摘要： 【目的】研究金耳多糖（Tremella aurantialba polysaccharide，TAP） 對小鼠體內腸道菌群紊亂的影響?！痉椒ā恳越鸲鸀樵咸崛AP，采用凝膠色譜法、高效液相色譜法、紅外光譜、紫外光譜分析TAP 的結構，再基于環(huán)磷酰胺誘導腸道菌群紊亂的小鼠為模型，使用TAP 進行干預，采用氣相色譜—質譜法（GCMS）測量小鼠結腸內容物短鏈脂肪酸水平，采用糞便16S rRNA 法分析小鼠糞便腸道菌群變化?！窘Y果】TAP分子質量為1 740 ku，為含有β-型糖苷鍵的吡喃型多糖，含微量蛋白質及核酸，主要由甘露糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖3 類單糖組成，占比分別為66.09%、9.51% 和11.45%。動物試驗表明：TAP 處理能增加小鼠結腸內容物的短鏈脂肪酸含量，特別是乙酸和丁酸。糞便16S rRNA 表明：TAP 能夠逆轉腸道菌群紊亂，在門水平上，上調擬桿菌門（Bacteroidetes） 菌群，下調厚壁菌門（Firmicutes） 和變形菌門（Proteobacteria） 菌群；在屬水平上，上調擬桿菌屬（Bacteroides） 和乳桿菌屬（Lactobacillus） 菌群，下調螺桿菌屬（Helicobacter） 菌群?！窘Y論】TAP有望作為一種潛在益生元調節(jié)腸道菌群，減少環(huán)磷酰胺對腸道微生物群的副作用。

關鍵詞： 金耳；多糖；環(huán)磷酰胺；腸道菌群

中圖分類號： S646.601 文獻標志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 03?0090?09

金耳（Tremella aurantialba） 是一種于夏季和秋季生長在闊葉樹（如小葉櫟） 腐朽木材上的專一性真菌，屬于擔子菌綱（Basidiomycetes） 銀耳目（Tremellales），是一種藥食兩用真菌。金耳主要分布于西藏、云南、四川、甘肅等海拔1 000～3 000 m地區(qū)[1-2]。因其具有化痰、止咳、理氣、平喘等藥效，目前已制成抗癌、抗血栓性靜脈炎、抗動脈粥樣硬化和老年性微血管退化等多種藥物[2-4]。金耳多糖（Tremella aurantialba polysaccharide， TAP）作為金耳的主要活性成分，成為當前研究的熱點。

多糖分子質量大、結構復雜，不易被胃腸道消化酶水解，未被水解的多糖進入大腸，被結腸、盲腸中的微生物降解成小分子寡糖和短鏈脂肪酸，這些小分子降解物經過各種代謝途徑和通路對機體產生影響[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)：腸道菌群能夠通過與營養(yǎng)物質、腔內物質、上皮細胞和免疫細胞相互作用影響宿主的生理狀態(tài)[7]。短鏈脂肪酸是特定腸道厭氧菌發(fā)酵膳食纖維和抗性淀粉的主要代謝產物，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，可調節(jié)腸道完整性、葡萄糖水平、脂質代謝和炎癥反應，對于維持機體健康具有重要意義[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)：金耳多糖具有抗氧化、降血糖、降血脂、抑制腫瘤、增強細胞免疫等功效[10-14]，但TAP 對腸道微生物的調節(jié)作用研究鮮有報道。

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，Cy） 是臨床癌癥藥物之一，已被列為醫(yī)療保健系統(tǒng)所需的基本藥物[15]，但Cy 在殺傷腫瘤細胞的同時也會破壞機體自身的免疫細胞，導致免疫力低下，并且還伴有胃腸道不良反應[16]、打破腸道環(huán)境平衡等副作用[17-18]。本研究以Cy 建立腸道紊亂小鼠模型，評價TAP 對小鼠腸道菌群紊亂的調節(jié)作用，以期為TAP 維持腸道健康及其充分應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料、動物及試劑

供試原料：干制金耳購自昆明朝迎商貿有限公司，樣品經粉碎后過80 目篩備用。

供試動物：BALB/c 小鼠，雄性，4 周齡，體質量（20±2） g，購自昆明醫(yī)科大學，許可證編號SCXK（滇）K2020-0004。

試驗試劑：Cy 購自美國sigma 公司；氯仿購自成都市科隆化學品有限公司；正丁醇和苯酚購自天津風船化學試劑科技有限公司；無水乙醇購自四川西隴科學有限公司；二甲苯、磷酸和乙醚購自國藥集團化學試劑有限公司；乙酸購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司；丙酸購自美國fluka 公司；異丁酸和正丁酸購自TMSTANDARD 公司；異戊酸和正戊酸購自德國CNW 公司；酶和緩沖液購自New England Biolabs 公司；GeneJET 膠回收試劑盒購自Thermo Scientific 公司；透析袋MD34（7000D） 購自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 試驗儀器

氣相色譜儀—質譜儀和高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；安捷倫XDB-C18 色譜柱、紅外光譜儀（Thermo Scientific） 和紫外光譜儀，UNICO（上海） 儀器有限責任公司，紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；ELEOSSystem 凝膠色譜儀，美國WYATT 公司；酶標儀（Thermo Fisher）， 上海輔澤商貿有限公司；PCR 儀（Bio-rad T100 梯度），北京楚齊儀表有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 TAP 的制備

取干制金耳，粉碎后得細粉，將細粉按照料液比1∶40 （g∶mL）、溫度90 °C、時間3 h 萃取2 次，離心取上清，合并2 次的濾液；旋蒸濃縮至原體積的1/4～1/5，加入4 倍體積的無水乙醇，置于4 ℃ 冰箱過夜，離心回收沉淀物。通過Sevage法去除蛋白，透析冷凍干燥得到TAP。

1.2.2 TAP 總糖、糖醛酸和蛋白質含量的測定

（1） TAP 總糖含量測定：采用苯酚—硫酸法[19]。配制0.1 mg/mL TAP 溶液，按照標準曲線回歸方程計算TAP 總糖含量?？偺呛?（m1/m）×100%；m1=ρ×V×n。式中：m1 為總糖質量；m 為粗多糖質量；ρ 為依據標準曲線測得的葡萄糖質量濃度；V 為TAP 溶液的體積；n 為TAP 溶液的稀釋倍數。

（2） TAP 糖醛酸含量測定：采用咔唑—硫酸比色法[20]。配制1 mg/mL TAP 溶液，按照標準曲線回歸方程計算TAP 糖醛酸含量，計算方法同（1）。

（3） TAP 蛋白含量測定：采用考馬斯亮藍法[21]。配制0.1 mg/mL TAP 溶液，按照標準曲線回歸方程計算TAP 蛋白質含量，計算方法同（1）。

1.2.3 TAP 分子質量測定

采用高效滲透凝膠色譜法。將多糖溶解，過0.22 μm 膜備用，流動相：0.05 mol/L 硫酸鈉+0.02%NaN3，流速：1 mL/min，柱溫：40 ℃；進樣量：500 μL。

1.2.4 TAP 紅外光譜測定

取TAP 2 mg 與溴化鉀混合研磨，用紅外光譜儀在450～4 000 cm?1 范圍內進行掃描。

1.2.5 TAP 紫外光譜測定

將TAP 配置成10 mg/mL 的溶液，在190～400 nm 下進行紫外全波長掃描。

1.2.6 TAP 單糖組成測定

采用液相色譜1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 柱前衍生法測定單糖含量。取TAP 10～15 mg 于安瓿瓶中，加入4 mol/L 三氟乙酸（TFA）4.0 mL，混勻后用酒精噴燈封口，于121 ℃ 水解2 h，自然冷卻后氮氣（60 ℃） 吹干，加入甲醇2.0 mL，氮氣吹干，重復加入3 次，除去TFA，加入蒸餾水1.5 mL，離心取上清液即為多糖水解液。取多糖水解液160 μL，依次加入0.3 mol/LNaOH 160 μL、蒸餾水210 μL 和PMP 400 μL，渦旋1 min，70 ℃ 水浴反應60 min，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl 160 μL 中和，再加入三氯甲烷0.8 mL 振蕩萃取，棄氯仿層，萃取3 次。水相過0.45 μm 有機濾膜，再進行HPLC 色譜測定。HPLC 色譜條件： 色譜柱： 安捷倫XDBC18，250mm×5 μm；流速：1 mL/min；流動相：0.1 mol/L 磷酸鹽∶乙腈=83∶17。

1.2.7 小鼠分組及給藥

將72 只雄性BALB/c 小鼠適應7 d 后隨機分為6 組，每組12 只。除正常組小鼠外，其他組小鼠在第8、9、10 天連續(xù)每天腹腔注射1 次80 mg/kg Cy，正常組注射等量生理鹽水。在第11～17 天灌胃不同物質（表1），每天灌胃1 次。于第17 天采集小鼠糞便，將小鼠轉移至滅菌的小鼠籠中，待小鼠自然排便，用滅菌的牙簽收集糞便于無菌凍存管中，將凍存管放入?80 ℃ 保存。整個收集過程在超凈工作臺中進行。于第18 天處死小鼠，收集小鼠結腸內容物，保存于?80 ℃ 冰箱。

1.2.8 小鼠結腸短鏈脂肪酸含量測定

取適量樣品加入磷酸水溶液（V磷酸∶V去離子水=1∶3） 2 mL，渦旋均漿2 min，加入乙醚2 mL 萃取10 min，4 000 r/min 低溫離心20 min；取乙醚相， 加入乙醚2 mL 進行二次萃取10 min，4 000 r/min 低溫離心分離；再次取乙醚相，將2 次萃取液合并揮發(fā)定容至2 mL，利用GC-MS對萃取液中的短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs） 進行檢測。色譜柱：HP-INNOWAX 25 m×0.20 mm×0.40 μm；色譜條件：柱溫初溫100 ℃ 保持5 min，以5 ℃/min 升至150 ℃，再以30 ℃/min升至240 ℃，保持30 min；進樣口溫度：240 ℃；載氣流速：1.0 mL/min。

1.2.9 小鼠糞便微生物測定

采用16S rRNA 高通量測序分析TAP 對小鼠糞便微生物的影響。無菌采集小鼠糞便，立即放入2 mL 凍存管中，保存于?80 ℃ 冰箱。采用磁珠法[22]提取小鼠糞便微生物基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度，取適量樣品于離心管中， 使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板，使用帶Barcode的特異引物515F-806R 對16S rDNA 的V4 測序區(qū)域進行特異性擴增，隨后進行PCR 產物的混樣和純化，最后構建文庫，經Qubit 定量和文庫檢測，合格后進行上機測序。α 多樣性分析采用Qiime 軟件（Version 1.9.1） 計算觀測物種數、Shannon指數、Simpson 指數、Chao1 指數和ACE指數。觀測物種數，即分類操作單元（operationaltaxonomic unit，OTU） 數量，其值越大，表明物種豐富度越高；Shannon 指數可以反映樣品中的分類總數及其占比，其值越大，群落多樣性越高，物種分布越均勻；Simpson 指數表征群落內物種分布的多樣性和均勻度；Chao1 指數用于估計群落樣品中包含的物種總數；ACE 指數用于估計群落中OTU 數量。主坐標分析（PCoA） 采用Qiime 軟件（Version 1.9.1） 計算Unifrac 距離，構建UPGMA 樣本聚類樹，采用R 軟件（Version 2.15.3） 繪制PCoA 圖。

1.3 數據處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 19 進行統(tǒng)計分析，數據用“平均值±標準差”表示。采用單因素方差分析和鄧肯檢驗，Plt;0.05 表示在統(tǒng)計學上存在顯著差異。采用Origin 2018 繪圖。

2 結果與分析

2.1 TAP 總糖、糖醛酸和蛋白質的含量

根據葡萄糖OD490 與葡萄糖質量濃度間的線性關系得到回歸線性方程y=0.007 9x+0.003 0，R2=0.999 0；由該方程計算TAP 總糖含量為88.29%。根據半乳糖醛酸OD523 與半乳糖醛酸質量濃度間的線性關系得到回歸線性方程y=0.006 5x+0.020 8，R2=0.993 7； 由該方程計算TAP 糖醛酸含量為10.08%。根據牛血清蛋白OD595 與牛血清蛋白質量濃度間的線性關系得到回歸線性方程y=0.009 0x+0.025 4，R2=0.992 8；由該方程計算TAP蛋白質含量為0.70%。

2.2 TAP 的分子質量

經凝膠色譜分析：TAP 有1 個色譜峰（圖1），其重均分子質量為1.740×106 u，數均分子質量為1.040×106 u，平均分子質量為1.743×106 u，峰值分子質量為9.313×105 u；多分散系數為1.197，多分散指數為1.675，分散系數較大，均一性較差，屬于寬分布的多分散體系。該結果與杜秀菊等[23]分離得到的TAP 組分TATP1 分子質量（1.35×106 u） 基本一致。

2.3 TAP 的紅外光譜

由圖2 可知：在3 800～600 cm?1 處，具有多糖的特征吸收峰。在3 388.24 cm?1 左右為—OH吸收峰；在2 903.70 cm?1 處為C—H 吸收峰；在1 651.15 cm?1 左右為C=O 吸收峰；在1 415.86 cm?1為C=O 對稱伸縮振動，是糖醛酸中質子化羰基特征峰，表明含有糖醛酸，這與單糖組成結果一致；在1 302.64 cm?1 處為C—H 的彎曲振動；在1 050.98 cm?1 處為吡喃環(huán)骨架的C—O 變角振動吸收峰，表明存在C—O—C 和C—C 結構；908.44 cm?1 處出現(xiàn)吸收峰，表明存在β-型糖苷鍵；在811.59 cm?1 處為C—O—S 伸縮振動（赤道配位）。

2.4 TAP 的紫外光譜

由圖3 可知：在280 和260 nm 處出現(xiàn)較小的吸收峰，表明制備的TAP 含有蛋白質和核酸，為了盡量減少蛋白質對多糖的影響， 后續(xù)對TAP 進行進一步分離純化。

2.5 TAP 的單糖組成

由圖4、5 可知：TAP 由甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖7 種單糖組成，其摩爾比為5.77∶0.56∶0.04∶0.83∶1.00∶0.25∶0.28。其中，甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸的占比分別為66.09%、11.45% 和9.51%，是TAP 的主要組成。

2.6 小鼠結腸的短鏈脂肪酸含量

經測定，乙酸、丙酸和丁酸約占短鏈脂肪酸（SCFAs） 總量的95% 以上。由表2 可知：與NC組相比，MC 組的SCFAs 總量和丁酸含量顯著降低（Plt;0.05），而乙酸、丙酸和戊酸含量無顯著差異。TAP 處理后，乙酸含量較NC 組均無顯著差異，但HTP 組的乙酸含量顯著高于MC 組（Plt;0.05）；MTP 組和HTP 組的丁酸含量、SCFAs總量較NC 組無顯著差異，但均顯著高于MC 組（Plt;0.05），且SCFAs 總量呈劑量依賴性升高，表明HTP 組處理可以使小鼠結腸內的SCFAs 含量趨于正常。

2.7 小鼠糞便微生物的多樣性

2.7.1 微生物α 多樣性

由表3 可知：與NC 組相比，MC 組的觀測物種數、Chao1 指數和ACE 指數顯著減?。≒lt;0.05），Shannon 指數和Simpson 指數無顯著差異；TAP 處理后，觀測物種數、Chao1 指數和ACE指數升高，說明TAP 可以改變微生物菌群的多樣性。

2.7.2 主坐標分析

由圖6 可知：經Cy 處理后，模型組菌群組成結構發(fā)生了一定的偏移；TAP 處理后，菌群組成結構朝NC 組方向發(fā)生偏移，說明TAP 可在一定程度上調節(jié)糞便菌群組成。

2.7.3 微生物的物種組成

由圖7 可知：在門水平上，各組小鼠糞便微生物群主要由擬桿菌門（Bacteroidetes） 和厚壁菌門（Firmicutes） 組成，占菌落總數的90% 以上。經Cy 處理的小鼠結腸內容物中，厚壁菌門和變形菌門（Proteobacteria） 的相對豐度較NC 組分別增加27.53% 和41.79%，擬桿菌門的相對豐度較NC 組下降10.49%；經TAP 處理后，與MC 組相比，擬桿菌門的相對豐度增加7.39%，厚壁菌門和變形菌門的相對豐度分別降低10.29% 和50.98%，厚壁菌門與擬桿菌門的比值下降16.52%。由圖8 可知：在屬水平上，各組小鼠腸道微生物主要由薩科瑞莫納斯屬（Candidatus_Saccharimonas）、擬桿菌屬（Bacteroides） 、乳桿菌屬（Lactobacillus）、另枝菌屬（Alistipes）、毛螺旋菌屬（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、厭氧原體屬（Anaeroplasma）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、Gilliame-lla、螺桿菌屬（Helicobacter） 和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）組成，與NC 組相比，經Cy 處理后，擬桿菌屬、乳桿菌屬和另枝菌屬的相對豐度分別下降19.32%、13.55% 和46.33%，螺桿菌屬的相對豐度增加46.11%；經TAP 處理后，擬桿菌屬和乳桿菌屬的相對豐度顯著上升（Plt;0.05），螺桿菌屬的相對豐度則顯著下降（Plt;0.05）。

3 討論

不同的提取方法與純化程度會影響TAP 的結構，如分子質量、單糖組成、糖苷鍵類型等，進而影響其生物活性[8， 24]。本研究以金耳為原料，通過水提醇沉、脫蛋白、透析等步驟得到TAP，其重均分子質量為1.740×106 u，主要由甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸組成。DENG 等[25]采用堿提法提取發(fā)酵的TAP，其主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和糖醛酸組成，與本研究TAP 單糖組成結果相似。YUAN 等[26]采用水提醇沉法提取TAP，再經DEAE Sepharose 柱層析進行純化，其分子質量為6.24×105 u，主要由甘露糖、木糖和葡萄糖醛酸組成，與本研究相比，其TAP 均一性更好、分子質量更小且單糖組成存在一定差異，這可能是由于通過DEAE Sepharose 柱層析，提高了TAP 的純度。SUN 等[15]采用2 種方法提取TAP，發(fā)現(xiàn)提取的多糖分子質量有一定的差異，從金耳子實體中直接提取的多糖分子質量為1.13×106 u，經過發(fā)酵后提取的多糖分子質量為2.92×106 u，該分子質量也與本研究存在一定差異，分析其原因可能是提取部位與提取方法不同所致。孢子發(fā)酵法提取的多糖是在發(fā)酵液中提取的胞外多糖，而沸水與酶法則是提取子實體中的胞內多糖，2 種多糖均為含有β-糖苷鍵的吡喃型糖，這與本研究紅外光譜分析結果相似。分子質量會影響多糖在腸道中的利用，與低分子質量多糖相比，高分子質量天然多糖在減輕腸黏膜損傷方面具有優(yōu)勢[27]，但在大腸中酵解相對低分子多糖更困難，適當大小的多糖更容易被腸道微生物利用[28]。TAP 分子質量為1 740 ku，分子質量適中，使其能夠在腸道中被合理利用。

腸道微生物可以將難消化的多糖發(fā)酵轉化為SCFAs。SCFAs 增多會降低腸道pH，有利于共生菌的生長，繼而調節(jié)腸道菌群平衡、維持和調節(jié)腸道健康[29-30]；SCFAs 能夠為腸道上皮細胞提供能量，維持水電解質平衡，還能夠抗病原微生物、抗炎、抗腫瘤、預防肥胖、預防非酒精性脂肪肝和預防2 型糖尿病[31-33]。葡萄糖醛酸、木糖、果膠、半乳糖、半乳糖醛酸酵解產生乙酸；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖酵解產生丙酸，丁酸由木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、半乳糖醛酸產生，木糖對丁酸產生影響最大，甘露糖與葡萄糖比值高，可以產生更多的丁酸[28， 31]。本研究表明：TAP可以顯著增加結腸內容物中乙酸和丁酸的含量，這可能與TAP 單糖組成有關。本研究中，TAP甘露糖含量最高（66.09%），易被腸道微生物利用產生丁酸，且葡萄糖和葡萄糖醛酸有利于丙酸和乙酸產生，而丙酸含量與對照組無顯著差異的原因可能是丙酸被進一步發(fā)酵產生乙酸；此外丙酸還參與體內的脂質代謝，導致丙酸在體內大量消耗[34]，這一結果與已有研究結果[17-18， 35]相似，說明TAP 可以被腸道微生物高度發(fā)酵利用，促進SCFAs 產生。

腸道菌群具有多種功效，如作為腸屏障能防止病原體入侵宿主，參與維生素K、B 族的合成，調節(jié)代謝，為腸道提供營養(yǎng)等功能。多糖是腸道菌群的主要能源和營養(yǎng)來源，對腸道菌群具有調節(jié)作用[36-37]。本研究采用16S rRNA 高通量測序分析TAP 對小鼠糞便微生物的影響?？诜o藥后，OTUs 數據呈現(xiàn)出微生物群落多樣性增加的趨勢。本研究表明：Cy 處理后，微生物群落結構發(fā)生了顯著變化，但TAP 組的微生物群落結構向NC組偏移，說明TAP 可在一定程度上逆轉微生物群落結構變化，這與已有研究的結果相似[17-18， 35]。厚壁菌門和擬桿菌門具有廣泛的碳水化合物修飾酶，在多糖消耗中起著重要的作用[38]，TAP 逆轉了Cy 引起的厚壁菌門與擬桿菌門比值（F/B） 升高的趨勢，F(xiàn)/B 的變化是TAP 在大腸消耗和發(fā)酵的結果。研究發(fā)現(xiàn)：F/B 的降低更有利于腸道健康，具有減少宿主從飲食中吸收多余能量的潛力[39]，故推測TAP 可能具有減少宿主從飲食中吸收多余能量的潛力。在屬水平上，雙歧桿菌屬和乳桿菌屬是最常見的益生菌，對宿主有各種有益作用[40]，而螺桿菌屬對身體具有致病作用[41]。經TAP 處理后，擬桿菌屬和乳桿菌屬的相對豐度均顯著上升，而螺桿菌屬的相對豐度顯著下降。

4 結論

通過水提醇沉法從金耳中提取得到金耳多糖，其分子質量為1 740 ku，主要由甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸3 類單糖組成，占比分別為66.09%、11.45% 和9.51%，是含有β-型糖苷鍵的吡喃型多糖。金耳多糖能夠在一定程度上增加小鼠糞便的短鏈脂肪酸含量，調節(jié)腸道微生物結構，促進有益菌生長，抑制有害菌生長，有望作為益生元調節(jié)腸道菌群，促進腸道健康。本研究結果為金耳多糖系列產品開發(fā)提供了一定的理論依據。

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責任編輯：何承剛

基金項目：云南農業(yè)大學發(fā)展基金（KX900002）。