關(guān)鍵詞代謝組學(xué)；峰檢測；centWave；集成學(xué)習(xí)

代謝組學(xué)通過對小分子代謝物譜的系統(tǒng)研究，有助于全面了解生物體中小分子代謝物在受刺激或擾動后的變化[1]，在基礎(chǔ)研究和臨床實踐中發(fā)揮著越來越重要的作用[2-3]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）和核磁共振（NMR）是目前代謝組學(xué)最常用的通用分析技術(shù)[4]。在代謝組學(xué)研究中，上述分析技術(shù)均存在優(yōu)缺點，其中，LC-MS具有樣品處理簡單、快速、高通量、高分辨率以及可覆蓋樣本中大部分代謝物等優(yōu)點，近年來該技術(shù)的運用越來越廣泛[5-6]?；贚C-MS的代謝組學(xué)研究會產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，而對質(zhì)譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理（Datapre-processing）、統(tǒng)計分析（Statisticalanalysis）和代謝物注釋（Metaboliteannotation）是代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理需要解決的主要問題[7]。峰檢測（Peakpicking）是數(shù)據(jù)預(yù)處理的第一步，也是最重要的一步，為后續(xù)的多元統(tǒng)計分析提供了初始的代謝物特征矩陣[7-9]。

目前，研究者開發(fā)了多種數(shù)據(jù)預(yù)處理工具，包括質(zhì)譜供應(yīng)商提供的商業(yè)軟件，如Agilent公司的MassHunterProfinder軟件、Thermofisher公司的CompoundDiscoverer軟件等。此外，還有一些廣泛使用的開源軟件，如XCMS[10]、MZmine2[11]、MetAlign[12]和MAVEN[13]軟件等。在這些軟件中，XCMS（包括R版本和Online[14]）是目前應(yīng)用最廣泛的軟件之一，其后添加的centWave算法廣泛應(yīng)用于高分辨質(zhì)譜的峰檢測，相比于XCMS中原有的matchedFilter算法[10]，基于連續(xù)小波變換的centWave可以適應(yīng)不同的峰寬[15]。然而，centWave算法中需要設(shè)置的關(guān)鍵參數(shù)較多，使用者必須熟悉所使用的色譜和質(zhì)譜的相關(guān)信息，并根據(jù)得到的具體數(shù)據(jù)進行手動調(diào)節(jié)；若參數(shù)設(shè)置不當(dāng)，通常會導(dǎo)致結(jié)果較差。為了對新學(xué)者更加友好且得到更好的centWave參數(shù)，Manier等[16]以峰面積的變異系數(shù)為優(yōu)化指標(biāo)開發(fā)了centWaveSweep算法；Libiseller等[17]以同位素色譜峰數(shù)量為優(yōu)化指標(biāo)開發(fā)了自動調(diào)整centWave參數(shù)的算法IPO（Isotopologueparametersoptimization）。

近來，Albóniga等[18]比較了專家手動調(diào)整參數(shù)和IPO參數(shù)優(yōu)化算法自動調(diào)整參數(shù)后的優(yōu)化效果，結(jié)果表明，在峰面積可重復(fù)性方面，IPO比手動調(diào)整得到的結(jié)果更好。然而，該研究經(jīng)過數(shù)據(jù)處理后得到了15個候選特征，其中只有8個候選特征有良好的色譜峰形且可被準(zhǔn)確積分，去除3個同位素峰后，只有5個特征能夠進行后續(xù)研究。Myers等[9]同樣在多個不同的數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)centWave算法得到了大量的假陽性峰（即噪聲峰因沒有合適峰形而不能準(zhǔn)確積分的色譜峰）。

目前，centWave參數(shù)優(yōu)化的結(jié)果比較均基于色譜峰面積的重復(fù)性[16-18]，并未考慮色譜峰的峰形優(yōu)劣，但較差的峰形可能使得下游生物標(biāo)志物的分析出現(xiàn)假陽性結(jié)果[9，18]。為了克服以往只使用峰面積可重復(fù)性作為centWave參數(shù)優(yōu)化評價指標(biāo)的局限性，本研究增加了優(yōu)良峰形色譜峰比例和可信色譜峰（同位素峰）比例這2個指標(biāo)，對centWave參數(shù)優(yōu)化算法進行了全面比較。此外，為了快速準(zhǔn)確地區(qū)分色譜峰形的優(yōu)劣，本研究建立了以樹模型為基學(xué)習(xí)器的3個機器學(xué)習(xí)模型，并比較了不同模型的區(qū)分效果。采用基于centWave的峰檢測參數(shù)優(yōu)化算法對代謝物標(biāo)準(zhǔn)品和尿液2個數(shù)據(jù)集和3種評價指標(biāo)進行了綜合比較分析。本研究有助于更好地理解不同優(yōu)化算法的優(yōu)點和局限性，為參數(shù)優(yōu)化算法的選擇及其后續(xù)改進提供參考。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

6545quadrupole-time-of-flight（Q-TOF）高分辨質(zhì)譜儀，配備具有Jetstream技術(shù)的電噴霧離子源（美國Agilent公司）；1290Infinity超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；D2012plus高速離心機（中國大龍公司）。乙腈（質(zhì)譜級，純度≥99.9%，德國Merck公司）；甲酸（質(zhì)譜級，純度≥98%，美國Sigma公司）。實驗用水為超純水（18.2MΩ·cm）。

1.2樣本處理

健康人尿液來自實驗室2名健康志愿者，采集后于?80℃保存。實驗前，尿液于室溫下融化，各取100μL，共200μL，加入200μL質(zhì)譜級甲醇，渦旋振蕩2min，15000r/min離心10min，取上清液200μL，加入200μL超純水稀釋，待測。

1.3色譜及質(zhì)譜條件

WatersAcquityBEHHSST3色譜柱（100mm×2.1mm，1.8μm），柱溫40℃，進樣量為5μL，流速350μL/min，柱溫箱溫度為4℃。流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液；流速350μL/min。梯度洗脫：0min，10%B；0～6min，10%～60%B；6～12min，60%～100%B；12～15min，100%B；15～20min，10%B。

質(zhì)譜離子源參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓4000V，毛細(xì)管出口電壓（Fragmentorvoltage）125V，噴嘴電壓0V，干燥器溫度（Drygastemperature）325℃，流速10L/min，鞘氣溫度（Sheathgastemperature）350℃，流速11L/min，噴霧室壓力（Nebulizerpressure）45psi（1psi=6.89kPa）。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式為全掃描模式（Full-scan），采集范圍m/z100～1000，采集頻率2.5Hz，檢測器模式2GHzExtendeddynamicrange。質(zhì)譜運行中采用參比離子進行校正，參比離子為m/z121.050873和m/z922.009798。

1.4非靶向代謝組學(xué)公共數(shù)據(jù)集

除了自建的尿液非靶向數(shù)據(jù)外，本研究還從Metabolights（ID：MTBLS1572）下載了公開的非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進行補充，該數(shù)據(jù)由代謝物標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為8.3ng/mL）混合進樣后得到，色譜柱為WatersACQUITYUPLCBEHC18（1.0mm×100mm，1.7μm），采用Agilent1290InfinityⅡ超高效液相色譜儀和BrukerImpactⅡ超高分辨率四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀，掃描模式為全掃描，速度2Hz。

1.5數(shù)據(jù)處理

1.5.1數(shù)據(jù)集預(yù)處理

質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)由ProteoWizard轉(zhuǎn)化成mzXML格式。質(zhì)譜數(shù)據(jù)預(yù)處理和可視化均在R環(huán)境（Ver.4.1）下完成。峰檢測由XCMS包中centWave算法完成，其中，待優(yōu)化的初始參數(shù)為XCMSOnline中對應(yīng)質(zhì)譜儀所推薦的參數(shù)。centWave優(yōu)化參數(shù)分別由IPO和centWaveSweep算法得到。centWave算法優(yōu)化的關(guān)鍵參數(shù)為ppm、minpeakwidth、maxpeakwidth、mzdiff、prefilter和snthresh。

1.5.2峰形分類特征矩陣生成

為建立峰形分類集成學(xué)習(xí)模型，首先參考文獻[9]對色譜峰的優(yōu)良峰形進行如下定義：（1）峰的邊緣點上的離子強度小于峰最高點離子強度的50%（峰完整性，防止對峰進行部分積分）；（2）峰旁邊未被相似強度的不規(guī)則噪音峰包圍；（3）只能包含一個尖峰（防止對嚴(yán)重分裂峰進行積分）。相關(guān)圖示說明見電子版文后支持信息圖S1。

根據(jù)定義，為了使集成學(xué)習(xí)模型更好地分類，選擇了6種峰形評價指標(biāo)[19-21]作為色譜峰特征，即色譜峰對稱性（Symmetry，SYM）、色譜峰最大邊界比值（Maxboundaryratio，MBR）、色譜峰信息熵（Entropyindex，EI）、色譜峰高斯相似性（Gaussiansimilarity，GS）、峰面積三角形（由兩端點和峰頂點組成）相似性（Trianglepeakareasimilarityratio，TPASR）和色譜峰分裂指數(shù)（Splitindex），從不同角度對峰形進行評價，具體公式見電子版文后支持信息表S1。

1.5.3集成學(xué)習(xí)區(qū)分峰形模型的建立

峰形分類選用3種以樹模型為基學(xué)習(xí)器（Base-learner）的集成學(xué)習(xí)（Ensemblelearning）算法：隨機森林（Randomforest）、自適應(yīng)提升（Adaboost）和梯度提升樹（Gradientboostingdecisiontree），由python包sklearn（ver.0.20.3）實現(xiàn)。模型訓(xùn)練數(shù)據(jù)集由人工根據(jù)上一部分定義對峰形好壞進行劃分。為降低過擬合和提高模型泛化性能，采用五折交叉驗證對訓(xùn)練集進行超參數(shù)調(diào)整和評價模型性能。由于該問題為二分類問題且訓(xùn)練集為平衡數(shù)據(jù)集，本研究引入準(zhǔn)確率（Accuracy）和F1分?jǐn)?shù)（F1score）2個指標(biāo)對模型區(qū)分效果進行評價。

2結(jié)果與討論

2.1整體研究流程和方法建立

本研究考察了IPO和centWaveSweep兩種算法對centWave參數(shù)優(yōu)化的效果，采用不同的評價指標(biāo)將使用優(yōu)化參數(shù)的centWave生成的所有色譜峰與XCMSOnline推薦的默認(rèn)參數(shù)得到的所有色譜峰進行比較。

比較流程如圖1所示，為了全面比較centWave參數(shù)的優(yōu)化效果，測試數(shù)據(jù)分為兩類，由代謝物標(biāo)準(zhǔn)品配制的混合溶液樣本和健康人尿液樣本組成。采用可信峰比例、可重復(fù)峰比例、優(yōu)良峰形色譜峰比例3種指標(biāo)對生成的色譜峰進行考察。

可信色譜峰比例定義為可信色譜峰數(shù)量占全部色譜峰數(shù)量的百分比，可信色譜峰的判別標(biāo)準(zhǔn)為該峰是否有同位素峰，由IPO包中的findIsotopes函數(shù)計算得到。

可重復(fù)色譜峰比例定義為可重復(fù)色譜峰數(shù)量占全部色譜峰數(shù)量的百分比，可重復(fù)色譜峰為該峰在不同的進樣批次中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）lt;30%的色譜峰。

優(yōu)良峰形色譜峰比例定義為優(yōu)良峰形色譜峰數(shù)量占全部峰數(shù)量的百分比，優(yōu)良峰形色譜峰具體定義見1.5.2節(jié)。

XCMSOnline推薦的centWave參數(shù)以及經(jīng)IPO和centWaveSweep優(yōu)化后的centWave參數(shù)如表1所示。相比于XCMSOnline的推薦參數(shù)，IPO和centWaveSweep兩種算法優(yōu)化得到的最小色譜峰寬均變大，而最小色譜峰寬參數(shù)過小會導(dǎo)致造成色譜峰分裂。另外，centWaveSweep根據(jù)色譜峰面積RSD進行優(yōu)化，預(yù)過濾參數(shù)和信噪比閾值這2個參數(shù)均比推薦參數(shù)大幅提高。

2.2基于集成學(xué)習(xí)的峰形區(qū)分模型的建立及優(yōu)良峰形比例比較

為了快速對得到的峰形進行分類，選用3種集成學(xué)習(xí)算法：隨機森林、自適應(yīng)提升和梯度提升樹（圖2）。模型建立方法如下：首先用XCMS包中g(shù)etEIC函數(shù)得到色譜峰的強度向量和時間向量，并根據(jù)這兩個向量計算6個色譜峰形評價指標(biāo)。將每個色譜峰的6個峰形評價指標(biāo)和1個標(biāo)簽（峰形優(yōu)劣，其中訓(xùn)練集標(biāo)簽為人工標(biāo)注）得到的特征矩陣作為區(qū)分模型的輸入，用五折交叉驗證在訓(xùn)練集上對不同算法的超參數(shù)進行優(yōu)化，得到各算法超參數(shù)最優(yōu)組合如下：隨機森林n_estimators=1000，max_depth=5，max_features=6；自適應(yīng)提升n_estimators=300，learning_rate=0.5；梯度提升樹n_estimators=1000，learning_rate=0.1，max_depth=4。各算法效果如表2所示，3種集成學(xué)習(xí)算法除梯度提升樹外，準(zhǔn)確度均大于90%，F(xiàn)1分?jǐn)?shù)均大于0.9。其中，隨機森林的準(zhǔn)確率和F1分?jǐn)?shù)最高。因此，本研究選擇隨機森林進行色譜峰形區(qū)分。

在兩種不同來源的樣本中，采用峰形優(yōu)劣區(qū)分模型對兩種優(yōu)化算法和默認(rèn)參數(shù)得到的色譜峰進行優(yōu)良峰形色譜峰比例比較。在代謝物標(biāo)準(zhǔn)品樣本中，IPO和centWaveSweep算法優(yōu)化參數(shù)后得到的優(yōu)良峰形色譜峰比例分別為53.5%和50.2%，而默認(rèn)參數(shù)為53.6%。對于尿液樣品，IPO和centWaveSweep算法優(yōu)化參數(shù)后得到的優(yōu)良峰形色譜峰比例分別為35.3%和43.4%，而默認(rèn)參數(shù)為41.7%。

從不同算法得到優(yōu)良峰形色譜峰比例可知，對于代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，centWaveSweep算法得到的優(yōu)良峰形色譜峰比例最低，但不同算法和默認(rèn)參數(shù)得到的優(yōu)良峰形色譜峰比例相差幅度不大（lt;5%）;對于尿液樣本，IPO算法得到的優(yōu)良峰形色譜峰比例最低，但相差幅度與代謝物標(biāo)準(zhǔn)品樣本類似，考慮到區(qū)分模型的準(zhǔn)確率為93.5%，可認(rèn)為兩種優(yōu)化算法及默認(rèn)參數(shù)得到的優(yōu)良峰形色譜峰比例并沒有差異。

值得注意的是，無論是優(yōu)化參數(shù)算法，還是默認(rèn)參數(shù)，其優(yōu)良峰形色譜峰比例均較低（lt;60%）。雖然兩種優(yōu)化算法相比于默認(rèn)參數(shù)得到的優(yōu)良峰形色譜峰的比例并無差異，但經(jīng)過優(yōu)化參數(shù)算法后得到的色譜峰完整性指標(biāo)（色譜峰最大邊界比值）在不同的數(shù)據(jù)集上均顯著優(yōu)于默認(rèn)參數(shù)（Wilcoxtest，plt;2.2×10–16），說明優(yōu)化算法通過調(diào)整最小色譜峰寬和最大色譜峰寬可顯著提高色譜峰的完整性。

2.3不同算法的可信峰和可重復(fù)色譜峰比例及標(biāo)準(zhǔn)品代謝物檢測數(shù)量比較

將XCMSonline默認(rèn)參數(shù)與IPO和centWaveSweep算法優(yōu)化后得到的參數(shù)代入centWave算法進行峰檢測，通過比較精確質(zhì)量數(shù)和保留時間（MTBLS1572資源頁面上的metadata數(shù)據(jù)），得到不同參數(shù)下可檢測到的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量。在默認(rèn)參數(shù)下沒有得到丁?；?L-肉堿（Butyryl-L-carnitine）和泛酸（Pantothenicacid）；經(jīng)IPO參數(shù)優(yōu)化后沒有得到精氨酸琥珀酸（Argininosuccinicacid）、泛酸（Pantothenicacid）和脫氧胞苷（Deoxycytidine）；centWaveSweep參數(shù)優(yōu)化后沒有得到乙酰-L-谷氨酸（Acetyl-L-glutamicacid）、精氨酸琥珀酸（Argininosuccinicacid）、脫氧胞苷（Deoxycytidine）和泛酸（Pantothenicacid）。采用推薦參數(shù)可以檢測到最多的化合物，而centWaveSweep算法得到的參數(shù)可檢測到的代謝物最少，這可能由于在代謝物濃度較低的情況下，其預(yù)過濾參數(shù)過高而導(dǎo)致低濃度代謝物由于峰強度小而直接被過濾。

如圖3A所示，在默認(rèn)參數(shù)下，代謝物標(biāo)準(zhǔn)品樣本可信色譜峰數(shù)量為1377，共得到10557個峰，可信色譜峰比例為13.0%；經(jīng)過IPO算法優(yōu)化參數(shù)后，可信色譜峰數(shù)量由1377提高到1481，而色譜峰總數(shù)由10557下降到9196，可信峰比例為16.1%；centWaveSweep算法由于預(yù)過濾參數(shù)過高而使得較多色譜峰被過濾，可信色譜峰數(shù)量為1349，色譜峰總數(shù)為8563，可信色譜峰比例為15.7%。在默認(rèn)參數(shù)下，尿液樣本共得到80208個色譜峰，可信色譜峰數(shù)量為17954，可信色譜峰比例為22.3%；經(jīng)過IPO算法優(yōu)化參數(shù)后，可信色譜峰數(shù)量由17954提高到18896，色譜峰總數(shù)由80208下降到77735，可信色譜峰比例為24.3%；centWaveSweep算法同樣由于預(yù)過濾參數(shù)過高而導(dǎo)致很多色譜峰被過濾，可信峰色譜數(shù)量為5053，色譜峰總數(shù)為15263，可信峰比例為33.1%。

如圖3B所示，在默認(rèn)參數(shù)下，代謝物標(biāo)準(zhǔn)品樣本的可重復(fù)色譜峰比例為86.9%；經(jīng)過IPO算法優(yōu)化參數(shù)后，可重復(fù)色譜峰比例提升為90.9%；經(jīng)過centWaveSweep算法優(yōu)化參數(shù)后，可重復(fù)色譜峰比例提升到91.7%。在默認(rèn)參數(shù)下，尿液樣本可重復(fù)色譜峰比例為63.5%；經(jīng)過IPO算法優(yōu)化參數(shù)后，可重復(fù)色譜峰比例略微提升，為64.8%；經(jīng)過centWaveSweep算法優(yōu)化后，可重復(fù)色譜峰比例大幅提升至78.0%。

總體而言，經(jīng)過IPO和centWaveSweep算法優(yōu)化后的參數(shù)，可信色譜峰比例和可重復(fù)色譜峰比例這兩個常規(guī)評價指標(biāo)比默認(rèn)參數(shù)均有不同程度的提升。值得注意的是，在經(jīng)過centWaveSweep算法優(yōu)化后，所得到的峰檢測參數(shù)雖然使得可信色譜峰的比例高于默認(rèn)參數(shù)（尤其是在特定情況下，例如在尿液樣本中該比例顯著增加），但相較之下，保留的特征峰和檢測出的化合物種類數(shù)量反而減少，這可能與算法采用峰面積相對于標(biāo)準(zhǔn)偏差進行參數(shù)優(yōu)化的方法有關(guān)。

2.4基于3種評價指標(biāo)評價參數(shù)優(yōu)化算法的局限性

IPO和centWaveSweep兩種優(yōu)化算法的基本原理均是采用不同的實驗設(shè)計（Designofexperiments，DoE），根據(jù)某一指標(biāo)對centWave算法的參數(shù)進行優(yōu)化。其中，IPO采用Box-Behnken實驗設(shè)計，隨著需要調(diào)節(jié)的參數(shù)增多，算法運行時間呈指數(shù)級增加，該算法基于同位素離子數(shù)量進行優(yōu)化，可能會引入過多的噪聲峰；centWaveSweep采用簡單的孤立因子設(shè)計，實驗次數(shù)顯著減少，但當(dāng)各參數(shù)交互影響較大時，可能得不到最好的參數(shù)組合。此外，centWaveSweep算法根據(jù)峰面積的RSD進行優(yōu)化，將會導(dǎo)致預(yù)過濾參數(shù)明顯提高，可能會過濾掉某些低濃度但有顯著改變的代謝物。

經(jīng)過IPO和centWaveSweep算法優(yōu)化后的參數(shù)，在代謝物標(biāo)準(zhǔn)品樣本和尿液樣本中，可信色譜峰比例和可重復(fù)色譜峰比例比默認(rèn)參數(shù)均有不同幅度提升。然而，這兩種優(yōu)化算法與默認(rèn)參數(shù)相比，其優(yōu)良峰形色譜峰比例在不同類型樣本中并無明顯差異。此外，不論是優(yōu)化后參數(shù)，還是默認(rèn)參數(shù)，其比例都相對較低（lt;60%）。由算法的基本原理可知，優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)并不包括色譜峰峰形，所以優(yōu)良峰形色譜峰比例與默認(rèn)參數(shù)相比并無明顯差異。

在代謝組學(xué)實際應(yīng)用過程中，非優(yōu)良峰形色譜峰由于峰形較差（如多重峰和不完整峰等），不適合繼續(xù)作為潛在生物標(biāo)志物繼續(xù)進行分析。兩種參數(shù)優(yōu)化算法均產(chǎn)生了大量非優(yōu)良峰形色譜峰（優(yōu)良峰形色譜峰比例均低于60%），這樣可能會導(dǎo)致下游的分析會降低檢驗效能，或由于潛在特征峰無法準(zhǔn)確積分而產(chǎn)生假陽性結(jié)果[18]。

3結(jié)論

本研究比較了IPO和centWaveSweep兩種峰檢測優(yōu)化算法對centWave參數(shù)優(yōu)化的效果。結(jié)果表明，兩種優(yōu)化算法在可信色譜峰比例和可重復(fù)色譜峰比例方面均比XCMSOnline默認(rèn)參數(shù)取得了更好的優(yōu)化結(jié)果。通過建立區(qū)分峰形優(yōu)劣的機器學(xué)習(xí)模型，發(fā)現(xiàn)兩種算法得到的優(yōu)化后參數(shù)與默認(rèn)參數(shù)相比，優(yōu)良峰形色譜峰比例并無明顯差異，并且優(yōu)良峰形色譜峰比例較低。過多的不良峰形色譜峰可能會降低下游統(tǒng)計分析的檢驗效能，或由于潛在特征峰無法準(zhǔn)確積分而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。本研究結(jié)果提示在現(xiàn)有參數(shù)優(yōu)化算法改進或新的算法開發(fā)過程中，可能需要將峰形優(yōu)劣作為評價指標(biāo)，并且在代謝組學(xué)具體實踐過程中需要對得到的潛在生物標(biāo)志物進一步確認(rèn)。