關鍵詞獸藥；雞蛋；氧化石墨烯；三聚氰胺海綿；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

雞蛋中蛋白質(zhì)含量高，能夠提供人體所必須的氨基酸。自1985年以來，我國的雞蛋產(chǎn)量一直保持世界領先地位[1]。在蛋禽飼養(yǎng)過程中，獸藥具有預防和治療疾病以及促進生長的作用，然而，不法商家和養(yǎng)殖戶為追求高經(jīng)濟效益，不遵循休藥期以及使用規(guī)定，導致獸藥殘留現(xiàn)象較為普遍[2-3]。由于獸藥理化性質(zhì)相對穩(wěn)定，可通過食物鏈進入人體，長期攝入獸藥殘留超標的食物可引起過敏反應和消化系統(tǒng)功能紊亂等疾病[4-5]，對人體健康造成威脅。為確保食品安全，降低對人類健康的危害，我國以及包括歐盟在內(nèi)的許多國家及組織對雞蛋中獸藥的最大殘留限量作出了明確規(guī)定[6-8]。

獸藥殘留檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫分析（ELISA）[9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（HPLC-MS）[10-11]、毛細管電泳（CE）[12-13]、微生物分析（MAT）[14-15]、放射性免疫分析（RIA）[16]和膠體金檢測技術（CGT）[17]等。其中，HPLC-MS能夠同時對多種獸藥進行檢測分析，已逐漸發(fā)展成為獸藥多殘留分析的主流技術。由于雞蛋基質(zhì)組成復雜，采用HPLC-MS分析獸藥殘留時易受到基質(zhì)干擾，因此需要進行必要的樣品前處理。目前，獸藥的樣品前處理技術主要有液液萃?。↙LE）[18-19]、固相萃?。⊿PE）[20]、QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）[21-22]和固相微萃?。⊿PME）[23]等。其中，QuEChERS技術具有簡單、可靠和高效的特點，在凈化過程中應用不同的基質(zhì)吸附劑，可以有效去除提取液中的干擾基質(zhì)，然而QuEChERS法中常采用的微納米型基質(zhì)吸附劑尺寸小，其基質(zhì)分離過程主要通過長時間高速離心實現(xiàn)，不利于快速分析。隨著基于磁納米顆粒的基質(zhì)凈化劑[24-25]相繼被開發(fā)，通過強磁場輔助分離技術，可在數(shù)秒內(nèi)實現(xiàn)對復雜基質(zhì)的快速分離。然而，磁納米吸附劑存在的尺寸不均、顆粒團聚和分散性差等問題仍是需首要考慮的問題[26-28]。

氧化石墨烯（GO）主要由單層sp2雜化碳原子排列而成，呈蜂窩狀，表面含有豐富的環(huán)氧基、羧基、羥基和芳烷基等功能吸附位點，具有優(yōu)異的凈化效果[29-30]。然而，GO片層之間相互堆疊導致其分散穩(wěn)定性不足，因此，改善分散性是拓展其應用范圍的重要方法。三聚氰胺海綿（MeS）具有彈性高、密度低和孔隙率高等特點。本研究通過水熱合成法將GO加載到MeS表面，改善了GO的分散穩(wěn)定性，通過簡單的浸潤與擠壓即可在數(shù)秒內(nèi)快速實現(xiàn)對基質(zhì)的凈化與分離，無需離心和磁回收等過程。基于此建立了一種基于還原氧化石墨烯改性三聚氰胺海綿（r-GO@MeS）的改良QuEChERS方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術用于同時快速測定雞蛋中32種獸藥殘留。本方法經(jīng)濟高效、方便快捷、適用性好，能夠滿足獸藥殘留的測定要求，可為雞蛋的質(zhì)量安全監(jiān)督提供技術支撐，同時也為開發(fā)簡便高效的樣品前處理方法提供了新思路。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

Agilent1290InfinityⅡUPLC超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；ABSCIEXQTRAP5500質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司）；Vortex-Genie2多功能旋渦混合器（美國ScientificIndustries公司）；3K15高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；ME204分析天平（瑞士MettlerToledo公司）。

32種獸藥標準品（純度98%）均購于上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇和乙腈（HPLC級，美國ThermoFisherScientific公司）；甲酸和乙酸銨（LC-MS級，上海安譜實驗科技股份有限公司）；Na2EDTA（HPLC級，上海安譜實驗科技股份有限公司）；NaCl和無水Na2SO4（分析純，阿拉丁試劑上海有限公司）；抗壞血酸（AA，分析純，上海麥克林生化科技有限公司）。GO（純度98%，蘇州碳豐石墨烯科技有限公司）；MeS（濮陽市覓潔泡綿有限公司）；0.22μm有機微孔濾膜（天津津騰實驗設備有限公司）。實驗用水為超純水（18.2MΩ·cm，美國Millipore公司超純水系統(tǒng)制備）。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液的配制

準確稱取32種獸藥的標準品，用甲醇配制成1mg/mL的單標溶液。分別移取適量的各藥物單標溶液于10mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成5μg/mL的混合標準儲備溶液，于–20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

移取1mL標準儲備溶液于5mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成1μg/mL的混合標準中間液。按比例用甲醇逐級稀釋混合標準中間液，配制成系列待測混合標準工作液。

1.2.2改性海綿的制備

根據(jù)文獻[31]的水熱合成法制備r-GO@MeS。準確稱取50mgAA和50mgGO，在磁力攪拌下加入到100mL超純水中，超聲10min使其充分混合。將MeS裁剪為底部直徑和高度分別為8和4mm的微型圓柱（～201mm3），浸入到上述分散液中，通過反復擠壓海綿排除其內(nèi)部氣泡。將分散液與海綿放入玻璃瓶中密封，置于烘箱中，在95℃下水熱反應3h后，冷卻至室溫，以超純水和乙醇洗滌，在40℃烘箱中干燥24h，得到r-GO@MeS。

1.2.3樣品制備與前處理

72份雞蛋樣品購自國內(nèi)8個城市的超市，去蛋殼后采用高速均質(zhì)機混勻，于?20℃保存?zhèn)溆?。雞蛋樣品中獸藥殘留提取與凈化采用文獻[32]的方法并略作修改：精確稱取5.0g均質(zhì)雞蛋于50mL聚乙烯離心管中，分別加入5mL0.1mmol/LNa2EDTA和20mL含1%乙酸的乙腈，渦旋1min后，分別加入4.0g無水Na2SO4和1.0gNaCl，繼續(xù)渦旋1min，在4℃以8000r/min離心5min，取上清液備用。

吸取1mL上清液至預裝有30個底部直徑和高度分別為8和4mm的r-GO@MeS（6.0cm3/mL）的2mL針型過濾器中，反復“抽拉-擠壓”凈化5次后，濾液過0.22μmPTFE濾膜，進行UPLC-MS/MS分析。

1.2.4儀器分析條件

色譜條件：AgilentEclipsePlusC18RRHD色譜柱（100mm×2.1mm，1.8μm）；流動相A為含有5mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸和2%甲醇的水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫（0～2min，0%B；2～10min，0%～45%B；10～15min，45%～98%B；15～17min，98%B；17～17.1min，98%～0%B；17.1～20.1min，0%B）；流速為0.3mL/min；進樣體積為2μL；柱溫為45℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，選擇正離子模式（ESI+），霧化氣流速為3L/min，干燥氣流速為10L/min，加熱氣流速為10L/min，加熱氣溫度500℃，掃描模式為多反應檢測（MRM）。

2結(jié)果與討論

2.1UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

在進行液相色譜分離時，流動相組成會對目標化合物的分離效果和色譜峰形有明顯影響。本研究采用梯度洗脫程序，分別使用水和甲醇作為色譜流動相進行分離，發(fā)現(xiàn)添加少量甲酸（0.1%）可以防止部分化合物的色譜峰分叉或拖尾，達到改善峰形和穩(wěn)定保留時間的目的；此外，在流動相中添加適量乙酸銨（5mmol/L）能夠增強部分目標物的離子化效率。本研究最終選擇含5mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸與2%甲醇的水溶液和甲醇分別作為流動相進行梯度洗脫。

根據(jù)歐盟委員會第2002/657/EC號決議[33]，陽性樣品的確認至少需要2對MRM離子對。分別將32種獸藥標準溶液依次注入質(zhì)譜儀中進行檢測，獲得化合物相應的母離子；在MS/MS模式下使母離子裂解，選擇2個強度高的子離子，其中強度最高的子離子用于定量分析，另一個用于定性分析，通過優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）等參數(shù)得到32種獸藥最優(yōu)的質(zhì)譜分析條件（見電子版文后支持信息表S1）。

2.2r-GO@MeS的表征

MeS是由三聚氰胺、甲醛和硫磺酸鈉共聚而成的多孔高分子材料，具有成本低、孔隙率和比面積大、機械穩(wěn)定性好等優(yōu)點。通過改變GO分散液濃度（0.25、0.50和1.00mg/mL），采用水熱還原法[31]制備了3種改性海綿r-GO@MeS-0.25%、r-GO@MeS-0.50%和r-GO@MeS-1.00%。采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察MeS改性前后的微觀形貌（圖1），改性前MeS骨架表面平滑齊整（圖1A和1B）；改性后，r-GO@MeS-0.25%（圖1C和1D）、r-GO@MeS-0.50%（圖1E和1F）和r-GO@MeS-1.00%（圖1G和1H）均可以明顯地觀察到表面均勻覆蓋了GO片層。此外，當r-GO濃度為0.50和1.00mg/mL時，進一步增加其加載量，過剩的GO片層相互堆疊而形成較大的片層，覆蓋于海綿纖維骨架邊緣及微孔處（圖1E和1H）。此外，r-GO@MeS-0.25%整體呈淺灰色，r-GO@MeS-0.50%呈深灰色，r-GO@MeS-1.00%呈深黑色，這應與海綿表面的GO加載量相關，與掃描電鏡觀察結(jié)果一致。將上述3種改性海綿分別置于水、甲醇和乙腈等常用提取溶劑中反復擠壓后，彈性良好，并未有明顯的GO脫落現(xiàn)象。此結(jié)果表明，所制備的r-GO@MeS性質(zhì)穩(wěn)定、彈性良好，可作為一種新型彈性凈化材料用于萃取液中復雜基質(zhì)的快速吸附。

2.3GO濃度的選擇

通過基質(zhì)加標實驗，在同等條件下考察r-GO@MeS-0.25%、r-GO@MeS-0.50%和r-GO@MeS-1.00%對目標獸藥回收率的影響。如圖2所示，3種r-GO@MeS基質(zhì)凈化效果良好，大部分獸藥的回收率均在80%～110%范圍內(nèi)。其中，采用r-GO@MeS-0.25%作為基質(zhì)吸附劑時，恩諾沙星（ENR）、氨苯砜（DAP）、琥珀?；前粪邕颍⊿ST）和磺胺甲噁唑（SMZ）的回收率分別為79.2%、110.6%、112.6%和113.1%；采用r-GO@MeS-0.50%作為基質(zhì)吸附劑時，奧比沙星（ORB）和SMZ的回收率為78.1%和111.7%；采用r-GO@MeS-1.00%作為基質(zhì)吸附劑時，磺胺甲基嘧啶（SM1）和ORB、噁喹酸（OXA）和SST的回收率分別為66.4%、70.7%、114.2%和121.1%?？傮w而言，當采用r-GO@MeS-0.50%作為基質(zhì)吸附劑時，回收率為80%～110%的獸藥數(shù)量相對較多。因此，后續(xù)研究選用r-GO@MeS-0.50%作為基質(zhì)凈化劑。

2.4MeS用量的優(yōu)化

凈化海綿的基質(zhì)吸附能力與海綿用量密切相關。理論上，增加海綿用量能夠增加r-GO@MeS的吸附位點，提升其基質(zhì)凈化能力。以1mL待凈化提取液為研究對象，分別采用6、18、30和42個海綿凈化上述溶液，即料液比分別為1.2、3.6、6.0和8.4cm3/mL，比較了r-GO@MeS海綿用量對獸藥回收率總體分布的影響，實驗結(jié)果如圖3所示?？傮w上，除磺胺氯吡嗪（SPZ）外，料液比對磺胺類獸藥回收率影響不大；而大部分喹諾酮類獸藥回收率隨著料液比增加而呈明顯下降趨勢。此外，當料液比為1.2和3.6cm3/mL時，回收率高于120%的獸藥分別有3種（SPZ，128.3%；ENR，133.1%；二氟沙星（DIF），122.1%）和2種（SPZ，128.9%；DIF，121.1%）；當料液比提高到8.4cm3/mL時，部分喹諾酮類獸藥ORB、萘啶酸（NA）、DIF、氟甲喹（FLU）和西諾沙星（CIN）的回收率顯著降低，特別是CIN的回收率降至70%以下；當料液比為6.0cm3/mL時，所監(jiān)測獸藥回收率（77.0%～118.1%）均處于可接受區(qū)間內(nèi)。因此，后續(xù)研究選用料液比為6.0cm3/mL。

2.5凈化模式的選擇

MeS具有良好的彈性和機械性能，能夠通過兩種方式實現(xiàn)提取液中干擾基質(zhì)的凈化：（1）通過靜置使干擾基質(zhì)以自由擴散形式到達吸附海綿表面的靜態(tài)凈化模式，其基質(zhì)凈化效果與靜置時間相關；（2）通過反復“浸潤-擠壓”以加速渦流擴散形式到達吸附海綿表面的動態(tài)凈化模式，其基質(zhì)凈化效果與擠壓次數(shù)相關。考察兩種凈化模式下不同靜置時間和擠壓次數(shù)對獸藥回收率的影響：（1）靜態(tài)模式（1、5和10min）；（2）動態(tài)模式（5、10和15次）。結(jié)果如圖4所示，可見隨靜置時間和擠壓次數(shù)增加，部分喹諾酮類藥物的回收率逐漸降低。例如，當靜置時間達到10min時，ENR的回收率降至40%以下；當擠壓次數(shù)為15次時，OXA的回收率降至60%以下。這可能與ENR和OXA等喹諾酮類獸藥分子中較大的共軛平面結(jié)構相關，延長靜置時間和增加擠壓次數(shù)均能夠增強其與改性海綿表面GO片層之間的吸附作用，從而導致其回收率降低。當靜置時間分別為1、5和10min時，所監(jiān)測獸藥回收率分別為45.8%～106.8%、47.5%～106.7%和32.2%～112.6%；當擠壓次數(shù)分別為5、10和15次時，所監(jiān)測獸藥回收率分別為72.5%～116.6%、65.8%～113.4%和57.2%～115.8%。

比較而言，動態(tài)擠壓5次和10次時所得回收率均處于可接受的范圍（60%～120%）內(nèi)，均能滿足獸藥多殘留的檢測要求。但是，動態(tài)擠壓5次時，回收率處于80%～120%的化合物數(shù)量更多且凈化速度更快。因此，后續(xù)研究選擇動態(tài)擠壓5次作為基質(zhì)凈化模式。

2.6方法驗證

2.6.1方法的基質(zhì)效應、線性范圍、檢出限及定量限

質(zhì)譜對目標物進行電噴霧離子化時離子信號強度易受到樣品溶液中共存基質(zhì)的干擾。為檢驗本方法的基質(zhì)效應（ME，%），分別構建了基質(zhì)匹配標準曲線和溶劑標準曲線，其相應基質(zhì)效應的計算公式為：其中，ka為基質(zhì)匹配標準曲線的斜率，kb為溶劑標準曲線的斜率。當ME在?20%～+20%范圍時，認為基質(zhì)效應不顯著；MEgt;+20%表示存在基質(zhì)增強效應；MElt;?20%表示存在基質(zhì)抑制效應。本研究中各獸藥的基質(zhì)效應均在?7.8%～+18.9%范圍內(nèi)，表明r-GO@MeS在雞蛋獸藥多殘留凈化過程中具有良好的基質(zhì)凈化效果。盡管如此，本研究仍采用基質(zhì)匹配曲線以獲得更準確的定量分析結(jié)果。

配制32種獸藥的基質(zhì)加標溶液，分別以目標藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。如表1所示，32種獸藥線性關系良好，線性范圍為5～200μg/kg，相關系數(shù)（R2）均大于0.999。分別根據(jù)信噪比（S/N）≥3和S/N≥10確定方法的檢出限（LODs）和定量限（LOQs），32種獸藥的檢出限為0.2～10.2μg/kg，定量限為0.6～28.0μg/kg，表明本方法具有良好的靈敏度。

2.6.2準確性及精密度

分別在3個加標水平（10、100和150μg/kg）下通過加標回收實驗考察方法的準確性?？紤]到部分獸藥定量限較高（≥10μg/kg），因此，磺胺二甲基異噁唑（SSX）、SPZ、磺胺苯吡唑（SPP）、SST、FLU和柱晶白霉素（KIT）的低濃度加標水平選為20μg/kg；磺胺胍（SGD）的低濃度加標水平選為30μg/kg，目標藥物在低加標濃度下對應譜圖見電子版文后支持信息圖S1。通過日內(nèi)重現(xiàn)實驗（重復6次）和日間重現(xiàn)實驗（連續(xù)3d，每天重復3次）考察方法的精密度，其中，日內(nèi)重現(xiàn)性實驗在低、中、高3個加標水平（10～150μg/kg）下進行，日間重現(xiàn)實驗在中等濃度加標水平（100μg/kg）下進行。所有獸藥的回收率均在66.5%～117.5%之間，日內(nèi)RSDlt;13.3%，日間RSDlt;16.3%，表明本方法具有良好的準確性和精密度（電子版文后支持信息表S2）。

2.6.3方法性能比較

與文獻報道的雞蛋中獸藥多殘留檢測方法相比（表2），本方法的基質(zhì)分離過程可在數(shù)秒內(nèi)通過快速的“浸潤-擠壓”過程便捷實現(xiàn)，無需離心、磁場輔助、上樣、淋洗、洗脫、氮吹和濃縮等復雜過程，縮短了樣品前處理時間，提升了操作便捷度，并且具有良好的回收率以及較低的基質(zhì)效應和定量限，結(jié)合UPLC-MS/MS技術可快速、準確、靈敏地對雞蛋中獸藥多殘留進行定性和定量分析。

2.7實際樣品分析

72份雞蛋樣品分別購自國內(nèi)8個城市，利用本方法進行檢測分析，共檢出陽性樣品4份，所檢出獸藥殘留分別為SD、SQZ、DIF和JOS。上述檢出藥物中，SD殘留濃度較高（15.4μg/kg），其余3種檢出獸藥殘留濃度較低，均在定量限以下。

3結(jié)論

建立了一種基于r-GO@MeS的改良QuEChERS方法，考察了GO加載量、料液比及凈化模式對獸藥回收率的影響，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術，實現(xiàn)了雞蛋中32種獸藥殘留的靈敏檢測。本方法基質(zhì)凈化過程方便、快捷，通過快速擠壓即可在數(shù)秒內(nèi)完成對干擾基質(zhì)的分離與凈化。本方法具有較低的基質(zhì)效應、良好的線性關系、較高的準確性和精密度以及較低的檢出限和定量限。r-GO@MeS用于基質(zhì)凈化不僅為動物源食品獸藥多殘留的快速檢測提供了新的分析策略，也為彈性多孔吸附材料在樣品前處理方面的應用奠定了研究基礎。