【摘 要】 目的：探討畬藥“十二時(shí)辰”醇提物外用對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的治療作用。方法：SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，高、低劑量十二時(shí)辰治療組和陽(yáng)性對(duì)照組。采用大鼠右后足趾皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑制作類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，致炎后采用十二時(shí)辰醇提液浸泡涂抹方式給藥，模型組及陽(yáng)性對(duì)照組分別給予生理鹽水或扶他林涂抹，持續(xù)給藥28 d。于給藥前和給藥后每7 d測(cè)定足趾容積，給藥結(jié)束，HE染色檢測(cè)各組大鼠的組織病理學(xué)改變，Elisa方法測(cè)定血清IL-1β及RF含量。結(jié)果：模型組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)的足趾腫脹度顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），血清IL-1β及RF含量顯著升高（P<0.01），足趾關(guān)節(jié)病理破壞明顯；高劑量十二時(shí)辰醇提液外用可顯著降低大鼠的足趾腫脹度（P<0.05），降低血清IL-1β及RF含量（P<0.01），改善關(guān)節(jié)病理?yè)p傷。結(jié)論：畬藥十二時(shí)辰醇提液外用可降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹，改善病理?yè)p傷，降低血清炎癥因子IL-1β及RF含量。

【關(guān)鍵詞】 重瓣鐵線蓮；十二時(shí)辰；外用；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

【中圖分類號(hào)】R29

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2024）17-0023-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.17.zgmzmjyyzz202417007

Research on the Anti-inflammatory Effect of External Application of the Ethanol Extract of

Clematis florida on Adjuvant-induced Arthritis in Rats

ZHOU Chunquan LEI Ting ZHAO Li ZHANG Jizhou JIANG Chang HAN Jing^* WANG Gong^*

Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350003， China

Abstract：Objective To explore the therapeutic effect of external application of the ethanol extract of She medicine “Shi Er Shi Chen” （Clematis florida） on rats with rheumatoid arthritis. Methods SD rats were randomly divided into the normal control group， the model group， the high-dose Clematis florida ethanol extract treatment group， the low-dose Clematis florida ethanol extract treatment group， and the positive control group. Rheumatoid arthritis model was established by intradermal injection of complete Freund’s adjuvant into the right hind paw of the rat. After inflammation induction， the rats were treated with ethanol extract of Clematis florida by soaking the paw into the extract. The model group and the positive control group were treated with saline or diclofenac sodium cream， respectively. The rats were continuously administered for 28 days. The hind foot volume was measured before and every 7 days after administration and the paw swelling rate was calculated. HE staining was used to detect the histopathological changes of the foot tissues at the end of the treatment， and Elisa method was used to measure the serum IL-1β and RF levels. Results The paw swelling degree of rats in the model group was significantly higher than that in the normal control group at each time point（P<0.05）， and the serum IL-1β and RF levels were significantly increased（P<0.01）. HE staining showed that the pathological damage of toe joint was obvious. External application of high-dose Clematis florida ethanol extract could significantly reduce the paw swelling degree of rats （P<0.05）， decrease the serum IL-1β and RF levels （P<0.01）， and improve the pathology damage of toe joint.Conclusion External application of Clematis florida ethanol extract can reduce the paw swelling and improve the pathological damage in adjuvant-induced arthritis rats， as well as decrease the serum levels of inflammatory factors IL-1β and RF.

Key words：Clematis florida; She Medicine “Shi Er Shi Chen”；External Application; Rheumatoid Arthritis

“十二時(shí)辰”為毛茛科植物重瓣鐵線蓮Clematis florida Thunb.Var.plena D.Don的干燥根，是福建省福安民間畬族習(xí)用藥。據(jù)《福安畬醫(yī)畬藥》^［1］記載，此藥性溫，味辛，具有通經(jīng)活絡(luò)、通關(guān)竅、祛風(fēng)除濕、活血止痛、理氣通便、利尿等功效，在閩東畬族地區(qū)被廣泛用于風(fēng)濕骨痛及跌打損傷等病癥，民間主要用法是將十二時(shí)辰泡酒，藥液涂抹于關(guān)節(jié)腫痛部位，取得較好的療效。本課題組前期對(duì)十二時(shí)辰醇提液皮膚用藥的急、慢性毒性進(jìn)行了觀察，未發(fā)現(xiàn)十二時(shí)辰醇提液的皮膚急、慢性毒性，表明十二時(shí)辰醇提液是較安全的外用藥^［2-3］。但迄今尚未見(jiàn)評(píng)價(jià)十二時(shí)辰提取物外用藥效的研究。本研究采用弗氏完全佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察十二時(shí)辰醇提液外用對(duì)關(guān)節(jié)腫脹及血清炎癥因子的作用，為十二時(shí)辰進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008，SPF級(jí)，體重（180±20）g，光照周期12 h/12 h下飼養(yǎng)，自由飲食。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.2 試藥 十二時(shí)辰生藥（批號(hào)：20221023）購(gòu)自福建福安。經(jīng)鑒定為毛茛科植物重瓣鐵線蓮的干燥根。將藥材粉碎，用70%乙醇加熱 90 ℃回流提取2次，70 ℃減壓濃縮，制備成生藥量2.7 g/mL的醇提液備用。

1.3 試劑 扶他林（GSK Consumer Healthcare S.A.；質(zhì)量注冊(cè)證號(hào)：20181225）；弗氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA，批號(hào)：P2036，購(gòu)自Beyotime公司），白介素-1β（IL-1β）及類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）購(gòu)自凱基生物科技有限公司。HE染色試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型制備及分組給藥 SD大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、十二時(shí)辰高劑量組、十二時(shí)辰低劑量組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠于左后足趾注射0.1 mL完全弗氏佐劑FCA致炎。十二時(shí)辰給藥組于致炎后第二天即分別給予高、低劑量醇提液（2.7 g/mL和1.35 g/mL）浸泡涂敷于患側(cè)足趾，陽(yáng)性對(duì)照組每只足趾外涂扶他林0.2 g，每日1次，持續(xù)給藥28 d。模型對(duì)照組及正常對(duì)照組給予生理鹽水外涂。

1.5 大鼠足趾腫脹度檢測(cè) 在給藥前與給藥后每7 d，采用足趾容積測(cè)量?jī)x檢測(cè)足爪容積，對(duì)比各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足體積變化情況，按下列公式計(jì)算各組大鼠足趾腫脹度：足趾腫脹度=（造模后足趾容積-造模前足趾容積）/造模前足趾容積

1.6 血清炎癥因子測(cè)定 最后一次檢測(cè)足趾容積結(jié)束，大鼠在戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)下處死，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血5 mL，5000 g離心10 min，分離血清，采用Elisa方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清IL-1β及RF含量。

1.7 HE染色 大鼠采血后處死，取左側(cè)踝關(guān)節(jié)標(biāo)本，置于4%多聚甲醛中固定，然后在EDTA脫鈣液中置于恒溫?fù)u床進(jìn)行脫鈣處理，進(jìn)行常規(guī)脫水石蠟包埋，切5 μm厚片。大鼠切片使用二甲苯進(jìn)行脫蠟，然后經(jīng)梯度乙醇脫水，在蘇木素染液中染色5 min，1%鹽酸乙醇分化處理30 s，0.2%氨水中反藍(lán)處理，用0.5%伊紅染色10 min，每步染色完成后用蒸餾水沖洗，最后經(jīng)梯度乙醇脫水處理，然后采用中性樹(shù)膠封片。在光鏡下拍照并分析圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，組間兩兩比較在符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布且方差不齊時(shí)采用Games-Howell法檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 十二時(shí)辰醇提物對(duì)大鼠足趾腫脹度的作用 與正常組大鼠相比，模型對(duì)照組大鼠足趾腫脹明顯，與正常組比較有顯著性差異（P<0.05，P<0.01）；造模后給予十二時(shí)辰外用涂敷給藥，高劑量組大鼠足趾腫脹度較模型組顯著降低，自給藥第21天開(kāi)始與模型組比較有顯著差異（P<0.05，P<0.01），治療效果與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。十二時(shí)辰低劑量給藥組足趾腫脹度無(wú)明顯改善。

2.2 十二時(shí)辰醇提物對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β及RF的作用 與正常對(duì)照組比，關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清IL-1β與RF含量顯著升高（P<0.01），十二時(shí)辰高劑量給藥組可顯著降低血清IL-1β與RF含量（P<0.01），低劑量給藥組可降低血清IL-1β含量，但對(duì)RF含量無(wú)作用。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，十二時(shí)辰高、低劑量組對(duì)IL-1β含量的降低效果不如陽(yáng)性對(duì)照藥（P<0.01）；十二時(shí)辰高劑量組對(duì)RF含量的作用與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05）。

2.3 十二時(shí)辰醇提物對(duì)大鼠足趾關(guān)節(jié)病理?yè)p傷的作用 正常對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)骨質(zhì)無(wú)損傷，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜組織增生嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)。十二時(shí)辰高劑量組滑膜組織增生較模型組有一定程度的改善，關(guān)節(jié)骨質(zhì)基本正常，與陽(yáng)性對(duì)照組病理?yè)p傷程度近似（圖1）。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoida rthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎病變?yōu)榛镜牟±砀淖儯S著病程的進(jìn)展，會(huì)侵襲關(guān)節(jié)軟骨，造成關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞^［4］。大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型能較好地模擬人的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀及病理表現(xiàn)，是用于評(píng)價(jià)和篩選抗炎免疫類藥物的經(jīng)典模型^［5］。本研究在模型大鼠足趾注射弗氏完全佐劑，可誘發(fā)關(guān)節(jié)腫脹，發(fā)生與RA類似的滑膜組織增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、關(guān)節(jié)軟骨破壞等病理表現(xiàn)，同時(shí)，血清炎癥因子IL-1β及類風(fēng)濕因子RF顯著升高。IL-1β是一種重要的血清炎癥因子，主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與局部組織的炎癥反應(yīng)，在炎癥、免疫激活、細(xì)胞分化與死亡的過(guò)程中，其表達(dá)水平會(huì)顯著提高。IL-1β是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，參與了關(guān)節(jié)損傷和骨質(zhì)破壞的過(guò)程。高水平IL-1β與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的疾病活動(dòng)性和嚴(yán)重程度相關(guān)，它被視為是評(píng)估類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情的一個(gè)有效指標(biāo)^［6］。RF是一種抗人或動(dòng)物IgG分子Fc片段抗原決定簇的抗體，是以變性IgG為靶抗原的自身抗體。RF在RA患者中的陽(yáng)性率較高，是RA的診斷指標(biāo)之一。RF的滴度與RA的活動(dòng)性和嚴(yán)重性相關(guān)，可用來(lái)監(jiān)測(cè)病情的變化^［7］。

十二時(shí)辰是毛茛科鐵線蓮屬植物，該屬許多植物因含有特殊的代謝物而具有一定的藥用價(jià)值^［8］。既往研究表明，十二時(shí)辰含有氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類、皂苷、生物堿、黃酮、有機(jī)酸、揮發(fā)油等化學(xué)成分^［9］，其含有的皂苷類成分被證實(shí)具有一定的抗腫瘤作用^［10］，從十二時(shí)辰原植物重瓣鐵線蓮中分離得到的三萜皂苷具有體內(nèi)外的抗炎藥效^［11］。十二時(shí)辰作為一種民族藥，在閩東畬族地區(qū)有著廣泛的應(yīng)用，民間主要用途是泡酒外用治療關(guān)節(jié)腫痛。本研究結(jié)果顯示，外用高劑量十二時(shí)辰醇提液可顯著減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的足趾腫脹，改善病理?yè)p傷，并且對(duì)血清IL-1β和RF的升高有顯著的抑制作用。這些結(jié)果表明，十二時(shí)辰外用具有較好的改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀的藥效。

本研究結(jié)果為十二時(shí)辰的臨床實(shí)際應(yīng)用提供了理論上的佐證，為十二時(shí)辰藥效和藥理機(jī)制的進(jìn)一步研究以及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2023-12-06 編輯：劉 斌）