關鍵詞微流控；3D打??；復雜截面；慣性聚焦；二次流調控

生物微粒（如細胞和細菌等）操控在分析化學和生物醫(yī)學等領域有重要的研究價值，在單細胞質譜分析和腫瘤檢測等方面具有重要的應用前景[1-2]。作為一種高效的微粒操控手段，基于微流控芯片的微粒操控技術已經成為研究的熱點，包括基于電、磁、聲和光等物理場的主動式操控技術（如介電泳[3]、磁泳[4]、聲鑷[5]和光鑷[6]等）、基于微流道特殊結構的被動式操控技術（如確定性側向位移[7]、微阻隔過濾[8]和慣性操控[9]等）以及主動與被動糅合的操控技術[10]。主動式技術對微粒具有較好的可控性和控制精度，但樣品處理通量較低且操作過程較復雜。被動式技術的操控通量和精度較高且無需外場，因此具有更好的集成優(yōu)勢。其中，慣性操控技術利用流體慣性效應使微粒受慣性力遷移實現(xiàn)精確操控，具有高通量和操作便捷等優(yōu)勢，在處理大體積樣品中的生物微粒時具有明顯優(yōu)勢[11]。

慣性微流控技術最早由DiCarlo等[12]于2007年提出，經過十多年的發(fā)展已開發(fā)出多種流道結構的慣性微流控芯片。在各類慣性流道中，矩形截面流道結構簡單、制作方便，研究最為廣泛。微粒在矩形截面直流道中受到流道壁面和流體剪切梯度共同誘導的慣性升力作用，聚焦在流道長邊附近的中心線上[13]。將直流道改為彎流道，流道會產生二次流，粒子受慣性升力的同時還受二次流曳力影響，據(jù)此可以調整粒子的聚焦平衡位置[14]。除矩形截面流道外，一些學者研究了異形截面流道中粒子的慣性聚焦效應，如梯形[15]、半橢圓形[16]、半圓形[17]和三角形[18]等。其中，梯形截面彎流道可產生偏置二次流，使粒子受增強的二次流曳力作用實現(xiàn)精確分離[19]。目前，矩形和梯形流道已廣泛應用于各類生物細胞操控，例如從血液中分離癌細胞[20]、白細胞[21]和血漿[22]等。除上述流道外，Rafeie等[23]報道了組合形截面的慣性流道，通過將兩種及以上不同截面結構的慣性流道組合為更復雜的流道，可綜合利用各獨立截面流道對微粒的慣性聚焦效果，使微粒聚焦位置更加多樣化。然而，組合形流道結構非常復雜，目前報道的方法僅能通過超精密微銑加工的方式制作該類流道，而微銑加工對機床精度和穩(wěn)定性要求極高，加工成本高昂；此外，由于組合形流道鮮有報道，因此微粒在該類流道中的慣性聚焦機理仍需深入研究。

本研究采用面投影光固化三維（3D）打印的加工方法，通過結合常規(guī)的聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒模復刻技術，可制備高精度的組合形截面微流道。基于上述加工方法，研制了三階梯和五階梯截面螺旋流道慣性微流控芯片，并研究了不同尺寸粒子在階梯形流道中的運動過程及聚焦行為，解析了粒子的慣性聚焦遷移機理。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

XFP01-BD注射泵（蘇州訊飛科學儀器有限公司）；XDS-3倒置熒光顯微鏡（上海光學儀器一廠）；StingrayF-033B/C高速CCD相機（德國AlliedVisionTechnologies公司）；PDC-MG等離子清洗機（成都銘恒科技發(fā)展有限公司）；nanoArch?S140微納3D打印系統(tǒng)（深圳摩方新材料科技有限公司）；ADSM301電子顯微鏡（深圳安東星科技有限公司）。

PDMS（美國道康寧公司）；聚苯乙烯熒光微球（直徑6μm和10μm，天津市倍思樂色譜技術開發(fā)中心），用于模擬生物細胞（如紅細胞和白細胞）；Tween20、無水乙醇和異丙醇（美國Sigma-Aldrich公司）；HTL耐高溫樹脂（深圳摩方新材料科技有限公司）。實驗用水為去離子水。

1.2實驗方法

1.2.1階梯形截面流道結構設計

兩種階梯形截面慣性流道的主體結構均為螺旋線形（圖1A），具有1個入口和2個出口。兩種流道的主要區(qū)別在于截面尺寸不同，如圖1B和1C所示，流道截面均為階梯形，但階梯數(shù)量不同，分別為3個和5個階梯。兩種流道的內壁高度均小于外壁高度，流道詳細尺寸參數(shù)分別見表1和表2。設計流道尺寸參數(shù)時，主要依據(jù)微粒慣性聚焦要求、慣性升力和迪恩曳力相關計算公式，對螺旋流道的起始內圈半徑、流道總寬度、流道內圈和外圈高度、階梯寬度和高度、流道圈數(shù)以及流道間隔等參數(shù)進行設計。此外，流道結構的復雜程度和流道加工的可行性也需要綜合考慮。

1.2.2微流控芯片制備工藝

微流控芯片制備工藝流程如圖2所示，主要包括流道結構設計、流道陽模制作、模具表面處理和PDMS倒模鍵合4個關鍵步驟。首先，在SoildWorks軟件中創(chuàng)建流道3D結構模型，將其輸出為STL格式文件。接著，將STL文件導入3D打印機，對模型進行添加支撐和切片操作，利用紫外光使液態(tài)HTL樹脂固化。為實現(xiàn)流道的高精度和快速打印成型，對模型正常層設置10μm切片厚度和1s曝光時間，對底層設置50μm切片厚度和2s曝光時間。對固化成形的流道陽模進行表面處理，采用異丙醇充分清洗陽模。為確保消除模具表面未固化的材料，將模具放入無水乙醇中浸泡2h。為提升模具的脫模性能，將模具放入氧等離子清洗機中輝光照射2min。最后，采用PDMS倒模復刻技術制備微流控芯片，主要包括PDMS澆鑄、脫氣、固化、脫模、切割、打孔和鍵合等步驟，鍵合后得到完備的PDMS芯片。

1.2.3微粒慣性操控實驗平臺搭建

為研究階梯形流道中粒子慣性聚焦行為，搭建了粒子慣性操控與運動觀測實驗平臺。首先，將微流控芯片入口用特氟龍管與裝有聚苯乙烯微球懸浮液的30mL注射器相連接，并將注射器裝載于精密注射泵上，芯片出口與離心管連接。將微流控芯片固定于倒置的熒光顯微鏡工作臺上，利用高速CCD、熒光發(fā)射模塊和10×物鏡拍攝流道出口附近直流道處粒子的運動軌跡。相機控制軟件VimbaViewer設置曝光時間為500ms或更高，拍攝100張圖像。最后，將圖像序列在ImageJ軟件中進行疊加處理和分析。為定量表征粒子的聚焦效果，利用ImageJ軟件獲取沿流道寬度方向上的熒光強度數(shù)值，并繪制粒子的歸一化熒光強度曲線。

1.2.4階梯形流道二次流數(shù)值建模

為便于解析階梯形流道中粒子慣性聚焦機理，采用多物理場仿真軟件COMSOLMultiphysics?對階梯形截面螺旋流道進行3D數(shù)值建模，研究3D流道中的二次流場分布。由于螺旋流道的長度較長，為簡化模型，僅建立了半圈的彎曲流道模型，三階梯和五階梯流道模型的半徑均為6.5mm。流道模型采用層流模塊，流體離散化設置為P2+P2（二階速度+二階壓力），流道壁面定義為無滑移邊界。流道中的液體為納維-斯托克斯不可壓縮流體，流體材料設置為水，密度為1000kg/m3，動力粘度為0.001Pa·s。流道的入口流速設置為0.43m/s，出口壓力設置為0。采用精細化的四面體網格劃分模型，通過計算模型得到階梯形流道截面中的二次流場及流速分布。

2結果與討論

2.13D打印微流控芯片質量

3D打印流道陽模實物如圖3A～3C所示，可見流道表面幾乎呈鏡面，無毛刺和樹脂殘留物黏連。用刀片將PDMS芯片沿流道正截面切開，并置于顯微鏡下觀測，階梯形截面如圖3D和3E所示。對比兩種流道截面輪廓，發(fā)現(xiàn)三階梯流道截面的輪廓線平行度和垂直度較好，水平和垂直方向的尺寸誤差分別為±10μm和±6μm。五階梯流道截面的垂直度稍差，水平和垂直方向的尺寸誤差分別為±20μm和±10μm。微流控芯片實物如圖3F所示，芯片流道中填充了藍墨水，可以直觀表現(xiàn)微流道的平面結構?？傮w而言，3D打印加工復雜階梯形微流道的質量較好，可滿足后續(xù)粒子慣性操控實驗要求。

2.2微粒慣性聚焦原理

微尺度直流道中粒子雷諾數(shù)Re≥1時，靠近流道壁的粒子會受到遠離壁面方向的壁面升力FLW作用，同時粒子還受到指向壁面方向的剪切梯度升力FLS的作用（圖4）。當粒子直徑滿足慣性聚焦要求（a/Dh≥0.07，a為粒子直徑，Dh為流道水力直徑）[12]時，粒子所受的凈慣性升力FL大于粒子所受到的流體粘性力，粒子慣性聚焦至流道內的某一平衡位置。粒子所受的凈慣性升力FL按公式（1）和（2）計算[24]：

式中，ρ為流體密度，Um為流體最大速度，fL為升力系數(shù)（取決于流道雷諾數(shù)Re和粒子在流道橫截面內的位置Xp），μ為流體動力粘度。

粒子處于彎流道內時，彎流道中心區(qū)域與近壁面區(qū)域流體流速不匹配，產生二次流，使流體在流道截面上產生兩個對稱旋轉的漩渦，該現(xiàn)象即為Dean流效應。Dean流的大小可以采用無量綱參數(shù)De來表示（式（3））[24]：

式中，R為流道的起始半徑。若流體遵循斯托克斯定律，則粒子在彎流道中所受的Dean曳力FD的計算公式（式（4））近似為[24]：

式中，UD為Dean流速。當Dean曳力遠大于慣性升力時，粒子忽略慣性升力影響隨Dean流運動。當Dean曳力遠小于慣性升力時，粒子幾乎不受Dean流影響，將慣性聚焦至流道內的平衡位置。當Dean曳力與慣性升力處于同一量級時，粒子在流道內的聚焦位置可通過調節(jié)Dean流的強度進行精確控制。

2.3微粒慣性操控實驗結果

2.3.1三階梯流道中粒子慣性聚焦效應

配制微粒懸浮液，將10μm和6μm粒子原液分別加入到去離子水中，再各加入質量濃度為0.5%的Tween20，以降低粒子團聚及黏附于流道壁面的現(xiàn)象。配制得到的10μm粒子懸浮液的濃度約為105particle/mL，6μm粒子懸浮液的濃度約為106particle/mL。

圖5顯示了三階梯流道出口處粒子的聚焦遷移熒光軌跡，粒子進樣流量均為0.1～1.8mL/min，流量增量為0.1mL/min，流量對應的迪恩數(shù)De為0.8～14.4。對10μm粒子的熒光軌跡進行分析，發(fā)現(xiàn)粒子在低流量（De=0.8）時主要分布于流道外側（階梯Ⅰ和Ⅱ的交界處）。隨著流量逐步增大，粒子逐漸聚焦并向流道內壁面方向移動。當De=4時，大部分粒子已聚焦在流道中心附近。隨著流量的繼續(xù)加大（De=6.4～14.4），粒子聚焦效果變得更好，并且大部分粒子已在內壁面附近形成聚焦粒子束。值得注意的是，有部分粒子在階梯Ⅱ的內壁面處形成了單列聚焦，另有少量粒子在階梯Ⅰ的內壁面處形成單列聚焦，最終呈現(xiàn)出三平衡位置聚焦現(xiàn)象。10μm粒子的規(guī)格化熒光強度曲線如圖6A所示，當De值較低時（De=1.6），粒子束具有一個靠近流道外壁面的聚焦峰。當De值分別增大至3.2、6.4和11.2時，粒子束均具有2個明顯的聚焦峰，并且聚焦峰位置逐步向流道內壁移動。從插圖中的明場粒子軌跡可知，De值分別為1.6和11.2時粒子的聚焦狀況很好地佐證了上述結論。此外，階梯Ⅰ內粒子聚焦束在熒光強度曲線中無聚焦峰存在，原因在于該位置處粒子數(shù)量極少，導致熒光強度較弱。

與10μm粒子相比，6μm粒子的慣性聚焦行為有所不同。在低流量（De≤1.6）時，大部分6μm粒子分散于外側流道中。當流量逐漸增大時，粒子分別在3個階梯的內壁面附近形成3個穩(wěn)定的聚焦位置（De=4.8～8.8）。其中，階梯Ⅱ處的粒子聚焦束熒光強度最高，表明大多數(shù)粒子聚焦于該位置。階梯Ⅲ處的粒子束熒光強度略高于階梯Ⅰ處，表明聚焦在流道內壁附近的粒子數(shù)略多于流道外壁面。隨著流量進一步增大（De=9.6～14.4），之前聚焦于流道內壁附近的粒子逐漸消失，而聚焦于流道外壁附近的粒子則逐漸增加，表現(xiàn)為外壁面附近的粒子束熒光強度增加。圖6B中6μm粒子歸一化熒光強度曲線也很好地驗證了上述觀點，隨著De值從低到高增大時，聚焦粒子束的熒光峰從2個變?yōu)?個，最后再變?yōu)?個。

由仿真結果可知，內壁面階梯Ⅲ中的二次流最弱，外壁面階梯Ⅰ中的二次流最強，因此低流量時10和6μm粒子均受主導的強迪恩曳力作用，隨二次流在外側流道附近來回旋轉運動，呈分散狀分布。隨著流量的增大，粒子所受的慣性升力逐漸與迪恩曳力平衡，表現(xiàn)為粒子逐漸聚焦并向流道內壁面方向移動。由于三階梯流道中存在3對相對獨立的二次流旋渦，每個階梯中的二次流旋渦均對粒子造成了一定的束縛作用，因此導致粒子具有3個慣性聚焦平衡位置。由于10μm粒子尺寸較大，所受的慣性升力也較大，因此絕大部分10μm粒子聚焦在流道內壁面附近。6μm粒子所受的慣性升力較小，因此內壁面處的粒子受強迪恩曳力作用被拖拽至階梯Ⅱ和Ⅲ中，最終形成了2個聚焦平衡位置。

2.3.2五階梯流道中粒子慣性聚焦效應

圖7A顯示了10μm粒子在五階梯流道中的熒光運動軌跡，粒子進樣流量設為0.1～1.2mL/min，流量增量為0.1mL/min，流量對應的De=0.7～8.0?；诹Ｗ釉诹鞯乐械木劢剐袨椋蓪⒘Ｗ泳劢惯^程大體分為單平衡位置聚焦和雙平衡位置聚焦兩個階段。當De值在0.7～2.0范圍內時，粒子在階梯Ⅱ中處于單平衡位置聚焦階段，并且隨流量增大，聚焦粒子束緩慢向內側流道遷移。當流量進一步增大時（De=2.7～5.4），大部分粒子快速進入階梯Ⅳ中，而小部分粒子的遷移速度較慢，從而產生明顯的雙平衡聚焦狀態(tài)。當流量較高時（Degt;6），聚焦粒子束逐漸分散。6μm粒子的運動軌跡如圖7B所示，6μm粒子在所有流量范圍內均呈現(xiàn)出了雙平衡位置聚焦狀態(tài)，并且粒子聚焦位置靠近流道外側。隨著流量增大，部分粒子的聚焦位置緩慢向流量內壁移動。圖7C和7D分別顯示了10μm和6μm粒子的歸一化熒光強度曲線。隨著De值不斷增大，10μm粒子束的聚焦峰從1個變?yōu)?個，并且2個聚焦峰的位置逐步向流道內壁移動。6μm粒子束具有2個聚焦峰，但聚焦峰位置隨De值變化較小。

由仿真圖可知，階梯Ⅰ和階梯Ⅱ中共存一對非對稱的二次流旋渦，其它3個階梯中存在3對相對獨立的二次流旋渦。由于外側流道的二次流強度遠大于內側流道，因此絕大多數(shù)粒子在低流量時被束縛于外側流道中?？紤]到慣性升力與流道水力直徑的平方成反比，粒子在五階梯流道中受到的慣性升力遠大于三階梯流道，因此10μm粒子在低流量時的慣性升力即可與迪恩曳力達到平衡，從而實現(xiàn)單束聚焦。隨著流量增大，10μm粒子所受的慣性升力逐漸大于迪恩曳力，使得大部分粒子向階梯Ⅲ遷移，小部分粒子則受外側強二次流束縛仍然保持在階梯Ⅱ中的平衡位置。在高流量時，由于整個流道中的二次流顯著增強，導致10μm聚焦粒子束受二次流擾動產生一定的分散性。與10μm粒子相比，6μm粒子由于尺寸小，所受慣性升力較小，因此在低流量時受迪恩曳力作用隨二次流在外側流道中作散亂運動。在高流量時，一部分6μm粒子受增強的慣性升力進入階梯Ⅲ中，另一部分粒子則被階梯Ⅱ中的強二次流所束縛，從而產生2個穩(wěn)定的聚焦位置。

綜上所述，三階梯和五階梯流道中二次流漩渦的數(shù)量、形態(tài)和強度顯著不同。通過改變流道截面形狀，可顯著改變二次流特性，最終改變流道中粒子的慣性聚焦平衡位置和聚焦粒子束數(shù)量。

3結論

提出了面投影微立體光刻3D打印制作復雜階梯形截面慣性流道的加工方法，研制了高精度的三階梯和五階梯截面螺旋流道慣性微流控芯片。針對上述兩種階梯形流道，開展了粒子慣性操控實驗研究，并結合仿真結果解析了10μm和6μm粒子在流道中的慣性聚焦遷移機理。在三階梯流道中，10μm粒子主要聚焦在流道內壁面附近，少量粒子單束聚焦在流道中心和流道外壁面處，6μm粒子則聚焦在流道中心和外壁面處的2個平衡位置。在五階梯流道中，10μm和6μm粒子均出現(xiàn)雙平衡位置聚焦現(xiàn)象。其中，10μm粒子的2個聚焦平衡位置隨著流量增大逐步向內壁面遷移；而6μm粒子的平衡位置變化不大。綜上，階梯形截面流道中存在多對二次流漩渦，通過調整階梯形狀，顯著改變了二次流的數(shù)量、形態(tài)和強度，使粒子在流道中具有多個聚焦平衡位置。本研究成果有助于進一步拓展慣性微流控理論，為生物細胞精準慣性操控提供新的思路，促進慣性微流控技術在分析化學和生物醫(yī)學等領域中的發(fā)展。