關(guān)鍵詞離子淌度質(zhì)譜；質(zhì)子互變異構(gòu)體；碰撞誘導(dǎo)解離；從頭算分子動(dòng)力學(xué)模擬

質(zhì)子互變異構(gòu)體廣泛存在于各類有機(jī)化學(xué)反應(yīng)和生物化學(xué)過(guò)程之中，這些結(jié)構(gòu)與化合物的構(gòu)象變化、酶引起的催化反應(yīng)過(guò)程、溶劑或添加劑對(duì)生物活性的影響等因素緊密相關(guān)。如尼古丁的成癮特性源于其質(zhì)子化形態(tài)與煙酰胺乙酰膽堿受體相互作用，光敏黃蛋白中的發(fā)色團(tuán)對(duì)應(yīng)于對(duì)香豆酸特定的脫質(zhì)子結(jié)構(gòu)[1-5]。認(rèn)識(shí)這些結(jié)構(gòu)可以為復(fù)雜生物活性結(jié)構(gòu)的鑒定以及相關(guān)藥物設(shè)計(jì)與應(yīng)用提供有價(jià)值的信息。然而，不同質(zhì)子互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu)的差別極小，并且易于相互轉(zhuǎn)化，解析這類異構(gòu)體結(jié)構(gòu)充滿挑戰(zhàn)。有研究表明，在質(zhì)譜電離產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰的過(guò)程中加氫（正模式）與減氫（負(fù)模式）的離子結(jié)構(gòu)可能會(huì)產(chǎn)生質(zhì)子互變異構(gòu)體[6-7]，為研究這類結(jié)構(gòu)提供了一種新的手段。有研究者通過(guò)紅外多光子解離技術(shù)得到離子的紅外光譜圖，再通過(guò)理論計(jì)算模擬不同質(zhì)子互變異構(gòu)體的理論紅外光譜圖研究質(zhì)子互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu)[8-9]。由于不同質(zhì)子互變異構(gòu)體離子表面電荷分布的差異會(huì)影響離子與淌度分離氣體的相互作用，有研究者采用離子淌度質(zhì)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)了質(zhì)子互變異構(gòu)體的直接分離和結(jié)構(gòu)分析[10-14]。然而，在通常情況下很難得到不同質(zhì)子互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)品，因此在分離的基礎(chǔ)上，如何確定不同質(zhì)子互變異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)仍然充滿挑戰(zhàn)。通過(guò)對(duì)比不同質(zhì)子互變異構(gòu)體的實(shí)驗(yàn)碰撞截面積（Collisionalcrosssections，CCS）與理論碰撞截面積是一種有效的手段[15-16]。離子淌度儀器CCS的實(shí)驗(yàn)測(cè)定需要精確的校準(zhǔn)過(guò)程[17]，而通過(guò)量子化學(xué)計(jì)算得到理論CCS的過(guò)程又相當(dāng)復(fù)雜[18]，導(dǎo)致質(zhì)子互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu)定性困難。在有機(jī)質(zhì)譜分析過(guò)程中，碎片離子通常提供了解析化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵信息。碰撞誘導(dǎo)解離（Collision-induceddissociation，CID）技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各類商品化的質(zhì)譜儀器中，特征的碎片離子結(jié)構(gòu)在不同的儀器條件下通常具有一致性。研究表明，質(zhì)子互變異構(gòu)體之間由于電荷位點(diǎn)不同特別是質(zhì)子化/去質(zhì)子化位置的差異可能會(huì)導(dǎo)致離子的CID譜圖具有明顯差異[10，19-21]，在解析這些碎裂路徑和碎片離子結(jié)構(gòu)時(shí)通常需要依賴研究者的經(jīng)驗(yàn)與直覺(jué)，這使得通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜解析質(zhì)子互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu)仍然存在很多困難。

2013年，德國(guó)波恩大學(xué)的Grimme[22]基于從頭算動(dòng)力學(xué)方法建立了不依賴于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)而是純粹基于物理原理的量子化學(xué)方法QCEIMS（Quantumchemicalelectronimpactmassspectrometryprogram）預(yù)測(cè)化合物的電子轟擊電離源（Electronimpactionization，EI）質(zhì)譜圖。該方法已被用于測(cè)試各類有機(jī)和無(wú)機(jī)化合物，一些經(jīng)典的重排反應(yīng)（如麥?zhǔn)现嘏胚^(guò)程）也能被準(zhǔn)確預(yù)測(cè)[23–25]，采用該方法也可有效預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中缺少的三甲基硅烷衍生化代謝物的EI譜圖[26]。在QCEIMS工作的基礎(chǔ)上，Koopman等[27]在2020年推出了可預(yù)測(cè)離子CID譜圖的QCXMS（Quantumchemicalmassspectrometryprogram）軟件，該軟件已被用于測(cè)試分子的加氫峰、減氫峰以及多電荷離子[28]。Schnegotzki等[29]比較了一些藥物分子的實(shí)驗(yàn)CID譜圖與QCXMS得到的理論CID譜圖。結(jié)果表明，QCXMS能夠完整闡明復(fù)雜藥物分子的全部碎裂路徑，獲得碎片離子、碎裂路徑中的中間體乃至中性丟失碎片的結(jié)構(gòu);此外，還能夠揭示一些低豐度解離過(guò)程的碎裂路徑。在QCXMS的模擬研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同的質(zhì)子化/脫質(zhì)子化位置會(huì)顯著影響分子的碎裂路徑，實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜圖中的碎片離子可能是由多種質(zhì)子化異構(gòu)體離子產(chǎn)生。

本研究采用離子淌度質(zhì)譜結(jié)合從頭算分子動(dòng)力學(xué)模擬QCXMS的方法解析質(zhì)子互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu)，整個(gè)流程如圖1所示。通過(guò)離子淌度譜分離質(zhì)子互變異構(gòu)體，再通過(guò)CID得到不同質(zhì)子互變異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)譜圖；同時(shí)，基于QCXMS得到不同質(zhì)子互變異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜模擬譜圖。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)譜圖和理論譜圖解析質(zhì)子互變異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)，并考察不同異構(gòu)體之間的碎裂路徑差異。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

BrukertimsTOF捕集離子淌度飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Bruker公司），配有電噴霧電離源（Electrosprayionization，ESI）和DataAnalysis5.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；碰撞誘導(dǎo)解離譜圖計(jì)算軟件QCxMSv5.2.1（Grimme研究組）。甲醇（色譜純，美國(guó)ThermoFisher公司）；丁香酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技有限公司）；ESI低濃度調(diào)諧液Tunemix（美國(guó)安捷倫公司）。

1.2樣品制備

稱取丁香酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg（精確至0.1mg），用甲醇溶解并定容，配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再用90%甲醇溶液逐級(jí)稀釋至適宜濃度，取1mL待分析。

1.3質(zhì)譜條件

ESI源，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓3500V；霧化器氣體壓力30kPa；反吹氣流速3.0L/min；反吹氣溫度200℃；進(jìn)樣速度為5μL/min。TIMS條件設(shè)置：1/K0范圍0.1～0.8V?s/cm2；斜坡分離時(shí)間（Ramptime）為100ms；累積時(shí)間（Accumulationtime）為20ms；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z50～500；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z50～300，碰撞誘導(dǎo)解離能量10～30eV。

1.4從頭算動(dòng)力學(xué)CID譜圖的模擬計(jì)算

通過(guò)Avogadro軟件進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)建模，再通過(guò)CREST軟件[30]確定分子內(nèi)不同的質(zhì)子互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu)。通過(guò)QCXMSv5.2.1對(duì)得到的結(jié)構(gòu)模擬產(chǎn)生CID譜圖。QCXMS基于以下流程進(jìn)行CID過(guò)程模擬：首先通過(guò)一段600K以下15ps的分子動(dòng)力學(xué)模擬得到不同構(gòu)象的初始結(jié)構(gòu)；初始結(jié)構(gòu)通過(guò)設(shè)置初始速度接近惰性氣體，發(fā)生碰撞后獲得相應(yīng)能量，再通過(guò)一段平均自由程分子動(dòng)力學(xué)模擬產(chǎn)生相應(yīng)的碎片；對(duì)不同的初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行并行計(jì)算；在完成所有的計(jì)算任務(wù)后，通過(guò)電荷分配（Chargeassignment）算法將所有任務(wù)中的帶電碎片結(jié)構(gòu)集合在一張理論CID譜圖中。QCXMS軟件中參數(shù)選擇：CID模式；采用xtb6.4.1中的GFN2-xTB[31]方法計(jì)算力和能量；最大的分子動(dòng)力學(xué)時(shí)間（MaximumMDtime-sampling）設(shè)置為10ps；參考此前的相關(guān)研究并考慮計(jì)算耗時(shí)，其他參數(shù)均為軟件默認(rèn)參數(shù)。采用自寫的Python程序繪制理論譜圖，并與實(shí)驗(yàn)譜圖對(duì)比。QCXMS計(jì)算得到的每條軌跡均可通過(guò)Avogadro軟件可視化。

2結(jié)果與討論

2.1質(zhì)子互變異構(gòu)體的離子淌度分離與二級(jí)質(zhì)譜分析

香草酸分子具有兩個(gè)可能的脫質(zhì)子位點(diǎn)，即羧基與其對(duì)位上的羥基。香草酸廣泛存在于各類蔬菜水果中，被認(rèn)為具有特殊的抗氧化活性，因此研究其質(zhì)子互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu)尤為重要。這類結(jié)構(gòu)在以質(zhì)子活性溶劑（如甲醇）作為ESI溶液時(shí)，會(huì)產(chǎn)生兩種不同的脫質(zhì)子結(jié)構(gòu)，形成一對(duì)互變異構(gòu)體，即羥基位脫質(zhì)子離子（酚氧離子）與羧基位脫質(zhì)子結(jié)構(gòu)（羧酸離子）。如圖2所示，在香草酸溶于甲醇溶液后，經(jīng)過(guò)ESI電離后的香草酸在捕集離子淌度譜分離過(guò)程中可得到A與B兩個(gè)峰，這兩個(gè)峰被認(rèn)為分別對(duì)應(yīng)香草酸在羥基和羧基位點(diǎn)的脫質(zhì)子結(jié)構(gòu)。兩個(gè)峰對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖呈現(xiàn)明顯差異，主要表現(xiàn)為m/z152.0088[M–CH3]?與m/z123.0427[M–CO2]?的豐度差異。

2.2互變異構(gòu)體的QCXMS模擬結(jié)果及實(shí)驗(yàn)對(duì)比

為了判斷這兩個(gè)淌度峰分別對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)，通過(guò)QCXMS分別獲取兩種離子結(jié)構(gòu)的二級(jí)質(zhì)譜模擬譜圖。圖3為不同異構(gòu)體實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖的對(duì)比結(jié)果。圖3A的結(jié)果表明，酚氧離子模擬二級(jí)質(zhì)譜的譜圖與A峰對(duì)應(yīng)的結(jié)果較一致，其中最重要的是作為主要碎片離子的m/z152.0088[M–CH3]?在豐度上也得到了較好體現(xiàn)。羧酸離子的模擬二級(jí)質(zhì)譜譜圖與B峰對(duì)應(yīng)的結(jié)果差異較小，在圖3B中，B峰對(duì)應(yīng)的主要碎片離子m/z123.0427[M–CO2]?和m/z108.0195[M–CO2–CH3]?均得到有效重現(xiàn)，這兩個(gè)關(guān)鍵碎片離子對(duì)應(yīng)的豐度也與實(shí)驗(yàn)結(jié)果較一致。同時(shí)，在羧酸離子的模擬譜圖中也出現(xiàn)了豐度較低的m/z152.0088[M–CH3]?離子。在類似香草酸結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究[11]中，羥基位脫質(zhì)子的酚氧離子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的CCS遠(yuǎn)小于羧基位脫質(zhì)子產(chǎn)生的羧酸離子結(jié)構(gòu)，由于1/K0與CCS成正比，因而從CCS的角度也可以證明A峰對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)為酚氧離子，B峰對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)為羧酸離子。

2.3互變異構(gòu)體碎片結(jié)構(gòu)的差異及其原因

推測(cè)化合物在CID過(guò)程中產(chǎn)生的碎裂路徑以及碎片離子結(jié)構(gòu)是一個(gè)極復(fù)雜的過(guò)程，CID過(guò)程施加的能量可使共價(jià)鍵斷裂，同時(shí)還可能導(dǎo)致質(zhì)子在分子的不同原子之間流動(dòng)，即質(zhì)子的流動(dòng)模型。更復(fù)雜的是分子可能發(fā)生重排反應(yīng)，如碳骨架成環(huán)或開環(huán)[32-34]。推測(cè)化合物的碎片離子結(jié)構(gòu)通常需要研究者具有豐富的經(jīng)驗(yàn)。QCXMS軟件能夠保留模擬CID過(guò)程中離子的每條碎裂軌跡，實(shí)現(xiàn)碎裂過(guò)程的可視化，同時(shí)得到對(duì)應(yīng)的碎片結(jié)構(gòu)，因此可以進(jìn)一步研究互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的二級(jí)譜圖差異。圖4為QCXMS中得到的不同脫質(zhì)子結(jié)構(gòu)脫羧過(guò)程以及對(duì)m/z91.0172碎片離子結(jié)構(gòu)的推測(cè)，香草酸脫質(zhì)子離子的碎裂路徑主要有兩條：甲氧基均裂產(chǎn)生m/z152.0088[M–CH3]?離子以及脫羧產(chǎn)生m/z123.0427[M–CO2]?離子。兩種互變異構(gòu)體CID譜圖的豐度差異可能來(lái)自不同結(jié)構(gòu)，從而影響了兩條碎裂路徑之間的競(jìng)爭(zhēng)。圖4A展示了兩類脫質(zhì)子結(jié)構(gòu)的不同脫羧過(guò)程。酚氧離子結(jié)構(gòu)由于存在羧基位的氫原子，在脫羧過(guò)程中需要有一個(gè)羧基官能團(tuán)旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)生氫處于羧基氧與碳原子之間的過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)，這使得脫羧過(guò)程需要更高的能量，并導(dǎo)致酚氧離子的兩條碎裂路徑中甲氧基均裂路徑更容易發(fā)生，從而導(dǎo)致m/z152.0088[M–CH3]?離子的豐度更高。羧酸離子結(jié)構(gòu)可直接實(shí)現(xiàn)脫羧，其脫羧路徑能量低于酚氧離子的脫羧路徑能量，與甲氧基均裂路徑能量接近。這導(dǎo)致羧酸離子脫羧和甲氧基均裂同時(shí)發(fā)生，即m/z123.0427[M–CO2]?和108.0195[M–CO2–CH3]?離子是羧基位脫質(zhì)子結(jié)構(gòu)基峰碎片離子的主要原因。

在實(shí)驗(yàn)譜圖中，m/z91.0172的碎片離子結(jié)構(gòu)也較明顯。特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中CID能量增大時(shí)，兩種脫質(zhì)子結(jié)構(gòu)的CID譜圖中都能得到m/z91.0172離子。相比其它碎片離子的結(jié)構(gòu)，基于經(jīng)驗(yàn)推測(cè)m/z91.0172離子的結(jié)構(gòu)較困難。在QCXMS兩種脫質(zhì)子化異構(gòu)體的碎裂過(guò)程中，QCXMS均得到了m/z91.0172的碎片離子。這些軌跡表明m/z91.0172碎片離子是一個(gè)固定的結(jié)構(gòu)。圖4B展示了其中一條碎裂軌跡，首先酚氧離子脫去羧基上的氫，再脫去CO2中性分子，產(chǎn)生羥基對(duì)位為自由基位點(diǎn)羥基帶負(fù)電的自由基陰離子；然后碳氧鍵均裂，產(chǎn)生分子式為C6H3O1（理論m/z91.0178）的碎片離子。高分辨質(zhì)譜得到的元素組成與QCXMS得到的碎片結(jié)構(gòu)一致，證明該分子結(jié)構(gòu)可能是圖4B中QCXMS得到的結(jié)果。m/z91.0172碎片獨(dú)特的電子結(jié)構(gòu)可通過(guò)后續(xù)更精確的計(jì)算化學(xué)方法進(jìn)行考察。

2.4模擬譜圖與實(shí)驗(yàn)譜圖的差異

值得注意的是，實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖還有一些不符合之處。首先，低質(zhì)量端的碎片離子在實(shí)驗(yàn)中無(wú)法出現(xiàn)，這可能是儀器參數(shù)設(shè)置的結(jié)果導(dǎo)致；另外，在模擬得到的譜圖中應(yīng)用的碰撞能量通常大于實(shí)際電壓，這主要是因?yàn)椴煌瑑x器之間碰撞誘導(dǎo)解離儀器部分的設(shè)置有所差異，這會(huì)影響碰撞時(shí)給予離子的能量，在QCXMS模擬過(guò)程中，采用的模擬條件特別是模擬的碰撞空間與實(shí)際的儀器條件會(huì)有所差異。

盡管實(shí)驗(yàn)?zāi)芰颗c理論能量存在差異，但是增大能量對(duì)于離子的碎裂行為的影響是一致的。圖5與圖6分別顯示了酚氧離子與羧酸離子在QCXMS設(shè)置不同能量條件下得到的模擬譜圖以及主要離子碎片豐度變化圖。由酚氧離子的實(shí)驗(yàn)CID譜圖（圖5B）可見(jiàn)，當(dāng)碰撞能量在15eV時(shí)左右時(shí)，母離子（m/z167.0320）的豐度與m/z152.0088[M–CH3]?離子的豐度出現(xiàn)交叉；當(dāng)碰撞能量達(dá)到25eV時(shí)，m/z108.0195[M–CO2–CH3]?離子豐度再超過(guò)m/z152.0088[M–CH3]?離子，而m/z123.0427[M–CO2]?離子豐度始終處于較低的水平。由羧酸離子的實(shí)驗(yàn)CID譜圖（圖6B）可見(jiàn)，當(dāng)碰撞能量為15eV時(shí)，母離子（m/z167.0320）的豐度與m/z123.0427[M–CO2]?離子豐度出現(xiàn)交叉；在20eV處，m/z108.0195[M–CO2–CH3]?離子豐度成為基峰，m/z152.0088[M–CH3]?離子豐度始終處于較低的水平。

利用QCXMS模擬不同能量下酚氧離子結(jié)構(gòu)離子豐度的變化，結(jié)果如圖5A所示。隨著模擬能量增加，m/z152.0088[M–CH3]?的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；在能量最高（50eV）的模擬譜圖中，m/z108.0195[M–CO2–CH3]?的強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)，這與圖5B的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。圖6A中羧酸離子結(jié)構(gòu)的模擬CID結(jié)果與圖6B的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，這主要體現(xiàn)在隨著實(shí)驗(yàn)?zāi)芰吭鰪?qiáng)，m/z123.0427[M–CO2]?離子豐度增加，當(dāng)模擬能量為35eV時(shí)，m/z108.0195[M–CO2–CH3]?成為基峰，這與實(shí)驗(yàn)中離子碎片豐度的變化一致。此外，QCXMS的模擬結(jié)果也很好地重現(xiàn)了m/z108.0195[M–CO2–CH3]?離子在不同結(jié)構(gòu)中何時(shí)成為基峰離子。在圖5A中，50eV時(shí)，m/z108.0195離子尚未成為基峰離子；在圖6A中，35eV能量已經(jīng)使得m/z108.0195離子成為基峰離子，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3結(jié)論

通過(guò)離子淌度質(zhì)譜分離質(zhì)子互變異構(gòu)體，得到每個(gè)異構(gòu)體對(duì)應(yīng)的CID譜圖；通過(guò)QCXMS方法模擬了不同脫質(zhì)子結(jié)構(gòu)的CID譜圖，實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)驗(yàn)中得到的不同結(jié)構(gòu)的確認(rèn)。采用QCXMS方法還可得到不同質(zhì)子互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu)的碎裂路徑，進(jìn)而分析出一些關(guān)鍵碎片離子的結(jié)構(gòu)，極大地降低了CID過(guò)程中推測(cè)碎裂路徑和碎裂離子結(jié)構(gòu)的難度。本方法應(yīng)用一種全新的手段揭示質(zhì)子互變異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了對(duì)異構(gòu)體產(chǎn)生不同碎裂路徑的理解，有助于對(duì)互變異構(gòu)體體系的認(rèn)識(shí)。本方法也可用于更復(fù)雜的實(shí)際體系的物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定，為關(guān)鍵化合物結(jié)構(gòu)定性分析提供了一種新的有效手段。