摘要 為探究鐵皮石斛醇提物對(duì)抗生素致腸道菌群失調(diào)小鼠腸道菌群的影響，本試驗(yàn)分別設(shè)置空白組和腸道菌群失調(diào)模型組（灌胃鹽酸林可霉素120 mg/kg），分別給予模型組常溫水、鐵皮石斛醇高劑量（6 g/kg）、低劑量（1.5 g/kg）處理，觀(guān)察各處理小鼠一般情況、TNF-α、IL-1水平、短鏈脂肪酸水平、腸道菌群組成及豐度和多樣性。結(jié)果表明，鐵皮石斛高、低劑量組小鼠精神一般情況好轉(zhuǎn)，血清TNF-α、IL-1水平與模型組相比明顯降低，短鏈脂肪酸水平明顯提高；腸道菌群物種組成與模型組存在差異，但其豐度及多樣性差異不明顯。鐵皮石斛醇提物對(duì)抗生素致腸道菌群失調(diào)小鼠的腸道菌群具有一定的改善作用。

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛；腸道菌群；小鼠；菌群豐富度

中圖分類(lèi)號(hào) R282；S-3" " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A" " 文章編號(hào) 1007-7731（2024）15-0046-05

DOI號(hào) 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.15.011

Effects of the ethanol extract of Dendrobium officinale on gut microbiota of dysbacteriosis mice

ZHU Can1" " XU Xiaoyu1" " LI Jun1" " LIU Junjie1" " GU Fangli1，2" " HUANG Renshu1，2" " HE Xiaomei1，2

（1Biological and Pharmaceutical Engineering， West Anhui University， Lu’an 237012， China; 2Anhui Province Traditional Chinese Medicine Resource Protection and Sustainable Utilization Engineering Laboratory，

Lu’an 237012， China）

Abstract To explore the effects of ethanol extract from Dendrobium officinale on the gut microbiota of antibiotic induced dysbiosis mice， a blank group and a gut microbiota dysbiosis model group（gavage of lincomycin hydrochloride 120 mg/kg）were set up， respectively. The model group was treated with normal water， high（6 g/kg）and low dose（1.5 g/kg）of ethanol extract from Dendrobium officinale， and the effects of each treatment on the general condition， TNF-α， IL-1 levels， short chain fatty acid levels， gut microbiota composition， richness， and diversity of mice were observed. The results showed that the general mental condition of mice in the high-dose and low-dose groups of Dendrobium officinale improved， and the levels of serum TNF-α and IL-1 were significantly reduced compared to the model group， while the levels of short chain fatty acids were significantly increased. There were differences in the species composition of gut microbiota compared to the model group， but no significant differences in richness and diversity. The ethanol extract of Dendrobium officinale had a certain improvement effects on the gut microbiota of antibiotic induced intestinal dysbiosis mice.

Keywords Dendrobium officinalis; gut microbiota; mice; microbial richness

抗生素具有較好的抗感染作用，其科學(xué)應(yīng)用對(duì)臨床醫(yī)藥學(xué)發(fā)展具有一定促進(jìn)作用[1]。當(dāng)一種或多種抗生素被大劑量長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)，可能會(huì)引起腸道菌群失調(diào)，帶來(lái)抗生素相關(guān)性腹瀉等副作用，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致“超級(jí)細(xì)菌”產(chǎn)生[2-4]。腸道菌群是寄居在人體中維持機(jī)體環(huán)境穩(wěn)定與調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝的最大微生物群體。宋媛媛等[5]研究表明，長(zhǎng)期或大量使用抗生素會(huì)抑制或殺滅機(jī)體腸道有益菌群，導(dǎo)致有害菌或條件致病菌大量增殖，造成腸道菌群失調(diào)。腸道菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致食物中的多糖代謝成短鏈脂肪酸（Short chain fatty acid， SCFAs）減少，未經(jīng)代謝的多糖滯留于腸道中從而引起滲透性腹瀉。韓天雨等[6]研究發(fā)現(xiàn)，抗生素所致腸道菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致多種炎癥性疾病及焦慮樣情緒行為。如何合理使用抗生素，在合理發(fā)揮其療效的同時(shí)減輕或消除副作用成為臨床研究的重點(diǎn)問(wèn)題之一。治療腸道菌群失調(diào)的途徑主要有治療原發(fā)病、合理使用微生物制劑以及糞菌移植等。林麗等[7]研究表明，短鏈脂肪酸在人體的生命活動(dòng)中具有重要作用，其能為腸上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)腸道免疫功能，維持腸上皮細(xì)胞的形態(tài)與功能；楊歡[8]研究指出，中草藥對(duì)于恢復(fù)腸道菌群紊亂具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

鐵皮石斛中含有多糖、菲酚類(lèi)、聯(lián)芐、黃酮和生物堿等一系列活性成分。王治丹等[9]研究顯示，鐵皮石斛具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、降血壓和降血糖等作用，還對(duì)修復(fù)腸道受損細(xì)胞、保護(hù)胃腸黏膜等有一定積極作用。課題組在前期研究鐵皮石斛不同提取物對(duì)腸道菌群失調(diào)小鼠的影響中發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛醇提物提高腸道菌群失調(diào)小鼠有益菌的比例優(yōu)于多糖、水提物，但由于給藥時(shí)間短，未發(fā)現(xiàn)醇提物對(duì)菌群失調(diào)小鼠腸道菌群豐富度及多樣性的明顯影響。因此，本研究擬灌胃鹽酸林可霉素復(fù)制菌群失調(diào)小鼠模型，探討延長(zhǎng)給藥時(shí)間、擴(kuò)大給藥劑量范圍對(duì)腸道菌群失調(diào)小鼠一般情況、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白介素-1（Interleukin-1，IL-1）水平、短鏈脂肪酸水平、腸道菌群物種組成以及豐富度、多樣性等的影響，為鐵皮石斛提取物用于調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)昆明種小鼠40只，體重20±5 g，雌雄比例各占50%。試驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，編號(hào)：SCXK（皖）2022—001。

1.2 試驗(yàn)藥物

鐵皮石斛醇提物，鐵皮石斛原料來(lái)自皖西學(xué)院石斛種植基地，取150 g粉碎過(guò)篩后，加30倍水浸泡4 h，85 ℃水煮3 h，離心后取上清液加入2倍無(wú)水乙醇，再次離心取上清液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液即為鐵皮石斛醇提物；鹽酸林可霉素注射液購(gòu)自華北制藥股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)試劑

TNF-α、IL-1檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；裂解液、磷酸化蛋白酶抑制劑、顯影定影試劑和抗體等試劑購(gòu)自賽維爾生物科技有限公司；乙醇、乙醚和磷酸等為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 試驗(yàn)儀器

Synergy H1多功能酶標(biāo)儀（伯騰儀器有限公司）；TDL6 M臺(tái)式低速低溫冷凍離心機(jī)（湖南邁達(dá)儀器有限公司）；JD-801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.5 試驗(yàn)方法

對(duì)試驗(yàn)小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，分為4組，每組10只，記為空白組、模型組、鐵皮石斛醇提物高劑量組和鐵皮石斛醇提物低劑量組。試驗(yàn)第1—7天，空白組、模型組每天灌胃常溫水1次，鐵皮石斛醇提物高、低劑量組每天分別灌胃鐵皮石斛醇提物6.0、1.5 g/kg（生藥量）1次。第8—9天，模型組和鐵皮石斛醇提物高、低劑量組每天灌胃2次鹽酸林可霉素120 mg/kg，空白組灌胃常溫水。造模結(jié)束后，空白組、模型組繼續(xù)灌胃常水，鐵皮石斛醇提物高、低劑量組繼續(xù)按照6.0和1.5 g/kg給藥至第21天。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

試驗(yàn)期間，觀(guān)察各組小鼠的精神、活動(dòng)和排便狀況。于給藥第15天取小鼠糞便進(jìn)行含水量測(cè)試，拎起小鼠尾巴，按摩其下腹部促進(jìn)排便，取小鼠新鮮糞便稱(chēng)重后，放入105 ℃烘箱中，烘干至恒重，記錄烘干后的糞便重量，并計(jì)算糞便含水量數(shù)值。于末次給藥后1 h，摘眼球取血，離心，取上清液，ELISA法按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α、IL-1水平；頸椎脫臼處死小鼠，剖腹，取盲腸內(nèi)容物檢測(cè)短鏈脂肪酸水平，16S測(cè)序分析腸道菌群；對(duì)測(cè)得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行α和β多樣性分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小鼠一般情況的影響

造模前，各組小鼠精神及活動(dòng)正常；高、低劑量組小鼠攝食率較高。造模后，模型組小鼠精神不佳，活動(dòng)減少，腹瀉，肛門(mén)紅腫；給藥后，鐵皮石斛醇提物高、低劑量組精神、活動(dòng)有所改善，腹瀉減輕，肛門(mén)紅腫消失，模型組癥狀改善較慢。空白組、模型組、鐵皮石斛醇提物高、低組小鼠糞便含水量分別為59.3%、68.3%、64.4%和64.6%；與模型組相比，給藥組小鼠糞便含水量略有降低，表明鐵皮石斛醇提物有助于改善模型小鼠腹瀉癥狀。

2.2 對(duì)小鼠血清TNF-α、IL-1水平的影響

如表1所示，與空白組小鼠相比，模型組小鼠血清炎癥因子TNF-α水平升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），IL-1水平升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），表明模型小鼠體內(nèi)發(fā)生炎癥。與模型組小鼠相比，鐵皮石斛醇提物高、低劑量組的TNF-α、IL-1水平均有所下降，差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。

2.3 對(duì)小鼠腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸水平的影響

如表2所示，與空白組小鼠相比，模型組小鼠腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸乙酸、丙酸和丁酸水平降低，差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；與模型組小鼠相比，鐵皮石斛醇提物高、低劑量組腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸水平升高，差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。

2.4 對(duì)小鼠腸道菌群的影響

2.4.1 對(duì)腸道菌群物種組成的影響" 繪制門(mén)水平的物種相對(duì)豐度堆疊柱狀圖如圖1所示。在門(mén)水平上，各組均以擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）為優(yōu)勢(shì)菌群，其中低劑量組Firmicutes最為豐富，模型組、高劑量組疣微菌門(mén)（Verrucomicrobiota）豐富度高于低劑量組。

2.4.2 α多樣性分析及曲線(xiàn)繪制" α多樣性指數(shù)可反映個(gè)體微生物群落的豐富度和多樣性。如圖2A所示，各組稀釋曲線(xiàn)在tag數(shù)達(dá)60 000時(shí)趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠檢測(cè)物種數(shù)量；如圖2B所示，香濃指數(shù)曲線(xiàn)隨著測(cè)序量的增加趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序深度足夠，可以檢測(cè)出樣本中大部分微生物物種信息；如圖2C所示，隨著測(cè)序量增加，各組豐度曲線(xiàn)趨于平緩，曲線(xiàn)在橫軸上的范圍越大、越平緩，說(shuō)明物種的組成越豐富，分布均勻度越高。綜合分析可知，與模型組相比，鐵皮石斛醇提物高、低劑量組菌群的豐富度及多樣性未發(fā)現(xiàn)明顯差異。

2.4.3 對(duì)腸道菌群β多樣性的影響" PCoA主坐標(biāo)分析通過(guò)降維方式尋找復(fù)雜樣本中的主要樣本差異距離，樣品越相似，反映在PCoA圖中的距離越近（圖3），空白組與模型組、鐵皮石斛醇提物高、低劑量組距離較遠(yuǎn)，鐵皮石斛醇提物高、低劑量組與模型組間有一定距離，表明鐵皮石斛醇提物對(duì)抗生素致菌群失調(diào)小鼠具有一定的調(diào)節(jié)作用。腸道菌群β多樣性分組信息驗(yàn)證結(jié)果如圖4所示，空白組、模型組和鐵皮石斛醇提物高、低劑量組比較P=0.01lt;0.05，表明各組菌群結(jié)構(gòu)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)論與討論

腸道菌群在宿主及外部環(huán)境共同影響下建立動(dòng)態(tài)生理平衡，維持宿主的正常生命活動(dòng)及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。腸道菌群中的厭氧菌可發(fā)酵食物殘?jiān)胁荒鼙幌奶牵ò瓜矸?、纖維素、半纖維素和果膠等）和一些寡糖，能分解部分的多肽和蛋白質(zhì)產(chǎn)生短鏈脂肪酸（包括乙酸、丙酸和丁酸等）[10]。楊艷青等[11]研究證明，短鏈脂肪酸有多種生理功能，一方面可為腸道細(xì)胞供能，促進(jìn)腸道細(xì)胞生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腸道中的酸堿度，減少有害菌的生長(zhǎng)，避免腸道功能紊亂同時(shí)抑制抗炎因子的形成，從而減少腸道炎癥的發(fā)生；另一方面可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖分化，起到抗腫瘤的作用。郭春艷等[12]研究表明，腸道菌群失調(diào)可能導(dǎo)致短鏈脂肪酸生成受阻，影響腸道細(xì)胞生長(zhǎng)，免疫力下降，進(jìn)而引起腸道炎癥，導(dǎo)致腸道功能紊亂。使用抗生素在抗病原菌的同時(shí)，可能導(dǎo)致腸道有益菌減少，中性菌遷移定殖，有害菌大量繁殖，引起腸道菌群失調(diào)，引發(fā)炎癥性腸病，或由于腸道代謝物進(jìn)入引起其他慢性腸外病變，如皮膚病[13]、肝病[14]、心血管疾病[15]和代謝性疾病[16]等。本試驗(yàn)結(jié)果表明，模型小鼠灌胃鹽酸林可霉素后，精神活動(dòng)不佳、腹瀉，血清TNF-α、IL-1水平升高，短鏈脂肪酸乙酸、丙酸和丁酸水平下降，表明鹽酸林可霉素灌胃小鼠復(fù)制腸道菌群失調(diào)小鼠模型有一定效果。

調(diào)節(jié)腸道菌群可預(yù)防或緩解由腸道菌群失調(diào)引起相關(guān)疾病。張學(xué)強(qiáng)等[17]研究表明，干姜水提取液能明顯提高抗生素相關(guān)性腹瀉大鼠腸道菌群的豐度及多樣性，在門(mén)水平上能提高酒精性癡呆模型大鼠厚壁菌門(mén)豐度，降低變形菌門(mén)豐度；在屬水平上降低擬桿菌屬、大腸桿菌-志賀菌等豐度，提高乳酸桿菌屬、毛螺菌科等豐度。鐵皮石斛的主要化學(xué)成分為多糖、酚類(lèi)和生物堿等[18]。于子真等[19]研究發(fā)現(xiàn)，不同劑型的石斛可調(diào)節(jié)脾虛便秘小鼠腸道菌群；鐵皮石斛還可以通過(guò)恢復(fù)腸道黏膜的完整性促進(jìn)機(jī)體免疫能力的提升。鐵皮石斛水提物可提高糖尿病、高血脂小鼠腸道菌群的豐度及多樣性[9，20]；鮮榨鐵皮石斛汁組小鼠的腸道菌群豐度提升，有益菌屬豐度上升，有害菌屬豐度下降[21]。

本試驗(yàn)應(yīng)用高、低兩個(gè)劑量組，研究了鐵皮石斛醇提物對(duì)腸道菌群失調(diào)小鼠一般情況、血清TNF-α及IL-1水平、短鏈脂肪酸水平、腸道菌群組成以及豐度、多樣性的影響，并分析其量效關(guān)系。結(jié)果表明，鐵皮石斛醇提物可改善腸道菌群失調(diào)小鼠一般情況，降低血清TNF-α及IL-1水平，提高短鏈脂肪酸水平；高、低劑量組的腸道菌群物種組成和菌群結(jié)構(gòu)與模型組存在差異，但豐度及多樣性差異不明顯。以上結(jié)果表明鐵皮石斛醇提物對(duì)抗生素致腸道菌群失調(diào)小鼠的腸道菌群具有一定的改善作用，但量效關(guān)系仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] 仲益. 藥學(xué)干預(yù)對(duì)抗生素臨床合理應(yīng)用的影響[J]. 北方藥學(xué)，2021，18（6）：102-103.

[2] 洪關(guān)婷，梁磊，王一瓊，等. 中藥調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)治療抗生素相關(guān)性腹瀉的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)肛腸病雜志，2023，43（11）：76-80.

[3] 黃怡秋，許春娣，王歆瓊，等. 雙歧桿菌三聯(lián)活菌散/膠囊治療兒童抗生素相關(guān)性腹瀉臨床療效的meta分析[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2023，35（9）：1032-1038.

[4] 李昕，曾潔，王岱，等. 細(xì)菌耐藥耐受性機(jī)制的最新研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)抗生素雜志，2020，45（2）：113-121.

[5] 宋媛媛，貢雪芃，肖蒙，等. 抗生素相關(guān)性腹瀉研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2019，38（11）：1454-1458.

[6] 韓天雨，楊棟，周樹(shù)青，等. 抗生素所致腸道菌群失調(diào)與治療研究進(jìn)展[J]. 解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2021，39（1）：98-101.

[7] 林麗，谷翠紅，王碩，等. 短鏈脂肪酸對(duì)抗生素相關(guān)性腹瀉的作用及機(jī)制研究[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2023，27（19）：61-66.

[8] 楊歡. 中草藥對(duì)腸道菌群的影響及對(duì)T2 DM小鼠腸道菌群和糖代謝的影響[D]. 大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2022.

[9] 王治丹，代云飛，羅尚娟，等. 鐵皮石斛化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 華西藥學(xué)雜志，2022，37（4）：472-476.

[10] 楊麗婷，王子微，王加啟，等. 短鏈脂肪酸及其調(diào)節(jié)腸道炎癥作用的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2022，43（24）：433-443.

[11] 楊艷青，李燦委，楊自忠，等. 腸道菌群代謝物：短鏈脂肪酸的研究進(jìn)展[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2022，38（14）：1834-1837.

[12] 郭春艷，劉雪梅，李艾洵，等. 健脾益腎通絡(luò)方對(duì)MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠腸道菌群與短鏈脂肪酸的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2024，36（1）：1-9.

[13] 高雙雙，王渟，范華宇，等. 腸道菌群失調(diào)與銀屑病的相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2022，21（6）：566-569.

[14] 歐陽(yáng)曉俊. 腸道菌群與代謝性疾病的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)臨床保健雜志，2021，24（3）：305-310.

[15] 吳儀，譚周進(jìn). 代謝性疾病腸道菌群研究現(xiàn)狀及其與中醫(yī)診療關(guān)系的探討[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2021，33（6）：718-722.

[16] 張小芳，王欣，汪惠勤，等. 人體腸道菌群代謝氨基酸產(chǎn)生短鏈脂肪酸及對(duì)細(xì)胞通透性的影響[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2021，21（7）：60-67.

[17] 張學(xué)強(qiáng)，章從恩，于小紅，等. 干姜改善抗生素相關(guān)性腹瀉及對(duì)腸道菌群的作用研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2022，47（5）：1316-1326.

[18] 孫樂(lè)，陳曉梅，吳崇明，等. 鐵皮石斛多糖藥理活性研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2020，55（10）：2322-2329.

[19] 于子真，譚周進(jìn)，肖嫩群. 鐵皮石斛對(duì)脾虛便秘小鼠腸道形態(tài)及腸道免疫細(xì)胞數(shù)量的影響[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2021，12（8）：3224-3228.

[20] 倪凱，何鵬飛，梁志慶，等. 鐵皮石斛化學(xué)成分、藥理作用及毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究進(jìn)展[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志，2023，44（10）：86-93.

[21] 陳文華，李思琦，宋佳，等. 鐵皮石斛對(duì)抗生素誘導(dǎo)小鼠腸道菌群紊亂的改善作用[J]. 中草藥，2023，54（19）：6362-6369.

（責(zé)任編輯：李 媛）