摘 要： 旨在了解狐貍流產(chǎn)的病因。本研究對河北省某狐貍養(yǎng)殖場流產(chǎn)胎兒進行解剖、病原分離培養(yǎng)、16S rRNA測序、毒力基因檢測、血清型檢測、藥敏試驗及致病性試驗。結(jié)果顯示，從狐貍流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離獲得6株肺炎克雷伯菌，檢測出12種毒力基因（wabG、fimH、ent、icuA、icuB、mrkA、ycf、ecp、uge、ureA、iroB和ybtA）和3種血清型（K20、K54和K57），其中，K57為本次檢測過程的優(yōu)勢血清型；經(jīng)K-B藥敏紙片法分析，發(fā)現(xiàn)本次分離獲得的肺炎克雷伯菌對氨基糖苷類、頭孢菌素類、喹諾酮、多肽類等抗菌藥物存在中度或高度敏感，對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、青霉素類等抗菌藥物存在多重耐藥；經(jīng)致病性試驗分析，本次分離獲得的肺炎克雷伯菌對小鼠具有一定的致病性，半數(shù)致死量（LD50）為1.2×107 CFU·mL-1?；诖?，本研究分離得到的肺炎克雷伯菌具有一定的致病性和耐藥性，且攜帶多種毒力基因，可能是誘發(fā)狐貍胎兒流產(chǎn)、死亡的因素之一，為狐貍胎兒流產(chǎn)的防控及診斷提供思路。

關(guān)鍵詞： 狐貍；肺炎克雷伯菌；毒力基因；分離鑒定

中圖分類號：S852.611

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3640-09

收稿日期：2023-10-27

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2023YFD1800700）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（1610342023016）；吉林省發(fā)改委項目（2023C029-5）；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2021-ISAPS）

作者簡介：王奇林（1995-），甘肅武威人，實習研究員，碩士，主要從事動物傳染病防控研究，E-mail： wangqilin@caas.cn; Tel： 18394167332

通信作者：王曉旭，主要從事家畜動物和毛皮動物疾病的診斷與防治研究，E-mail： wangxiaoxussdd@126.com

Isolation， Identification and Drug Resistance Analysis of Klebsiella pneumoniae

in Aborted Fetuses of Fox

WANG" Qilin， CAO" Runlai， WANG" Weiyang， ZHANG" Bo， LIU" Zhijie， WANG" Xiaoxu*

（Key Laboratory of Special Animal Epidemic Disease， Ministry of Agriculture/Institute of Special

Animal and Plant Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changchun 130112，" China）

Abstract：" In order to understand the etiology of abortion in foxes， the aborted fetuses in a fox farm in Hebei Province was analyzed by dissection， pathogen isolation and cultivation， 16S rRNA sequencing， virulence gene detection， serotype detection， drug susceptibility analysisassay and pathogenicity analysis assay in this study. As a result， 6 strains of Klebsiella pneumoniae were isolated. Twelve virulence genes （wabG， fimH， ent， icuA， icuB， mrkA， ycf， ecp， uge， ureA， iroB and ybtA） and three serotypes （K20， K54 and K57） were determined， and the K57 was the dominant serotype. Through K-B drug susceptibility testing， it showed that the isolated K. pneumoniae was moderately or highly sensitive to aminoglycosides， cephalosporins， quinolones， polypeptides and other antibacterial drugs， and multiple drug resistance to macrolides， tetracycline， penicillin and other antibacterial drugs was found. According to the pathogenicity analysis， the K. pneumoniae isolate had certain pathogenicity to mice， and the median lethal dose （LD50） was 1.2×107 CFU·mL-1. In general， K. pneumoniae isolate showed certain pathogenicity， drug resistance， and carrying a variety of virulence genes in this study， and it might be one of the factors causing abortion of fox fetuses. The findings might provide hints for prevention and control of fox fetal abortion.

Key words： fox; Klebsiella pneumoniae; virulence gene; solation and identification

*Corresponding author：" WANG Xiaoxu， E-mail： wangxiaoxussdd@126.com

狐貍是一種珍貴的毛皮動物，其毛皮可作為天然制裘原料，具有很高的經(jīng)濟價值［1］。近些年，隨著我國毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，毛皮動物養(yǎng)殖的規(guī)?；潭戎饾u提高。在規(guī)模化養(yǎng)殖模式下，細菌、病毒和寄生蟲等動物疫病問題也日益凸顯［2-3］。這些問題不僅造成了重大的經(jīng)濟損失，還嚴重的威脅到人類的健康［4］。目前，已報道與狐貍相關(guān)的病原菌有大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門菌（Salmonella）、鏈球菌（Streptothrix）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium welchii）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）等［5-7］。其中，肺炎克雷伯菌是最常見且危害較為嚴重的一種病原微生物。

肺炎克雷伯菌，隸屬于腸桿菌科（Enterobaeteriaceae），克雷伯菌屬（Klebsiella），是一種重要的人獸共患性條件性致病菌，廣泛的存在于人和動物黏膜表面以及自然環(huán)境中［8-9］。在正常情況下，該病原不會引起人或畜禽感染，但當宿主機體處于衰弱、免疫低下時，可能會引起禽類的肺炎、腸炎、肝膿腫；家畜的乳房炎、腦膜炎、子宮內(nèi)膜炎；甚至還可引發(fā)敗血病，嚴重影響到了養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展［10-14］。目前，有關(guān)狐貍源性肺炎克雷伯菌的分離、鑒定、分型及生物學特性研究多以成年動物病例為主，對于胎兒體內(nèi)的研究尚少［11-12］。本研究從狐貍流產(chǎn)胎兒中分離得到肺炎克雷伯菌，并對其進行基因型、血清型、耐藥性以及致病性研究，旨在為狐貍源性肺炎克雷伯菌病的診療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與實驗動物

10只狐貍流產(chǎn)胎兒來源于河北省某狐貍養(yǎng)殖場，其體內(nèi)多種組織器官呈現(xiàn)了不同程度的腫大、出血，肺、肝、腎和腸管的變化最為明顯。實驗動物為6周齡20 g左右的SPF昆明系小鼠，購自長春生物制品研究所有限責任公司。

1.2 主要試劑

蛋白胨、瓊脂粉、牛肉膏、麥康凱瓊脂購自青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；細菌基因組提取試劑盒購自OMEGA公司；膠回收試劑盒購自北京依珊匯通科技有限公司；DL2 000 Marker購自北京沃格東方科技有限公司；瓊脂粉購自北京索萊寶有限公司；藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 肺炎克雷伯菌的分離與鑒定

1.3.1 病原的分離培養(yǎng)

將病變組織（如：肺、肝、腎、腸組織等）勻漿混樣后接種于普通固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃，培養(yǎng)12 h后，觀察菌落形態(tài)特征。挑選典型菌落接種于500 μL普通液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，菌株經(jīng)革蘭染色后觀察菌體形態(tài)及染色特征。

1.3.2 16S rRNA和溶血酵素基因（khe）基因PCR鑒定

用細菌DNA試劑盒進行細菌基因組提取，具體操作步驟詳見OMEGA公司細菌DNA試劑盒說明書。以提取得到的DNA為模板，參考文獻［13］中16S rRNA和khe引物序列及反應程序?qū)浩溥M行擴增，引物的合成和陽性樣品的檢測均委托上海生工生物工程有限公司完成。PCR反應總體積為25 μL：模板DNA 2 μL，Dream Taq Green PCR Master Mix （2×） 13 μL，上下游引物各1 μL，H2O（Nuclease-free）8 μL。PCR擴增結(jié)束后，取5 μL加入1%的瓊脂糖凝膠中電泳30 min。電泳結(jié)束后，將凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)儀內(nèi)觀察。

1.3.3 遺傳系統(tǒng)進化分析

參考文獻［6］，利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫，將16S rRNA測序結(jié)果與 GenBank 中已收錄的菌株進行同源性比對。使用 MEGA7.0 軟件，采用鄰接算法（Neighbor-Joining，NJ）中的Kimura-2-parameter模型，構(gòu)建肺炎克雷伯菌16S rRNA位點的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.4 莢膜血清型檢測

以提取得到的DNA為模板，參考文獻［15］中的引物序列和反應條件對分離株進行肺炎克雷伯菌常見的K1、K2、K5、K20、K54和K57莢膜血清型進行PCR擴增，其引物的合成和陽性產(chǎn)物測序均委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.5 毒力基因檢測

以提取得到的DNA為模板，參考文獻［14］中 "的引物序列和反應條件對分離株進行肺炎克雷伯菌常見19種毒力基因進行PCR擴增，其引物序列及目的片段大小詳見表1，引物的合成和陽性產(chǎn)物測序均委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.6 藥敏試驗

參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）抗生素藥敏試驗標準，利用K-B（瓊脂擴散法）檢測分離菌株對包括 β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、頭孢菌素類、大環(huán)內(nèi)酯類等15種常用抗菌藥物的敏感性。

1.7 致病性試驗

根據(jù)肺炎克雷伯菌毒力基因及莢膜血清型攜帶情況，選取1株分離菌株。將其接種于TSB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)，OD600 nm為0.6～0.8。利用平板計數(shù)，對其進行統(tǒng)計并用PBS調(diào)整菌液的攻毒濃度。然后，選取48只22 g左右健康昆明系小鼠隨機分成6組，每組8只，小鼠腹腔注射菌液0.5 mL·只-1，1～5組濃度為2.1×105、2.1×106 、2.1×107、2.1×108、2.1×109 CFU·mL-1，6組為空白對照組，給予等量的滅菌PBS，攻毒12 h后開始觀察，記錄一周內(nèi)小鼠發(fā)病和死亡的情況，用寇氏改良法計算分離菌株的半數(shù)致死量（LD50）。

2 結(jié) 果

2.1 肺炎克雷伯菌的分離與鑒定

2.1.1 病原的分離培養(yǎng)

將流產(chǎn)胎兒病變組織經(jīng)劃線培養(yǎng)，在普通固體瓊脂培養(yǎng)基上長出圓形隆起灰白色菌落；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上長出圓形紅色濕潤的菌落；革蘭染色鏡檢為兩端鈍圓粗短桿菌狀的陰性菌，呈單個、成對或短鏈狀排列，有莢膜，菌體大小為（0.5～0.8 μm）×（0.6～2.0 μm）。

2.1.2 16S rRNA和khe基因PCR鑒定

將分離純化的菌株利用細菌通用引物16S rRNA對分離菌株基因組進行擴增，在1 492 bp處擴增出與預期大小一致的片段（圖1A）?；贜CBI數(shù)據(jù)庫中Blast在線工具對測序結(jié)果進行比對，發(fā)現(xiàn)6株菌與肺炎克雷伯菌參考株基因序列的相似性在98.0%～99.5%，分別命名為K.p-AF1、K.p-AF2、K.p-AF3、K.p-AF4、K.p-AF5、K.p-AF6。為了進一步對分離菌株進行驗證，利用肺炎克雷伯菌特異性引物擴增khe基因。結(jié)果顯示，在498 bp處擴增出與預期大小一致的條帶（圖1B）。

2.1.3 遺傳系統(tǒng)進化分析

基于16S rRNA基因位點擴增獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫下載的參考序列，利用Mega 7.0軟件的鄰接方法（NJ）構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖2所示。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，K.p-AF1和K.p-AF2分離株與肺炎克雷伯菌X-17株處于同一進化分支；K.p-AF4分離株與肺炎克雷伯菌X4株處于同一進化分支；K.p-AF6分離株與肺炎克雷伯菌QLR-8處于同一進化分支；結(jié)合16S rRNA和khe基因序列分析，進一步證明本研究從狐貍流產(chǎn)死胎內(nèi)分離到的菌株為肺炎克雷伯菌。

2.2 莢膜血清型檢測

基于PCR技術(shù)對本次分離獲得的6株肺炎克雷伯菌進行常見6種血清型的檢測。結(jié)果顯示，從6株分離菌中共檢測出3種血清型（圖3），即K20、K54和K57。其中，K57血清型的檢出率最高，為66.7%；K20和K54次之，為16.7%；K1、K2、K3和K5在本次研究中未被檢出。

2.3 毒力基因檢測

基于PCR技術(shù)對分離獲得的6株菌進行19種毒力基因的檢測。結(jié)果顯示，6株肺炎克雷伯菌共攜帶12種毒力基因（圖4和表2），分離菌株的毒力基因檢測結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中參考菌株序列的同源性在98%～100%。經(jīng)統(tǒng)計分析，fimH、makA、ecp、ureA毒力基因的檢出率最高，均為100%；wabG、ent、uge、icuA毒力基因的檢出率次之，分別為66.7%、66.7%、66.7%、50.0%；icuB、ycf、ybtA、iroB毒力基因的檢出率較低，分別為33.3%、33.3%、33.3%、16.7%；wcaG、magA、alls、iutA、rmpA、aero、kfu、iroN毒力基因在本次試驗研究中未被檢出。

2.4 藥敏試驗

參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）抗生素藥敏試驗標準，利用K-B（瓊脂擴散法）測定細菌的耐藥性。由表3可知，本次分離株對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、青霉素類等抗菌藥物存在多重耐藥；對氨基糖苷類、頭孢菌素類、喹諾酮類等抗菌藥物存在中度或高度敏感；對多肽類抗生素有高度的敏感性。

2.5 致病性試驗

將K.p-AF6分離菌株分為5個對數(shù)等距劑量組，對小鼠進行腹腔注射，注射后觀察1周，統(tǒng)計小鼠的死亡率（表4）。試驗組小鼠在12 h后開始發(fā)病，出現(xiàn)精神沉郁、行動遲緩、被毛粗亂、腹式呼吸，眼角伴有膿性分泌物，且伴有腹瀉。對照組小鼠期間活動正常，未見異常。剖檢死亡小鼠，腸管、肝和肺等出現(xiàn)不同程度的腫脹和出血。無菌采集小鼠病變組織（肝、腸管、肺）進行病原分離培養(yǎng)，16S rRNA鑒定及相關(guān)生物學特性分析，均與攻毒菌株一致。以上結(jié)果表明，該分離菌感染小鼠后，能侵入到小鼠體內(nèi)多個組織器官，引起不同程度的病變。用寇氏改良法計算分離菌株的LD50為1.2×107 CFU·mL-1。

3 討 論

肺炎克雷伯菌是繼大腸桿菌后的第二大條件性致病菌。自1882年，首次在肺炎死亡患者發(fā)現(xiàn)后［16］，該病原陸續(xù)在人和動物的呼吸道、消化道、泌尿生殖道黏膜、污水、植被表面及動物食品中被檢測到，已成為公共衛(wèi)生中重要病原之一［9，17］。據(jù)報道，肺炎克雷伯菌存在多種毒力因子，包括莢膜、脂多糖、菌毛、鐵攝取系統(tǒng)、外膜蛋白及外排泵等，多種毒力因子的相互作用導致肺炎克雷伯菌表現(xiàn)出不同程度的致病性［8，18-19］。目前，將肺炎克雷伯菌分為經(jīng)典肺炎克雷伯菌和高毒力肺炎克雷伯菌［20］。

本研究從狐貍流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離出6株肺炎克雷伯菌，利用PCR對其進行常見19種毒力基因的鑒定。結(jié)果顯示，從6株菌中檢測到12種毒力基因，分別為wabG、fimH、ent、icuA、icuB、mrkA、ycf、ecp、uge、ureA、iroB、iroN，而wcaG、alls、iutA、kfu等8種基因未被檢出。其中，fimH和mrkA的檢出率最高，為100%，這兩種基因與Ⅰ型菌毛和Ⅲ型菌毛相關(guān)，主要參與細菌對細胞的黏附，特別是呼吸道上皮細胞和尿道上皮細胞，在細菌侵染宿主過程中發(fā)揮著重要的作用［21-22］。uge和wabG的檢出率次之，為66.7%。這兩種基因與肺炎克雷伯菌脂多糖相關(guān)，主要編碼UDP半乳糖醛酸4-差向異構(gòu)酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶［22］。據(jù)報道，當uge或wabG突變或缺失時，肺炎克雷伯菌的定植力降低、毒力減弱［23-24］。ent、icu（icuA和icuB）、iro和ybt分別是編碼腸桿菌素、需氧菌素、沙門菌素和耶爾森菌素鐵載體的基因，在本研究中的檢出率分別為66.7%、50.0%、33.3%、16.7%和33.3%，它們主要參與鐵原子從細胞外向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運工作及生物被膜的發(fā)育和成熟［25-26］。其中，iucA是iuc操縱子中編碼產(chǎn)氣桿菌素的基因，可作為區(qū)分高毒力肺炎克雷伯菌和經(jīng)典肺炎克雷伯菌的遺傳標志物［27］。rmpA和magA是合成莢膜多糖的主要基因，在本研究分離株中均未被檢出，其主要編碼轉(zhuǎn)錄激活劑和形成細胞外黏性多糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，以促進莢膜多糖的合成和抵御血清中補體系統(tǒng)的殺菌及白細胞的吞噬作用［28］。

肺炎克雷伯菌的致病性除了與毒力基因相關(guān)，還與其血清型密切相關(guān)。目前，根據(jù)莢膜抗原結(jié)構(gòu)的不同可將肺炎克雷伯菌分為82種血清型［6］。其中，K1、K2、K5血清型菌株主要與人、動物的感染性疾病相關(guān)，K57、K54血清型菌株主要與群體侵入性肝膿腫綜合征相關(guān)［20］。本研究在流產(chǎn)狐貍胎兒分離獲得的6株菌中，檢測出K20、K54、K57血清型，K57為優(yōu)勢血清型。然而，張文舉等［11］對河北省狐貍源性肺炎克雷伯菌進行檢測，K20為優(yōu)勢血清型。從而，綜上表明，我國狐貍源克雷伯菌的血清學存在多樣性。

此外，隨著毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，各類細菌性疾病頻繁發(fā)生［2］。為降低各類細菌性疾病的發(fā)病率，增加收益，抗菌藥物被廣泛使用，導致多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，加大了臨床治療難度。本研究選取獸醫(yī)臨床常用的15種抗生素對分離菌株進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)分離菌株對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、青霉素類等抗生素存在多重耐藥；對多肽類抗生素有高度的敏感性；對氨基糖苷類、頭孢菌素類、喹諾酮類等抗菌藥物存在中度或高度敏感。其中，喹諾酮類的氧氟沙星和諾氟沙星在肉品中的殘留可造成人體呼吸道感染、基因突變、致癌，現(xiàn)已禁止用于食品動物。該結(jié)果與韓坤等［6］、李巧玲等［12］、楊延等［29］在毛皮動物體內(nèi)檢測的結(jié)果相似。這些數(shù)據(jù)表明毛皮動物養(yǎng)殖過程中可能還存在濫用大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、青霉素類等抗生素的情況，應加強養(yǎng)殖環(huán)節(jié)監(jiān)管和替抗產(chǎn)品研發(fā)及其推廣利用力度。在毛皮動物疾病治療過程中應減少大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、青霉素類等抗生素的使用，采取與中藥聯(lián)合用藥及開發(fā)相應疫苗，以降低耐藥性，保障毛皮動物的健康發(fā)展。

4 結(jié) 論

本研究從流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離獲得6株肺炎克雷伯菌，經(jīng)PCR鑒定其攜帶fimH、mrkA、ecp、ureA等多種毒力基因，K57為優(yōu)勢血清型，對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、青霉素類等抗生素存在多重耐藥性，且具有一定的致病性，可能是誘發(fā)狐貍胎兒流產(chǎn)、死亡的原因之一。在防控該病的過程中，可選用多黏菌素B等抗生素，對于大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、青霉素類等抗生素應合理使用。

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（編輯 白永平）