杏為試驗(yàn)材料，選取不同部位、不同樹(shù)齡的外植體，研究發(fā)現(xiàn)隨著外植體在母樹(shù)上取材部位的下移、取材母樹(shù)年齡的降低，山杏叢生芽誘導(dǎo)率和組培苗生根率呈升高趨勢(shì)，其組培幼化效果愈來(lái)愈佳[14]。

外植體的選擇尤為重要。一般而言，外植體類型會(huì)影響組培的效果，葉片[15]、葉柄等部位進(jìn)行組培通常需經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，但會(huì)受到一定的限制，如葉齡、樹(shù)齡等；帶芽莖段、頂芽等部位則能通過(guò)誘導(dǎo)芽萌發(fā)實(shí)現(xiàn)完整個(gè)體的培育，且該過(guò)程不涉及脫分化、再分化，變異率低，繁殖速度快，但也會(huì)因季節(jié)受到限制。雖然種子、胚軸不會(huì)遇到這些問(wèn)題，但種子遺傳變異性較大，不能完全表現(xiàn)母樹(shù)優(yōu)良遺傳因子。

1.2" 消毒滅菌

無(wú)菌操作是組培的開(kāi)端。外植體表面有真菌和細(xì)菌存在，有效滅菌能降低污染率，提高植物存活率。外植體消毒要注意兩個(gè)方面，一是盡可能少傷害到外植體組織，二是要將外植體表面的真菌或細(xì)菌全部殺死。

在組織培養(yǎng)中，外植體先需要簡(jiǎn)單處理一下，用清水清洗表面再用消毒水滅菌。以往外植體消毒是利用升汞，可以使蛋白質(zhì)變形，達(dá)到消毒滅菌目的，但由于升汞毒性很強(qiáng)，容易中毒及廢液不好處理，因此用次氯酸鈉來(lái)替代升汞。不同外植體采用的消毒滅菌方法不同（見(jiàn)表1）。消毒時(shí)隨著酒精長(zhǎng)時(shí)間處理，會(huì)破壞外植體組織細(xì)胞內(nèi)的生物活性，會(huì)出現(xiàn)外植體生長(zhǎng)緩慢等，但不會(huì)導(dǎo)致外植體死亡；隨著升汞長(zhǎng)時(shí)間的處理會(huì)出現(xiàn)外植體死亡等現(xiàn)象，雖然隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)感染率會(huì)下降，但也會(huì)導(dǎo)致外植體無(wú)法生長(zhǎng)等問(wèn)題。

對(duì)于外植體消毒來(lái)說(shuō)，消毒時(shí)間越長(zhǎng)感染率越低，但會(huì)降低外植體的存活性。不同的外植體消毒時(shí)間存在差異。由表1可見(jiàn)，種子先用75%酒精處理30 s再用2%NaClO 浸泡4～8 min，種子成活率在90%左右；莖尖可用75%酒精處理30 s，用0.2%升汞消毒6 min，再用2%NaClO 消毒4 min，成活率可以達(dá)到100%；莖段先用75%酒精處理30 s再用0.1%HgCl2 消毒3 min，成活率可達(dá)到71.10%；葉片滅菌最佳為75%酒精處理30 s，再用2%NaClO處理4 min，成活率100%。不同外植體材料消毒流程大致一樣，根據(jù)材料的來(lái)源、被污染程度等對(duì)消毒液種類組合和消毒時(shí)間做調(diào)整。2%NaClO達(dá)到最佳的滅菌效果，超過(guò)2%的NaClO則會(huì)對(duì)外植體有害，降低其生活力；低于2%的NaClO則達(dá)不到滅菌效果。

2" 山杏組織培養(yǎng)途徑

山杏再生體系構(gòu)建途徑有器官發(fā)生和體細(xì)胞胚發(fā)生2種，器官發(fā)生途徑又分為直接器官發(fā)生途徑和間接器官發(fā)生途徑。

2.1" 直接器官發(fā)生途徑

器官培養(yǎng)是將植物某一器官的全部或部分或器官原基，包括根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等離體的植物器官和組織在人工培養(yǎng)條件下，通過(guò)不同的器官培養(yǎng)，將部分器官或器官原基培養(yǎng)成為完整植株。從表2可見(jiàn)，叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基激素搭配為改良MS[C（NH4+）∶C（NO3-）=0.16]+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1，誘導(dǎo)率為80.00%。在原來(lái)的MS培養(yǎng)基上添加了硝酸銨，誘導(dǎo)率從原來(lái)的50%左右提高了30個(gè)百分點(diǎn)。此外，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑雖可提升組培效果，但濃度過(guò)高則會(huì)呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。從表2來(lái)看，6-BA濃度超過(guò)2.0 mg·L-1會(huì)抑制叢生芽的分化，同樣NAA的濃度升高會(huì)抑制出芽率。另外，外植體的年限及采摘部位也會(huì)影響誘導(dǎo)率。1年生的莖尖誘導(dǎo)率比多年生的莖尖誘導(dǎo)率高，董勝君等選取不同部位、不同樹(shù)齡的莖尖培養(yǎng)，其叢生芽誘導(dǎo)率依次升高且部位間差異顯著。其中1年生莖尖及下部樹(shù)冠莖尖培養(yǎng)最佳[14]。

雖然外植體的種類、生長(zhǎng)狀態(tài)等因素會(huì)影響芽萌發(fā)[16]，但外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑起主導(dǎo)作用，常在培養(yǎng)基中添加NAA、6-BA等以打破限制促進(jìn)芽體萌發(fā)。MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的平衡溶液，其養(yǎng)分?jǐn)?shù)量和比例較合適，可滿足植物的營(yíng)養(yǎng)和生理需要，硝酸鉀含量較高[17]，可用于植物器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)。

2.2" 愈傷組織培養(yǎng)發(fā)生途徑

間接器官發(fā)生途徑的關(guān)鍵是形成愈傷組織，而外植體、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)條件等多種因素均會(huì)影響愈傷組織的誘導(dǎo)。植物的任何外植體都可以用來(lái)培養(yǎng)愈傷組織細(xì)胞。植物組織中的分化組織細(xì)胞具有去分化和再生損傷組織，甚至形成整個(gè)植株的能力，也可以形成全能的愈傷組織細(xì)胞[18-21]。愈傷組織培養(yǎng)物可分為胚性或非胚性。胚性愈傷組織培養(yǎng)物含有分化的胚胎感受態(tài)細(xì)胞，能再生完整的植物；非胚性愈傷組織含有均質(zhì)的去分化細(xì)胞，用于產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物。

由表3可知，愈傷誘導(dǎo)最佳的培養(yǎng)基是MS，激素6-BA+NAA組合搭配是最佳的。6-BA含量在0.5～1.0 mg·L-1有助于愈傷組織誘導(dǎo)；NAA含量在0.1～0.5 mg·L-1之間浮動(dòng)。成熟胚、葉片和莖尖誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程中，6-BA含量超過(guò)1.0 mg·L-1會(huì)抑制愈傷組織的生長(zhǎng)，而誘導(dǎo)葉片和莖尖愈傷組織時(shí)，NAA含量超過(guò)0.2 mg·L-1則會(huì)對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)起到抑制作用；成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，低濃度的NAA達(dá)不到愈傷組織生長(zhǎng)條件。

外植體通過(guò)不同的器官發(fā)生途徑形成體細(xì)胞胚或莖芽，可以快速獲得完整植株，有利于研究器官的功能、分化和形態(tài)建成、快速繁殖等。從愈傷組織再生成為整株植物的過(guò)程被稱為器官發(fā)生或形態(tài)發(fā)生。在這個(gè)過(guò)程中，也需要特定的激素。從表4來(lái)看，山杏愈傷組織分化最佳培養(yǎng)基和激素組合為改良MS（1/2NH4NO3）+TDZ 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，分化率為37.50%。在愈傷組織分化的細(xì)胞分裂素選擇上，在外植體相同以及使用濃度相同的情況下，TDZ的效果遠(yuǎn)高于6-BA[22]；而高濃度的NAA不利于愈傷組織的分化，在MS培養(yǎng)基中添加了硝酸銨，對(duì)于愈傷組織分化起到促進(jìn)作用[23]。山杏愈傷組織分化率較低，可能存在激素搭配不佳、培養(yǎng)條件不同及生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素濃度過(guò)高而導(dǎo)致抑制愈傷組織分化，在生長(zhǎng)素上可以選擇IBA、IAA和2，4-D等，細(xì)胞分裂素可以選擇KT、ZT等，利用不同激素搭配來(lái)提高愈傷組織分化率。

2.3" 體細(xì)胞胚發(fā)生途徑

體細(xì)胞胚發(fā)生途徑指植物細(xì)胞或組織在特定條件下發(fā)育成的胚進(jìn)而發(fā)育成植株個(gè)體的過(guò)程，該途徑更高效且性狀穩(wěn)定、整齊性好[24-25]。體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑分為2種：1）從外植體上直接發(fā)生；2）經(jīng)過(guò)愈傷組織發(fā)生。前者不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，后者需由胚性愈傷組織分化出體細(xì)胞胚。目前對(duì)于山杏體細(xì)胞胚發(fā)生研究較少，吳高殷通過(guò)山杏莖尖誘導(dǎo)胚性愈傷組織，再對(duì)愈傷組織進(jìn)行增殖和分化培養(yǎng)[8]。莖尖培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 0.2 mg·L-1，且添加不同附加物對(duì)于胚性愈傷也有影響（見(jiàn)表5）。研究發(fā)現(xiàn)，3種附加物對(duì)于愈傷組織增殖影響差異性不大，增殖率均在80%以上。胚性愈傷組織分化最佳培養(yǎng)基激素搭配為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1，增殖率為40.0%，且高濃度的6-BA會(huì)加快愈傷組織的褐化死亡。

在莖尖培養(yǎng)過(guò)程中，在均添加2，4-D的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)胚性愈傷，在對(duì)胚性愈傷組織進(jìn)行分化的過(guò)程中，愈傷分化率極低且分化苗長(zhǎng)勢(shì)較弱，應(yīng)該是與前期培養(yǎng)及長(zhǎng)期使用2，4-D有關(guān)。為了提高胚性愈傷組織萌發(fā)率，在培養(yǎng)基中降低2，4-D濃度或者不使用2，4-D，可以有效縮短胚性愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間。

3" 生根移植

無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)植物組培苗生根具有顯著影響。在組培苗誘導(dǎo)生根時(shí)，通常需要降低基本培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度以有利于生根，但濃度過(guò)低又會(huì)導(dǎo)致不定根比較細(xì)；高濃度的無(wú)機(jī)鹽則不利于生根且不定根質(zhì)量差。基本培養(yǎng)基不是一成不變的，為了獲得最佳的生根效果，通常需要根據(jù)植物自身營(yíng)養(yǎng)需求，調(diào)整基本培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分及含量。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的重要組成部分，與植物組織培養(yǎng)能否成功有直接關(guān)系。根據(jù)組織培養(yǎng)的目的，選擇不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和濃度是關(guān)鍵。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸等。植物組培苗芽和根的分化主要受生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素比例的影響[26]。

由表6來(lái)看，生根最佳的培養(yǎng)基激素組合為1/2MS+IBA 1.5 mg·L-1+木醋液（2 000倍液），生根率可達(dá)到100%，平均根數(shù)為5.589，平均根長(zhǎng)為2.644 cm，植株生長(zhǎng)良好。生根培養(yǎng)基中可以添加一定的木醋液，木醋液是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類似物[27]，是一種天然農(nóng)業(yè)植物生產(chǎn)資料，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)人畜無(wú)毒害作用，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)、畜牧業(yè)、工業(yè)、食品加工保鮮及醫(yī)療衛(wèi)生等諸多領(lǐng)域[28-29]。在激素方面，IAA穩(wěn)定性差，極易在培養(yǎng)基中氧化并被快速代謝；IBA比IAA穩(wěn)定，可以外施IBA刺激植物嫩芽產(chǎn)生IAA，從而促進(jìn)生根[30]。NAA是人工合成的生長(zhǎng)素，對(duì)不定芽的生根誘導(dǎo)有顯著影響，通過(guò)促進(jìn)植物組織中儲(chǔ)存的淀粉分解為還原糖，為組培苗提供碳源，從而促進(jìn)根的形成[31]。組培苗根的生長(zhǎng)發(fā)育同樣與NAA濃度密切相關(guān)。在一定范圍內(nèi)，隨著NAA濃度增加，組培苗生根率、平均根數(shù)呈上升趨勢(shì)，但超過(guò)最佳NAA濃度就會(huì)抑制生根。

4" 展望

山杏組織培養(yǎng)受多因素影響，褐化影響較顯著，而植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控在組織培養(yǎng)的各個(gè)環(huán)節(jié)較關(guān)鍵，有效的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比可突破山杏自身局限并提高組培效率、降低褐化率。此外，外植體類型、樹(shù)齡、采樣時(shí)間、培養(yǎng)條件等也是保障組培順利進(jìn)行的因素。

雖然已探究并建立了山杏再生體系，但依然存在需解決的問(wèn)題。1）山杏組織培養(yǎng)研究存在數(shù)據(jù)差異性、愈傷組織褐化、分化率低、參考性不高等問(wèn)題，不同的外植體組織培養(yǎng)適宜的基本培養(yǎng)基、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)環(huán)境均不同，因此，建立不同外植體組織培養(yǎng)體系需要詳細(xì)摸索上述條件；激素濃度是影響愈傷組織褐化的主要因素，激素濃度過(guò)高或過(guò)低會(huì)抑制愈傷組織的形成，限制細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，加快細(xì)胞老化等，從而加速愈傷組織褐化，使細(xì)胞喪失活性。2）現(xiàn)階段對(duì)山杏組織培養(yǎng)報(bào)道較少，在組織培養(yǎng)技術(shù)上缺少完整性和規(guī)范性。3）山杏體細(xì)胞胚再生途徑研究滯后。目前的研究多集中于器官發(fā)生途徑，僅極個(gè)別的山杏組培進(jìn)行了體細(xì)胞胚相關(guān)研究，但仍存在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率低、敗育等問(wèn)題。同時(shí)需深入進(jìn)行體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的研究，建立成熟的體細(xì)胞胚再生體系，為開(kāi)展遺傳轉(zhuǎn)化育種奠定基礎(chǔ)[32]，加快我國(guó)山杏種質(zhì)資源創(chuàng)新進(jìn)程。

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（責(zé)任編輯：易" 婧）